Руководство по определению содержание

Утверждена

Распоряжением ОАО «РЖД»

от 2 октября 2020 г. N 2193/р

ИНСТРУКЦИЯ

ПО СОДЕРЖАНИЮ ИСКУССТВЕННЫХ СООРУЖЕНИЙ

1. Область применения

Инструкция по содержанию искусственных сооружений (далее — Инструкция) разработана для обеспечения и выполнения требований Правил технической эксплуатации железных дорог Российской Федерации, утвержденных приказом Минтранса России от 21 декабря 2010 г. N 286, технических регламентов о безопасности железнодорожного транспорта, высокоскоростного железнодорожного транспорта, зданий и сооружений.

Инструкция распространяется на содержание искусственных сооружений, расположенных на железнодорожных путях (независимо от их категории), на которых осуществляется движение поездов с наибольшими установленными скоростями: до 250 км/ч — для пассажирских поездов, до 120 км/ч — для рефрижераторных, до 90 км/ч — для грузовых. Дополнительные требования к устройству пути на мостах железнодорожных линий, на которых осуществляется движение пассажирских поездов со скоростями более 200 км/ч, устанавливаются отдельным нормативно-техническим документом.

Инструкция является обязательной для исполнения структурными подразделениями и филиалами ОАО «РЖД», на балансе или ответственности которых находятся искусственные сооружения, организаций, выполняющих работы (оказывающих услуги), связанные с эксплуатацией и ремонтом искусственных сооружений.

2. Нормативно-технические документы

Технический регламент Таможенного союза «О безопасности инфраструктуры железнодорожного транспорта» ТР ТС 003/2011, утвержденный решением Комиссии Таможенного союза от 15 июля 2011 г. N 710;

Федеральный закон от 30 декабря 2009 г. N 384-ФЗ «Технический регламент о безопасности зданий и сооружений»;

Правила технической эксплуатации железных дорог Российской Федерации, утвержденные приказом Минтранса России от 21 декабря 2010 г. N 286;

СП 79.13330.2012 «СНиП 3.06.07-86. Мосты и трубы. Правила обследований и испытаний. Актуализированная редакция»;

СП 63.13330.2010 «СНиП 52-01-2003 Бетонные и железобетонные конструкции. Основные положения»;

СП 48.13330.2011 «СНиП 12-01-2004 Организация строительства. Актуализированная редакция»;

СП 47.13330.2010 «СНиП 11-02-96 Инженерные изыскания для строительства. Основные положения»;

СП 45.13330.2010 «СНиП 3.02.01-87 Земляные сооружения, основания и фундаменты»;

СП 35.13330.2011 «СНиП 2.05.03-84* Мосты и трубы. Актуализированная редакция»;

СП 119.13330.2017 Железные дороги колеи 1520 мм. Актуализированная редакция СНиП 32-01-95;

СП 28.13330.2010 «СНиП 2.03.11-85 Защита строительных конструкций от коррозии»;

СП 20.13330.2011 «СНиП 2.01.07-85* Нагрузки и воздействия»;

СП 15.13330.2010 «СНиП II-22-81* Каменные и армокаменные конструкции»;

СП 122.13330.2011 «СНиП 32-04-97 Тоннели железнодорожные и автодорожные»;

СП 71.13330.2011 «СНиП 3.04.01-87 Изоляционные и отделочные покрытия»;

СП 70.13330.2011 «СНиП 3.03.01-87 Несущие и ограждающие конструкции»;

СП 126.13330.2011 «СНиП 3.01.03-84 Геодезические работы в строительстве»;

СП 131.13330.2012 «СНиП 23-01-99* Строительная климатология»;

СНиП 12-03-2001 Безопасность труда в строительстве;

СП 104.13330.2011 «СНиП 2.06.15-85 Инженерная защита территории от затопления и подтопления»;

СП 100.13330.2011 «СНиП 2.06.03-85 Мелиоративные системы и сооружения»;

СП 64.13330.2010 «СНиП II-25-80 Деревянные конструкции»;

СП 227.1326000.2014 Пересечения железнодорожных линий с линиями транспорта и инженерными сетями;

ГОСТ 31937-2011 Здания и сооружения. Правила обследования и мониторинга технического состояния;

ГОСТ 9238-2013 Габариты приближения строений и подвижного состава железных дорог колеи 1520 (1524) мм;

ГОСТ Р 52289-2019 Правила применения дорожных знаков, разметки, светофоров, дорожных ограждений и направляющих устройств;

ГОСТ 26804-2012 «Ограждение дорожные металлические барьерного типа. Технические условия»;

ГОСТ 28450-90 Брусья мостовые деревянные;

ГОСТ Р 52643-2006 Болты и гайки высокопрочные и шайбы для металлических конструкций.

При пользовании Инструкцией целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов в информационной системе общего пользования на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января каждого года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании Инструкцией следует руководствоваться замененным (измененным) документом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

В Инструкции применены следующие термины с соответствующими определениями:

Большой мост — мост полной длиной более 100 м.

Владелец железнодорожной инфраструктуры — юридическое лицо или индивидуальный предприниматель, имеющие инфраструктуру на праве собственности или ином праве и оказывающие услуги по ее использованию на основании договора.

Внеклассный мост — мост длиной более 300 м, мост с пролетом более 100 м, мост с разводными пролетами, мост под совмещенную езду (железнодорожного и автодорожного транспорта), мост на плотине гидротехнического сооружения.

Высота моста — расстояние от подошвы рельса до уровня меженных вод, до нижней точки лога или автопроезда.

Двухпутный мост — мост под два пути, состоящий из двухпутных пролетных строений или из однопутных пролетных строений, установленных на общих опорах (устоях), или однопутных пролетных строений не на общих опорах, но объединенных между собой и образующих единое мостовое полотно (двух- или многопутное).

Длина искусственного сооружения (полная длина) — длина между задними гранями устоев мостов; для косых мостов, тоннелей, труб и других сооружений — расстояние между наиболее отдаленными их частями.

Залом — скопления вымытых и приносимых рекой деревьев с корнями, пней и крупного кустарника, представляющие большую опасность для сохранности мостового перехода.

Затор — скопление льда при ледоходе как выше, так и ниже моста по течению реки, представляющее большую опасность для искусственного сооружения.

Искусственные сооружения — мосты, путепроводы, эстакады, виадуки, железнодорожные тоннели, галереи, трубы, селеспуски, поперечные лотки (исключая межшпальные), коллекторы, дюкеры, сифоны, фильтрующие насыпи, подпорные стены, акватоннели, акведуки, пешеходные мосты и тоннели владельца железнодорожной инфраструктуры.

Категория мостов по грузоподъемности — укрупненный показатель грузоподъемности железнодорожных мостов всех типов, который устанавливается в зависимости от допускаемой для обращения по мосту поездной нагрузки. Установлено пять категорий мостов по грузоподъемности, определение которых осуществляется согласно утвержденной нормативно-технической документации.

Малый мост — мост полной длиной до 25 м включительно.

Мостовое полотно — конструкция на пролетном строении, предназначенная для укладки и обслуживания рельсового пути на мостах. К мостовому полотну относятся: деревянные, металлические или композитные поперечины, безбалластные железобетонные или композитные плиты с элементами крепления, охранные приспособления, настил внутри колеи, балластное корыто, контруголки (контррельсы), а также боковые тротуары с настилом, площадки убежищ.

Мостовой переход — комплекс сооружений, включающий сам мост, участки подходов к нему, а также регуляционные и берегоукрепительные сооружения.

Напорный режим работы водопропускной трубы — режим, при котором труба работает полным сечением.

Несущая способность — максимальная нагрузка, которую может нести искусственное сооружение или его элементы, а также грунты основания без потери их функциональных качеств.

Отверстие моста — суммарное расстояние в свету между опорами или конусами насыпи в расчетном уровне высоких вод.

Отверстие трубы — расстояние между боковыми стенками прямоугольных труб или внутренний диаметр трубы.

Подходы к мостам и тоннелям — участки пути, примыкающие к мостам и тоннелям, длина которых принимается: для малых мостов — 50 м, средних мостов — 200 м, больших и внеклассных мостов — 500 м, тоннелей длиной до 100 м — 200 м, тоннелей длиной более 100 м — 500 м.

Предприятия — структурные подразделения владельца железнодорожной инфраструктуры, имеющие на балансе и (или) эксплуатирующие искусственные сооружения (дистанции инженерных сооружений, дистанции пути и др.), иные подразделения и сторонние организации, на которые функции по эксплуатации искусственных сооружений возложены, соответственно, нарядом-заказом или договором.

Развернутая длина искусственных сооружений:

для многопутных мостов, путепроводов, виадуков, тоннелей и галерей — произведение их полной длины на число путей;

для многоочковых водопропускных труб — произведение длины трубы на число отверстий;

для пешеходных мостов (тоннелей) — с учетом длин всех сходов.

Расчетный пролет — расстояние между осями опирания пролетного строения на смежные опоры или консоли консольных пролетных строений.

Рельсовый путь — рельсы со скреплениями, уравнительные приборы или уравнительные рельсы, рельсовые замки разводных пролетов.

Северные условия — условия районов со средней температурой воздуха наиболее холодной пятидневки ниже минус 40 °C с обеспеченностью 98%.

Слабая заклепка — заклепка, утратившая свои первоначальные технические свойства и приводящая к ослаблению заклепочного соединения. Признаки слабой заклепки — дрожание, глухой и дребезжащий звук при постукивании молотком, ржавые потеки из-под головок заклепки, трещины в окраске около головок.

Средний мост — мост полной длиной более 25 м до 100 м (включительно).

Стоечная опора — опора, выполненная из одной или нескольких железобетонных или бетонных стоек общей площадью поперечного сечения менее 1 м², опора из металлических элементов.

Судоходный пролет — пролет моста, предназначенный для пропуска судов, судовых и плотовых составов.

Угон (перекос) катков опорной части — смещение катков от проектного положения при эксплуатации опорной части, превышающее расчетное для данной температуры и нагрузки.

Уровень высоких вод — уровень воды, соответствующий расчетному расходу с заданной вероятностью превышения.

Уровень меженных вод — средняя многолетняя отметка уровня воды в реке в летнее время в период между паводками и половодьями.

Эксплуатационные обустройства — обустройства для проведения работ по контролю технического состояния сооружения и его ремонту, обеспечения их надежности и безопасности движения поездов, автотранспорта, судоходства, норм противопожарного состояния и охраны труда. К эксплуатационным обустройствам относятся: смотровые приспособления, убежища на мостах, камеры и ниши в тоннелях, лестницы по откосам конусов и насыпи, передвижные подмости для осмотра тоннелей, служебно-бытовые компрессорные станции с воздухопроводами, освещение, оповестительная сигнализация, телефонная связь, заземление металлических конструкций мостов на электрифицированных линиях и при наличии линий электропередачи, ограждение контактной сети на путепроводах и пешеходных мостах, устройства для прокладки коммуникаций, заградительные светофоры, светофоры прикрытия и предохранительные тупики либо сбрасывающие башмаки или стрелки на разводных мостах, габаритные ворота и дорожные знаки перед путепроводами через автомобильные дороги, ограждения опор этих путепроводов, указатели для снегоочистителей, судоходная сигнализация, противопожарные средства, автоматизированные системы управления технологическим процессом и тепловентиляционные системы тоннелей, дренажные и транспортные штольни, подпорные, улавливающие, регуляционные, берегозащитные, противоразмывные сооружения, обустройства запретных зон, охлаждающие конструкции сооружений, построенных на просадочных основаниях по I принципу эксплуатации оснований.

4. Общие положения

4.1. Искусственные сооружения являются частью железнодорожного пути инфраструктуры железнодорожного транспорта. Их техническое состояние должно обеспечивать бесперебойный и безопасный пропуск поездов с установленными скоростями движения, безопасный пропуск пешеходов и автотранспорта.

4.2. Ответственность за содержание и техническое состояние искусственных сооружений несут руководители и работники предприятия, непосредственно обслуживающие эти сооружения.

4.3. Техническое состояние искусственных сооружений является основой для планирования периодичности контроля их состояния, очередности содержания и ремонта. Порядок определения технического состояния искусственных сооружений определяется утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В к Инструкции, п. 7).

4.4. Система содержания искусственных сооружений предусматривает текущее содержание (контроль технического состояния и работы по текущему содержанию) и капитальные виды ремонта. Основным принципом содержания является предупреждение появления или развития неисправностей и повреждений в сооружениях, для поддержания их удовлетворительного технического состояния.

4.5. Содержание искусственных сооружений основывается на следующих его составляющих, нормативные критерии которых определяются владельцем железнодорожной инфраструктуры:

контингент квалифицированных работников, обслуживающих искусственные сооружения;

оснащенность подразделений инструментом, оборудованием и техникой;

материалы на содержание искусственных сооружений и топливо.

4.6. Формирование подразделений, их техническое и материальное оснащение осуществляется исходя из развернутой длины сооружений с учетом требований соответствующих нормативно-технических документов (приложение В к Инструкции, п. 12, 19, 20).

4.7. При повреждении искусственных сооружений, возникновении неисправностей, снижающих их несущую способность, необходимо принимать меры, обеспечивающие безопасность движения поездов, такие как:

организация режимных наблюдений;

устранение повреждений или неисправностей;

временное усиление поврежденных элементов (постановка накладок, подведение дополнительных опор, установка разгрузочных пакетов и др.);

введение ограничений для движения поездов, пропуска пешеходов или автотранспорта, а при необходимости — закрытие сооружения для пропуска нагрузок.

4.8. Возможность и условия пропуска поездов, пешеходов и автотранспорта при повреждении искусственных сооружений устанавливаются руководителем подразделения, на балансе которого находится сооружение. В случае повреждений, требующих проведения специальных расчетов и испытаний сооружений, для определения условий пропуска нагрузок, включая скорость движения поездов, привлекаются мостоиспытательные станции, обследовательские водолазная и тоннельная станции владельца железнодорожной инфраструктуры, специализированные научно-исследовательские или проектные организации, имеющие право на проведение таких работ в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации. Перечень основных повреждений с указанием максимальной скорости движения поездов до проведения таких работ либо устранения неисправности приведен в приложении А к Инструкции.

4.9. Информация о сооружениях, их конструкции и состоянии должна храниться в электронной базе данных и на бумажных носителях (карточки и книги искусственных сооружений).

На все искусственные сооружения должны быть заведены карточки установленной формы первичного учета, содержащие основные технические характеристики и данные о сооружениях, при изменении которых в карточки должны вноситься соответствующие исправления. Информация об искусственных сооружениях, включая категорию мостов по грузоподъемности, категорию водопропускной способности искусственных сооружений через постоянные и временные водотоки, степень негабаритности (при ее наличии) должна быть указана в Книгах искусственных сооружений и карточках (приложение Б). Основные результаты осмотров, а также классы металлических и железобетонных пролетных строений, результаты расчета прочности других конструкций, при проведении соответствующих расчетов, должны заноситься в Книги искусственных сооружений. Перечень форм первичного учета приведен в приложении Б, их форма утверждается нормативно-техническим документом, указанным в приложении В к Инструкции (п. 5). Информация, содержащаяся в книгах искусственных сооружений и карточках, вносится в электронную базу автоматизированной системы управления (Единая корпоративная автоматизированная система управлением инфраструктурой). Осмотры вносятся в Книги осмотра искусственных сооружений установленной формы. Карточки и Книги должны быть подписаны руководителем предприятия и храниться у мостового (тоннельного) мастера до списания искусственного сооружения.

На каждый большой, средний мост или тоннель длиной более 100 м должна вестись отдельная Книга, на остальные искусственные сооружения — одна или несколько Книг по направлениям или участкам предприятий. Книги, исполнительные и другие чертежи, пояснительные записки, расчеты грузоподъемности и водопропускной способности, отчеты об обследованиях и иные технические документы вместе с описью имеющихся материалов хранятся в местах, определяемых приказом руководителя предприятия. Если часть документации на конкретный объект хранится в архиве, то в описи имеющихся материалов должен быть указан адрес архива.

Для единообразия записей во всей технической документации счет опор, пролетов, узлов ферм, колец тоннелей и т.п. необходимо вести по ходу километров, а колец труб, опор, пролетных строений пешеходных мостов и автодорожных путепроводов, как и наименование сторон искусственных сооружений — слева направо по ходу километров. При этом счет опор и узлов ферм начинается с нуля, а пролетных строений, колец тоннелей и звеньев труб — с единицы.

Неисправности искусственных сооружений по результатам всех видов осмотров заносятся в единую корпоративную автоматизированную систему управления инфраструктурой. В электронной базе данных в цифровом формате должны быть представлены схемы и фотографии сооружений, а также неисправности и дефекты, приводящие сооружение в неудовлетворительное техническое состояние, выявленные при текущих и периодических осмотрах с их фотографиями.

4.10. Все железнодорожные мосты должны быть классифицированы по грузоподъемности, мосты через водотоки и водопропускные трубы — по водопропускной способности.

Грузоподъемность сооружений и водопропускная способность определяется проектом.

Перерасчет грузоподъемности осуществляется в указанных в настоящей инструкции случаях (сверхнормативная толщина балласта или эксцентриситета пути, выявление неисправностей снижающих грузоподъемность, рассмотрение возможности укладки железобетонных плит безмостового полотна на мостах с неудовлетворительным техническим состоянием, определение условий пропуска подвижного состава с повышенными осевыми и погонными нагрузками). Проверка малых искусственных сооружений по водопропускной способности выполняется при их работе в напорном режиме, а также при сужении сечения в ходе ремонтных или противоаварийных работ. Перерасчет грузоподъемности мостов и водопропускной способности малых искусственных сооружений выполняются мостоиспытательными станциями, научными и проектными организациями, а также специализированными организациями, имеющими право на проведение таких работ в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации, на основании имеющейся технической документации и результатов натурного обследования сооружений. Результаты расчетов прикладываются к Книгам искусственных сооружений, в которых делается соответствующая запись об их наличии.

Мостоиспытательными станциями формируются карты направлений по грузоподъемности с указанием наибольшего класса обращающегося подвижного состава и выделением мостов, имеющих класс по грузоподъемности равный или близкий к классу обращающейся нагрузки.

Мосты и тоннели должны быть проверены по габаритности. Проверку габаритности выполняют габаритообследовательские станции, а также диагностические комплексы.

5. Порядок контроля технического состояния

искусственных сооружений

5.1. За всеми искусственными сооружениями на протяжении всего периода их эксплуатации должен проводиться систематический контроль технического состояния, включающий:

осмотры, осуществляемые работниками, назначенными к обходу;

текущие осмотры;

периодические осмотры;

обследования, испытания и специальные наблюдения.

5.2. Осмотру искусственных сооружений назначенными к обходу квалифицированными ремонтниками искусственных сооружений или обходчиками железнодорожных путей и искусственных сооружений подлежат внеклассные, большие мосты и тоннели, а также подходы к ним. Порядок и периодичность проведения таких осмотров регламентируется местной инструкцией, утверждаемой предприятием. Форма и основные требования к местной инструкции утверждаются нормативно-техническим документом.

5.3. Обходчики (ремонтники искусственных сооружений, направляемые в обход) предприятия эксплуатирующего искусственные сооружения при проведении обхода обязаны:

следить за состоянием всех элементов мостового полотна (мостовых брусьев, металлических поперечин, железобетонных плит безбалластного мостового полотна, охранных приспособлений;

проверять и подтягивать лапчатые болты, шпильки плит безбалластного мостового полотна, крепление противоугонных (охранных) уголков и брусьев;

очищать от грязи, снега и льда элементы пролетных строений в уровне проезда, не допускать застоя воды в коробах поясов, на подферменных площадках и в других местах;

очищать от снега и льда лестницы и сходы по откосам конусов и насыпей у мостов и труб перед проходом весенних вод, а при необходимости и в других случаях;

содержать в чистоте камеры и ниши в тоннелях, производить их побелку, скалывать и убирать наледи, образующиеся на пути, следить за состоянием обделки, проверять состояние выходов из штолен и достаточность отепления их в зимнее время;

очищать от грязи, снега и льда элементы уравнительных приборов и уравнительных рельсов, рельсовых замков разводных мостов и других;

следить за исправным состоянием смотровых приспособлений, противопожарного инвентаря, наполнять бочки водой и ящики песком;

следить за проходом весенних вод и ледохода, вести наблюдения за уровнем воды, за состоянием укреплений конусов и откосов насыпей.

5.4. Обходчики (монтеры пути, назначаемые в обход) предприятия обслуживающего верхнее строение пути при проведении обхода обязаны:

следить за состоянием путевых рельсов, шпал, скреплений, балластного слоя, контруголков (контррельсов) и скреплений, уравнительных приборов и уравнительных рельсов, рельсовых замков разводных мостов; проверять и подтягивать их крепление;

на пути в пределах мостов (тоннелей) и на прикрепленных участках подходов закреплять и смазывать болты, добивать костыли, подкреплять противоугоны, очищать рельсы и скрепления от грязи, содержать в чистоте поверхность балластного слоя, обочины земляного полотна и водоотводные устройства, своевременно выпалывать траву, не допускать застоя воды на пути, обочинах и в кюветах;

следить за проходом весенних вод и ледохода, вести наблюдения за уровнем воды, за состоянием укреплений конусов и откосов насыпей.

5.5. По результатам обхода ведется журнал обходчика железнодорожных путей и искусственных сооружений (приложение Б), в котором, помимо записей о приеме и сдаче дежурств, отражаются материалы осмотров и проверок верхнего строения пути и искусственных сооружений, а также указываются работы, выполненные во время дежурства.

5.6. Текущему осмотру подлежат все части искусственных сооружений: рельсовый путь, мостовое полотно, пролетные строения, опорные части и опоры; порталы и обделка тоннелей; оголовки и звенья труб; конусы насыпи, русла, включая их укрепления, лотки, регуляционные и берегоукрепительные сооружения. В рамках текущего осмотра проводятся также необходимые наблюдения за режимом водотоков и за образованием наледей.

5.7. Периодичность текущих осмотров зависит от технического состояния сооружения, а именно:

при удовлетворительном техническом состоянии искусственные сооружения осматриваются не реже одного раза в три месяца, которые допускается совмещать с периодическими осмотрами. Дополнительным осмотрам подлежат деревянные мосты и трубы, а также пешеходные мосты (тоннели) — не реже одного раза в месяц;

при неудовлетворительном техническом состоянии сооружений до устранения неисправностей, а также для сооружений, находящихся в ремонте, приказом по предприятию устанавливаются более частые сроки осмотров (не реже 1 раза в месяц) или непрерывное наблюдение согласно рекомендациям мостоиспытательной станции;

металлические пролетные строения с классом по грузоподъемности ниже или равным классу обращающейся нагрузки, а также рассчитанные по нормам 1931 года и более ранним, осматриваются не реже одного раза в месяц;

пролетные строения, усиленные сваркой, а также пролетные строения мостов, находящихся в северных условиях и не отвечающих современным требованиям к конструкциям северного исполнения, необходимо осматривать в зимнее время не реже одного раза в месяц. При этом отдельные элементы пролетных строений, рассчитанные по нормам проектирования до 1931 года включительно, подверженные наибольшим динамическим воздействиям (продольные и поперечные балки проезжей части, узлы прикрепления подвесок и другие) при температуре наружного воздуха ниже минус 30 °C в зависимости от состояния пролетных строений, опыта их эксплуатации и рекомендаций мостоиспытательной станции осматриваются в более частые сроки. Целесообразность введения ограничения скорости движения поездов по таким сооружениям определяет мостоиспытательная станция.

В период ливней и пропуска паводковых вод опасные по размыву сооружения осматриваются в соответствии с разрабатываемыми на такой период мероприятиями.

5.8. Текущие осмотры искусственных сооружений и пути на них осуществляют:

начальники производственных эксплуатационных участков, мостовые (тоннельные) мастера, контролеры состояния железнодорожного пути, бригадиры по искусственным сооружениям обслуживающего искусственные сооружения в порядке, установленном в структурном подразделении на основании требований данной инструкции с записью результатов в Книги записи результатов осмотра искусственных сооружений (приложение Б);

начальники участков, дорожные мастера, бригадиры пути обслуживающего верхнее строение пути и контролеры состояния железнодорожного пути в порядке, установленном для осмотра пути с записью результатов в Книги записи результатов проверки пути, сооружений, путевых устройств и земляного полотна (приложение Б).

5.9. На участках, где наблюдаются сильные ливни, а также после землетрясений силой 4 балла и более, проводятся дополнительные сплошные осмотры искусственных сооружений. Порядок таких осмотров определяется начальником предприятия.

5.10. Мостовой (тоннельный) мастер или под его руководством бригадир по искусственным сооружениям должны проводить текущий осмотр искусственных сооружений в пределах закрепленного за ними участка, в сроки, установленные начальником предприятия. При наличии мостовых (тоннельных) мастеров и контролеров состояния железнодорожного пути, специализирующихся на оценке технического состояния инженерных сооружений, данные функции, включая внесение выявленной информации в техническую документацию и единую корпоративную автоматизированную систему управления инфраструктурой, поручаются указанным специалистам приказом по структурному подразделению.

5.11. Книга записи результатов осмотра искусственных сооружений мостового (тоннельного), дорожного мастера ежемесячно проверяется начальником участка и не реже двух раз в год начальником предприятия или его заместителем. Книга записи результатов осмотра искусственных сооружений (приложение Б) заместителя начальника предприятия, начальника участка проверяется ежеквартально начальником предприятия и заместителем начальника предприятия соответственно.

5.12. Периодические осмотры всех искусственных сооружений проводятся начальником предприятия, заместителями начальника, главным инженером и начальником производственного эксплуатационного участка с участием мостового (тоннельного) мастера, контролера состояния железнодорожного пути (при его наличии) в сроки, устанавливаемые дирекцией инфраструктуры (дирекцией пригородных обустройств, дирекцией железнодорожных вокзалов согласно балансовой принадлежности искусственных сооружений), но не реже двух раз в год (весной после прохождения паводка и осенью).

5.13. Периодические осмотры искусственных сооружений должны проводиться с оценкой технического состояния следующих элементов:

верхнего строения пути на сооружении и подходах к нему с проведением при необходимости инструментальных измерений (проводится подразделением обслуживающим верхнее строение пути с привлечением мостового (тоннельного) мастера);

охранных приспособлений на мостах;

скреплений и деталей конструкций мостового полотна;

элементов пролетных строений и подферменных площадок;

опорных частей и защитных футляров;

отверстий труб, лотков, водобойных колодцев, русл;

готовности сооружений к зиме (закрытие отверстий труб и малых мостов щитами, ремонт утеплений лотков в тоннелях и др.);

противоналедных устройств;

охлаждающих конструкций сооружений, построенных на просадочных основаниях по I принципу эксплуатации сооружений на многолетнемерзлых грунтах;

искусственных сооружений после пропуска паводка и ледохода;

окраски металлических конструкций;

металла, заклепок, болтов и динамики появления и развития трещин в металлических конструкциях мостов;

каменной кладки, тела опор, сливных призм и конусов мостов;

подпорных и улавливающих стен;

регуляционных, берегозащитных, противоразмывных сооружений (волноотбойных стен, бун, волноломов, и траверс и т.п.);

противопожарного инвентаря;

водоотводных обустройств на поверхности и внутри тоннелей;

смотровых приспособлений и эксплуатационных обустройств;

прохожей части и конструкций лестничных сходов пешеходных мостов и тоннелей;

устройств судоходной сигнализации на мостах;

линий освещения и технологических сетей;

постовых будок, специальных обустройств и других объектов на охраняемых искусственных сооружениях, переходных мостиков, настилов, лестниц по откосам насыпи, территории и ограждения запретных зон.

5.14. Результаты периодических осмотров вносятся в Книги записи результатов осмотров искусственных сооружений, а также оформляются актами с перечислением выявленных неисправностей и их количественных значений в объеме необходимом для последующего формирования рабочего задания.

5.15. Неисправности и дефекты, приводящие сооружение в неудовлетворительное техническое состояние, выявленные при текущих и периодических осмотрах, заносятся в Книги искусственных сооружений.

5.16. При выявлении неисправностей, угрожающих безопасности движения, работник, производящий осмотр обязан оградить опасное место установленным порядком, немедленно доложить о случившемся дежурному по станции (поездному диспетчеру) и начальнику подразделения, с принятием мер к устранению неисправностей и обеспечению безопасности движения поездов.

5.17. Руководители дирекции инфраструктуры с участием руководителей причастных предприятий и представителя мостоиспытательной станции должны проводить периодические осмотры искусственных сооружений в следующем порядке:

внеклассные и большие мосты по перечню, утвержденному Центральной дирекцией инфраструктуры, не реже одного раза в год осматривают комиссии, возглавляемые начальником дирекции инфраструктуры или его заместителями. Копии актов осмотров в двухнедельный срок направляются в Центральную дирекцию инфраструктуры;

большие мосты длиной более 200 м, тоннели, мосты, имеющие опасные дефекты или находящиеся под особым наблюдением, пешеходные мосты, по перечню, утвержденному начальником дирекции инфраструктуры не реже одного раза в год, осматривает начальник службы пути или его заместитель по инженерным сооружениям или главный инженер службы пути с участием руководителя предприятия;

большие мосты и тоннели, не вошедшие в указанные перечни, а также средние мосты с металлическими пролетными строениями, рассчитанными по нормам проектирования 1931 года и более ранним не реже одного раза в год осматривают заместитель начальника дирекции инфраструктуры по региону с руководителями предприятий или их заместителями.

5.18. При проведении периодических осмотров руководителями дирекции инфраструктуры наряду с оценкой состояния сооружений, выявлением дефектов и разработкой мер по их устранению, проверяются вопросы организации контроля технического состояния и содержания, ведение технической документации, своевременность устранения недостатков, выявленных в результате предыдущих осмотров, определяются условия дальнейшей эксплуатации сооружения. Результаты осмотров оформляются актами, которые прикладываются к Книгам искусственных сооружений. В книгах делается запись о проведенных осмотрах с указанием даты и лиц, производивших осмотр. Контроль за устранением неисправностей, дефектов и недостатков в организации содержания, выявленных при осмотрах сооружений, осуществляется руководителями, проводившими осмотр.

5.19. Результаты периодических весенних и осенних осмотров искусственных сооружений, меры по улучшению их содержания и состояния, с отчетами руководителей подразделений рассматриваются в месячный срок после завершения осмотра руководством дирекции инфраструктуры (дирекции пригородных обустройств, дирекции железнодорожных вокзалов согласно балансовой принадлежности искусственных сооружений). Протоколом рассмотрения результатов периодических весенних и осенних осмотров искусственных сооружений утверждаются представленные мероприятия, либо указываются корректирующие меры.

5.20. Все искусственные сооружения должны быть обследованы мостоиспытательными станциями, при участии мостового (тоннельного) мастера по утвержденному плану. При этом большие и средние мосты со сквозными металлическими пролетными строениями, спроектированными по нормам 1931 года и более ранним, металлические пролетные строения с неудовлетворительной оценкой технического состояния, а также опытные и новые конструкции подвергаются обследованию не реже одного раза в год, а в необходимых случаях — испытаниям. Остальные большие и средние мосты подвергаются обследованию, а в необходимых случаях — испытаниям, не реже одного раза в пять лет. Все остальные сооружения должны обследоваться не реже одного раза в 10 лет преимущественно в порядке сплошного обследования, осуществляемого по участкам или по направлению. При этом для отдельных сооружений находящихся в неудовлетворительном техническом состоянии с учетом результатов предыдущих осмотров и обследований устанавливаются более частые сроки осмотра. При несоблюдении периодичности обследований мостов, ограничивается скорость движения поездов до 60 км/ч.

Габаритность тоннелей необходимо проверять через каждые пять лет и после выполнения работ по подбивке и рихтовке пути.

Мостоиспытательные станции должны контролировать устранение неисправностей, выявленных ими при осмотрах и обследованиях.

5.21. Сетевые мостоиспытательные, водолазная и тоннельные станции проводят плановые обследования сооружений по перечню, утвержденному Центральной дирекцией инфраструктуры. Обследование сооружений, не вошедших в утвержденный перечень, допускается с корректировкой годового плана работ.

Обследование подводной части опор больших и средних мостов производится водолазной станцией не реже одного раза в 10 лет. После ремонта подводной части опор больших и средних мостов проводится внеплановое обследование с соответствующим пересмотром периодичности.

К обследованиям могут привлекаться специализированные и научные организации, имеющие право на выполнение данных работ.

Контроль устранения дефектов, приводящих сооружения в неудовлетворительное состояние, проводится с выездом на место или рассмотрением фотоотчета о выполненных работах.

5.22. При обследованиях искусственных сооружений производится детальный осмотр всех элементов сооружений, а при необходимости — инструментальные измерения, оценивается техническое состояние, текущее содержание и качество ремонта сооружения, правильность ведения технической документации, дается анализ изменений состояния, устанавливаются неисправности и недостатки, определяются необходимые меры по обеспечению безопасности движения поездов, условия дальнейшей эксплуатации сооружения, включая скорость движения поездов, разрабатываются противоаварийные технические решения.

5.23. Испытания сооружений должны производиться:

при приемке в эксплуатацию вновь построенных больших и внеклассных мостов, новых и опытных конструкций;

при возникновении в процессе эксплуатации дефектов в конструкции (в том числе после аварий), влияние которых трудно учесть расчетом;

при усилении сооружений с целью выяснения эффективности выполненных работ в порядке проверки расчетных предпосылок;

в специальных случаях с целью накопления материала для уточнения норм проектирования и расчета сооружений.

В остальных случаях производится обкатка сооружений.

О результатах испытаний и обкатки сооружений составляется подробный отчет или заключение. Кроме того, на месте должны быть даны письменные указания о проведении неотложных мероприятий, при их наличии.

5.24. Руководители мостоиспытательных, тоннельных, водолазной и мерзлотной станций, имеют право на месте принимать решения об ограничениях скорости движения поездов и величине пропускаемой нагрузки по искусственным сооружениям. Выполнение таких решений должно ими лично контролироваться.

5.25. Требования работников мостоиспытательных, тоннельных, водолазной и мерзлотной станций, по вопросам организации контроля технического состояния и содержания искусственных сооружений, являются обязательными для руководителей предприятий. Замечания, не требующие безотлагательного устранения, устраняются в плановом порядке.

5.26. За сооружениями находящимися в неудовлетворительном техническом состоянии согласно предписанию мостоиспытательной станции и определенным ею порядком, а также за опытными и новыми типами конструкций лицом, назначенным руководителем предприятия, необходимо вести режимные наблюдения, целью которых являются:

предупреждение расстройств конструкций, угрожающих безопасности движения поездов, пропуску пешеходов и автотранспорта;

уточнение причин появления неисправностей и динамики их развития;

выявление конструктивных, строительных и эксплуатационных недостатков опытных и новых конструкций для своевременного их устранения и недопущения при дальнейшем изготовлении такого типа конструкций.

5.27. Наблюдения за опытными типами конструкций производятся по специальным программам, разрабатываемым сетевыми мостоиспытательными, тоннельной, водолазной станциями, научно-исследовательскими организациями и специализированными организациями, имеющими право на его проведение.

5.28. Диагностика и мониторинг искусственных сооружений осуществляется в соответствии с порядком, установленным утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В, п. 6).

6. Организация текущего содержания искусственных сооружений

6.1. Текущее содержание искусственных сооружений включает комплекс работ по предупреждению появления неисправностей в сооружениях и устранение уже появившихся повреждений на ранней стадии их развития. Оценка текущего содержания сооружений определяется коэффициентом содержания сооружений, определенным в соответствии с утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В, п. 7).

6.2. Система содержания искусственных сооружений включает:

порядок и графики осмотров искусственных сооружений;

планирование и учет текущего содержания искусственных сооружений;

планирование и учет капитальных видов ремонта;

план оснащения и обновления транспортных средств, машин и механизмов;

план поставки материалов и топлива;

расчет и наличие контингента мостовых бригад и фонда заработной платы.

6.3. Оценка работы предприятия и его подразделений осуществляется по выполнению плана балльности по состоянию и содержанию искусственных сооружений, с учетом проведения работ смежными предприятиями, рассчитываемой в соответствии с утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В, п. 7).

6.4. К основным работам по текущему содержанию искусственных сооружений относятся:

постановка накладок на элементах металлических пролетных строений;

замена отдельных слабых заклепок и дефектных болтов высокопрочными болтами;

засверливание и перекрытие трещин накладками в металлических конструкциях мостов;

окраска отдельных мест пролетных строений;

выправка перекоса и угона катков опорных частей;

ремонт футляров опорных частей;

очистка, смазка и натирка опорных частей;

ремонт мостовых брусьев, замена дефектных элементов мостового полотна, защита мостовых брусьев от загнивания и механического износа;

одиночная смена мостовых и мауэрлатных брусьев;

смена охранных брусьев (охранных уголков);

смена мостового и пешеходного настила;

наращивание бортов пролетных строений на высоту до 20 см;

замена лапчатых болтов;

подтягивание и смазка шпилек, лапчатых и прочих болтов;

исправление резьбы на болтах;

ремонт металлических перил;

ремонт сливов подферменных площадок;

содержание и ремонт противопожарного инвентаря;

содержание лестниц на откосах конусов;

ремонт отдельных мест каменного мощения конусов;

заделка трещин в кладке опор;

ремонт мест поврежденной штукатурки опор;

расчистка и расшивка швов кладки опор и облицовки;

заделка сколов, раковин, пустот и восстановление защитного слоя железобетонных и бетонных поверхностей сооружений;

замена сгнивших или сломанных элементов деревянных мостов и деревянных водопропускных труб;

противогнилостные мероприятия на деревянных сооружениях;

устранение неплотностей в деревянных конструкциях, подтяжка и смазка болтов, стеска поверхностной гнили и заделка трещин с антисептированием древесины;

ремонт поверхности железобетонных и бетонных труб;

заделка швов между секциями водопропускных труб;

расчистка и расшивка швов в каменных и бетонных трубах;

заделка вывалов и перекладка отдельных камней облицовки тоннелей и каменных труб;

заделка выбоин и ремонт асфальтового покрытия прохожей и проезжей части;

ремонт ступеней сходов;

очистка от загрязнений пролетных строений и подферменных площадок;

постановка на место отдельных выпавших и сместившихся камней и блоков сооружений;

содержание смотровых приспособлений и эксплуатационных обустройств;

содержание в исправности устройств судоходной сигнализации на мостах;

содержание освещения сооружений;

содержание на охраняемых искусственных сооружениях постовых будок, оборонительных сооружений, переходных мостиков, настилов, лестниц по откосам насыпи, территории и ограждения запретных зон;

очистка и содержание водоотводных приспособлений на поверхности и внутри тоннелей, сколка наледей в тоннелях;

исправление местных повреждений конусов, откосов насыпи и регуляционных сооружений, водоотводов и их укреплений;

подготовка сооружений к зиме — закрытие отверстий труб и малых мостов щитами, их изготовление и ремонт, ремонт утеплений лотков в тоннелях;

содержание противоналедных устройств и охлаждающих установок;

подготовка к пропуску весенних вод — очистка русл от снега, околка льда вокруг опор;

пропуск паводка и ледохода;

очистка элементов мостового полотна от загрязнений.

При необходимом оснащении оборудованием и наличии материалов текущим содержанием могут быть выполнены отдельные виды капитальных работ с восстановлением эксплуатационных характеристик без их улучшения.

6.5. Работы по текущему содержанию верхнего строения пути на искусственных сооружениях и подходах к ним, очистка и смазка уравнительных приборов, уравнительных стыков и рельсовых замков разводных пролетов, регулировка зазоров в стыках и замена сезонных уравнительных рельсов, очистка русел малых мостов и труб, примыкающих к ним продольных водоотводов (кюветов, канав, водоотводных лотков, водобойных колодцев) от насосов и зарослей выполняются бригадами предприятий, обеспечивающими содержание и эксплуатацию пути.

6.6. Работы, перечисленные в пункте 6.4 за исключением указанных в пункте 6.5 путевых работ, выполняются бригадами предприятий по содержанию искусственных сооружений. Ими же обслуживаются безбалластное мостовое полотно на плитах, мостовых брусьях, вотеренах, охранные приспособления с соответствующими креплениями к балкам пролетного строения.

Регламент взаимодействия причастных подразделений утверждается Центральной дирекцией инфраструктуры.

6.7. Планирование работ по текущему содержанию искусственных сооружений организуется в соответствии порядком, утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В, п. 13). Предусматривается годовое, сезонное, месячное, недельное и оперативное (суточное) планирование работ.

Формирование годового плана производится на основании аналитических данных по результатам весеннего осмотра на будущий год. Объемы работ в соответствии с технологически обоснованной потребностью формируются в Единой корпоративной автоматизированной системе управления инфраструктурой.

При формировании годового плана необходимо также учитывать:

выполняемые в текущем году работы по текущему содержанию искусственных сооружений;

запланированные капитальные виды ремонта;

приоритетность работ на 1 — 3 классах пути;

затраты по перевозочным видам деятельности за текущий год;

наличие барьерных мест, длительных и временно действующих предупреждений, влияющих на график движения поездов;

результаты обследования объектов инфраструктуры обследовательскими станциями (мостоиспытательными, тоннельной, водолазной и мерзлотной станциями, инженерно-геологическими базами и т.д.);

восстановление утраченной несущей способности, в том числе с обеспечением соответствия грузонапряженности сооружения перспективной нагрузке;

устранение неисправностей более сложной (высокой) категории;

обеспечение водопропускной способности;

повышение балловой оценки содержания сооружений;

обеспечение транспортной безопасности.

Годовой план формируется с учетом бюджета производства и утверждается в дирекции инфраструктуры (дирекции пригородных обустройств, дирекции железнодорожных вокзалов согласно балансовой принадлежности искусственных сооружений), с учетом чего подразделениями формируется бюджет затрат и нормативно-целевой бюджет затрат по производственным операциям. Утвержденный годовой план является основой для работы подразделений.

Формирование сезонного плана производится на основании годового плана с учетом аналитических данных по результатам весеннего и осеннего осмотра.

При формировании сезонного плана необходимо дополнительно учитывать:

вновь выявленные неисправности несущие риск возникновения барьерных мест, длительные и временно действующие предупреждения, влияющие на график движения поездов;

сезонность проведения ремонтных работ;

эксплуатационные затраты за текущий год.

7. Капитальные виды ремонта искусственных сооружений

7.1. Капитальным видом ремонта сооружений является комплекс работ, направленных на восстановление их технического состояния, обеспечение надежности и способности пропускать поездные нагрузки с установленными скоростями и обеспечением безопасности движения поездов.

7.2. К капитальным видам ремонта относятся следующие работы:

замена различных типов мостового полотна на плиты БМП или сплошная замена мостового полотна;

замена рельсовых замков, уравнительных приборов и стыков;

замена пролетных строений с опорными частями, в том числе с заменой подферменников;

ремонт или замена подферменников и сливной площадки под устанавливаемое пролетное строение;

ремонт пролетных строений или замена поврежденных металлических элементов с постановкой их на высокопрочные болты;

замена опорных частей и их отдельных элементов (балансиров, катков);

бетонирование (омоноличивание) металлических стоек опор;

демонтаж пролетных строений;

наращивание бортов пролетных строений;

замена гидроизоляции балластных корыт;

частичная перекладка каменных и кирпичных опор;

инъектирование, торкретирование, устройство «рубашек» и «поясов» для восстановления несущей способности железобетонных, бетонных и бутобетонных конструкций;

ремонт подводной части опор;

наращивание стенок устоев без их удлинения;

восстановление или замена подферменных камней, шкафных стенок и кордонных камней;

установка бездонных коробов за устоями моста и других конструкций переходной жесткости;

сплошной ремонт прохожей части;

замена железобетонных и металлических ступеней сходов;

замена перил и ограждений, ремонт металлических и железобетонных конструкций пешеходных мостов;

ремонт и замена инженерных коммуникаций на пешеходных мостах и тоннелях без изменения первоначального проектного решения;

замена пролетных строений пешеходных мостов без изменения ширины прохода и материала;

ремонт железобетонных и бетонных поверхностей обделки тоннелей, включая устройство гидроизоляции и покрытий из различных материалов;

ремонт или замена водоотводных, дренажных и противоналедных сооружений (конструкций), вентиляционных каналов железнодорожных тоннелей;

ремонт оголовков и лотков водопропускных труб;

исправление просадок отдельных звеньев водопропускных труб;

санация водопропускных труб полимерными материалами и специальными конструкциями;

замена стен и свода водоотводных труб по существующей оси и на существующем фундаменте без изменения количества отверстий, материала и водопропускной способности;

перекладка поперечных водопропускных лотков по старой оси, в том числе с применением конструкций из других материалов без увеличения водопропускной способности;

восстановление эксплуатационных обустройств (откосных лестниц и ограждений);

удлинение трубы (не более 25% от первоначальной длины, без увеличения ее водопропускной способности);

ремонт и замена деформационных швов;

замена металлических опор на железобетонные и бетонные без переустройства фундаментов;

антикоррозионная защита сооружений;

сплошной ремонт и замена асфальтового покрытия;

ремонт и замена, восстановление отбойников и ограждений;

восстановление каменной наброски;

перекладка каменной кладки, ремонт поверхностей лотков, селеспусков и быстротоков;

ремонт штолен и дренажей;

замена двойного и одиночного мощения или покрытия из железобетонных и бетонных плит, а также других видов укреплений конусов устоев и откосов предпортальных выемок;

восстановление укреплений регуляционных сооружений;

восстановление бетонных и бутобетонных конструкций регуляционных сооружений;

ремонт и восстановление в соответствии с требованиями нормативных документов систем освещения, оповестительной, заградительной и судоходной сигнализации, пневмообдувки, вентиляции, электрообогрева лотков в тоннелях, охранных зон мостов и тоннелей, служебных помещений мостовых (тоннельных) бригад, смотровых устройств, габаритных ворот;

восстановление и ремонт контрольно-габаритных устройств перед мостами и путепроводами;

ремонт ограждений запретных зон, периметровой сигнализации, системы видеонаблюдения, постовых будок;

мероприятия по сохранению многолетнемерзлых грунтов и борьбе с наледями.

При капитальном виде ремонта сооружения одновременно могут производиться необходимые работы, относящиеся к текущему содержанию.

7.3. Сроки и объемы работ по капитальному виду ремонта в каждом конкретном случае устанавливаются по фактическому состоянию искусственных сооружений на основании осмотров и обследований с учетом приоритетности выполнения работ, выполняемого согласно утвержденному нормативно-техническому документу (приложение В, п. 15). При прочих равных условиях, в первую очередь, ремонтируются сооружения, находящиеся на путях более высокого класса.

7.4. Периодичность планово-предупредительных ремонтов искусственных сооружений формируется исходя из сроков службы конструкций, указанных в сводах правил на их строительство и ремонт, а также остаточного ресурса. Организация планово-предупредительных ремонтов искусственных сооружений, включая отнесение их к капитализируемым и не капитализируемым, осуществляется в соответствии с утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В к Инструкции, п. 14).

7.5. Капитальные виды ремонта осуществляются по технологическим правилам (процессам) или проектам.

7.6. Решение вопроса о выборе усиления или замены конструкций осуществляется на основе технико-экономического сравнения вариантов. Реестр перспективных конструкций искусственных сооружений, рекомендуемых для их учета при проектировании, ведется Центральной дирекцией инфраструктуры на основании научных работ, проектов повторного применения, технико-экономических сравнений вариантов при проектировании, эксплуатационных наблюдений.

7.7. При замене пролетных строений на современные конструкции необходимо предусматривать проектом приведение грузоподъемности опор в соответствие.

7.8. Работы по ремонту сооружений не должны приводить к снижению их водопропускной способности менее расчетной.

7.9. На участках капитального ремонта железнодорожного пути 1 и 2 уровней в проекте должны быть предусмотрены необходимые работы по ремонту искусственных сооружений, в том числе подъемка пролетных строений мостов или приведение толщины балласта к нормативным значениям, ремонт опор, ремонт и удлинение труб, восстановление и ремонт охлаждающих конструкций конусов и опор (устоев), восстановление термометрических скважин.

7.10. При ремонте пути с глубокой очисткой или заменой балласта на мостах его толщина под шпалой должна быть приведена к минимально возможному нормативному значению.

Перед началом работ с глубокой очисткой или заменой балласта мостовой мастер по заявке руководителя работ проверяет готовность сооружений к работе путевых машин и строительной техники с целью исключения возможности потери устойчивости несущих конструкций, контролирует соблюдение технологии работ согласно проекту.

7.11. Технический надзор за подготовкой и проведением ремонтных работ, выполняемых специализированными организациями, осуществляется мостовым (тоннельным) мастером или другими работниками, назначаемыми начальником предприятия, его заместителями или начальниками участков.

7.12. Работник, осуществляющий технический надзор, обязан следить за качеством работ, за их соответствием проекту, контролировать соблюдение всех правил и требований по обеспечению безопасности движения поездов и установленного проектом режима эксплуатации на период работ.

7.13. Условия эксплуатации искусственных сооружений в период производства ремонтных работ, в том числе взаимодействие со сторонними и подрядными организациями, определяются утвержденными нормативно-техническими документами (приложение В к Инструкции, п. 16).

7.14. Приемка законченных капитальными видами ремонта объектов оформляется актами комиссии под председательством руководителя, являющегося представителем заказчика, с участием начальников предприятий или их заместителей и представителя мостоиспытательной станции.

7.15. Приемка работ после капитального ремонта пути 1 и 2 уровней, при наличии искусственных сооружений, должна проводиться с участием представителей предприятия, эксплуатирующего искусственные сооружения.

7.16. При приемке работ исполнительная документация в полном объеме должна быть передана от подрядной организации в предприятие для последующего хранения в архиве после внесения необходимой информации в технический паспорт.

8. Конструктивные элементы искусственных сооружений

и порядок их содержания

8.1. Русло и регуляционные сооружения

8.1.1. На искусственных сооружениях с постоянным или временным водотоком, имеющих недостаточную водопропускную способность, опасных по размыву в период паводка, а также на мостах, где это требуется по состоянию опор или русла реки должны производиться наблюдения за уровнем воды, профилем дна реки (измерения глубины русла), состоянием льда и проходом ледохода, проходом высокой воды, изменением в плане положения русла и направления течения у мостового перехода, работой регуляционных сооружений.

Наблюдения за уровнями воды проводятся в период подготовки к пропуску паводка и во время его прохождения в соответствии с утвержденными мероприятиями. Перечень мостов, на которых должны проводиться указанные наблюдения, ежегодно определяется дирекцией инфраструктуры.

На мостах через большие реки, перечень которых утверждается дирекцией инфраструктуры, устанавливаются водомерные посты.

На всех остальных мостах и трубах должны выполняться гидрометрические наблюдения по определению наивысших уровней вод во время весенних или летних паводков, а также уровней меженных вод.

При необходимости организуются дополнительные гидрометрические наблюдения в соответствии с утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В, п. 17).

Для наблюдения за режимом водного потока, промеров русла и осмотра опор должны быть моторные катера и лодки. Для измерения глубины применяются различные приспособления и приборы: рейки, наметки, гидрометрические штанги, лоты, ультразвуковые эхолоты.

8.1.2. Все измерения глубины русла должны быть связаны геодезическими отметками с постоянным репером, размещенным на искусственном сооружении. Для наблюдения за уровнем воды у мостов и труб должны быть водомерные рейки, прочно укрепленные в отвесном положении на боковой поверхности опор с верховой стороны или на входных оголовках (для оголовков с раскрылками — вблизи портала). При наличии значительных перепадов воды рейки должны быть также поставлены под мостами или с низовой стороны опор. Вместо установки реек разрешается наносить масляной краской на самих сооружениях шкалу, привязанную к реперу для отсчета уровня. На малых искусственных сооружениях, где наиболее высокий уровень воды держится короткое время и поэтому может быть не отмечен, должны устанавливаться максимальные самофиксирующие рейки или маркеры.

8.1.3. В Книгах искусственных сооружений записываются отметки уровня высокой воды вместе с отметкой и характеристикой репера, к которому привязан ноль рейки, а также должна быть указана отметка уровня, при которой ранее наблюдались подмывы опор, разрушения укреплений откосов и дамб, подтопления бровки земляного полотна подходных насыпей, затопления подферменников и другие нарушения в работе мостового перехода при прохождении паводков. Наиболее высокие уровни паводка должны быть отмечены чертой с указанием даты (число, месяц, год), нанесенной масляной краской на одной из опор моста, или на оголовке трубы с входной стороны.

8.1.4. Измерения профилей русла должны выполняться на всех мостах длиной более 100 м, а также на мостах меньшей длины, по перечню, утвержденному дирекцией инфраструктуры, где это требуется по состоянию опор, русла реки, регуляционных сооружений или по характеру паводков.

Измерения профилей дна русла должны производиться два раза в год. При ливневых паводках, сопровождаемых неравномерным течением в подмостовом русле, образованием заторов и заломов у опор проводится дополнительное измерение профиля русла.

Измерения делают по всей длине моста, включая не покрытые водой, в трех створах: в главном створе, проходящем непосредственно у опор (с верховой стороны) на расстоянии не более 0,5 м от граней опор (в зависимости от конструкции фундамента) и на расстоянии 25 м от моста вверх и вниз по течению. В необходимых случаях промеры производятся в большем числе створов, а при устойчивом русле разрешается их делать только в створе у опор.

При выявлении опасных (угрожающих надежной работе моста) размывов промеры глубин выполняют ежедневно или несколько раз в сутки.

Положение вертикалей по ширине реки определяется по натянутому тросу диаметром 3 — 5 мм, геодезическими инструментами (тахеометром, теодолитом, дальномером) методом засечек, либо закрепляют на нижнем поясе ферм (при работе со смотровой тележки) или на тротуарах.

Полученные данные оформляются графически в виде профилей с указанием отметок уровней воды, низа ферм (балок), заложения фундаментов опор и дна русла, а также глубины, положения осей опор у уреза воды. Здесь же наносятся также данные предшествующего осмотра. Для наглядности горизонтальные расстояния откладываются на профилях в масштабе 1:500, а вертикальные — 1:100. При составлении данных, полученных в разное время обследований, выявляются характер и размеры размыва русла под мостом, в том числе и около опор. В каждом створе назначаются основные точки через 2 — 10 м и возле опор с обеих сторон. При повторных обследованиях русло измеряется по тем же точкам. Для определения изменений состояния русла по информации о предыдущих промерах за время эксплуатации моста составляются совмещенные профили живых сечений. Профили должны постоянно храниться в Деле искусственного сооружения (рисунок 1).

Рисунок 1. Поперечный профиль живого сечения реки

В случае опасности подмыва конусов, регуляционных сооружений и опор промеры необходимо производить по их контуру (рисунок 2). Перечень мостов, на которых должны проводиться измерения глубин, и порядок проведения промеров утверждаются дирекцией инфраструктуры.

Рисунок 2. Результаты промеров глубин у опоры моста

8.1.5. Конусы у мостов и труб, подходные (и особенно выходные) русла, а также регуляционные сооружения (дамбы, траверсы и др.) и насыпи подходов по конструкции, размерам и надежности укрепления должны соответствовать проекту и содержаться в удовлетворительном техническом состоянии.

8.1.6. У дамб и траверс откосного типа из наброски проверяют соответствие фактического профиля подводной части сооружения проектному, состояние бермы и откосов. Производят осмотр грунта за пределами сооружения с целью установления наличия подмыва и выпучивания. Определяют состояние одежды, фиксируют места ее сползания, разрушений и сдвигов отдельных плит и камней, выявляют состояние швов омоноличивания, а также состояние материала покрытия и дна перед сооружением. Проверяют общие деформации сооружений (осадки, сдвиги, наклоны), их неравномерность по длине сооружения, размыв каменных берм, подмывы дна у подошвы постели, аккумуляцию наносов, состояние материалов сооружения.

8.1.7. При осмотре гибких покрытий подводных откосов, выполненных в виде шарнирно скрепленных железобетонных плиток или габионов, заполненных камнем, следует определить состояние швов между элементами, убедиться в наличии камня в габионах, а также выявить дефекты бетона. Тщательному осмотру подлежат узлы опирания откоса и концевые участки гибких покрытий.

8.1.8. Особое внимание необходимо обращать на тщательность содержания укреплений в зоне водохранилищ.

8.1.9. Отверстия малых искусственных сооружений перед проходом весеннего паводка нужно очищать от снега и льда, а также прорывать вдоль русла канавы шириной не менее 0,5 м протяженностью не менее 20 м, как в верховую, так и в низовую стороны.

8.1.10. Для предупреждения заполнения снегом и льдом труб и малых мостов отверстием 1,5 м и менее необходимо на зиму закрывать их дощатыми или хворостяными щитами. Перед наступлением весны щиты должны быть убраны. Перечень таких сооружений утверждается предприятием.

8.1.11. Местность под всеми мостами на протяжении 30 м выше и ниже мостов должна быть очищена от сухого кустарника, валежника, горючего мусора. Под охраняемыми мостами очистка должна производиться в пределах запретной зоны.

8.1.12. Для предупреждения засорения плавающими предметами перед трубами при необходимости устраивают специальные ограждения. Размываемые места, являющиеся источником наносов в трубах, необходимо в зависимости от местных условий укреплять мощением, посадкой кустарника.

8.1.13. Для предотвращения повреждения кладки опор больших мостов примерзшим льдом до наступления ледохода необходимо устраивать вокруг опор проруби шириной 0,5 м. Проруби должны систематически возобновляться с тем, чтобы толщина льда в них не превышала 15 — 20 см. Перечень таких мостов утверждается дирекцией инфраструктуры.

Перед деревянными опорами и ледорезами непосредственно перед ледоходом следует устраивать прорези во льду шириной не менее чем на 0,5 м больше ширины опоры на протяжении около 25 м вверх и вниз по течению.

8.1.14. Для предупреждения образования вблизи моста ледяных заторов, создающих опасные условия прохода льда и воды под мостом (повреждения и подмывы опор), следует в зависимости от причины образования и величины заторов принимать соответствующие меры: предварительное дробление всей сплошной ледяной поверхности на небольшие поля, подрывание уже образовавшегося затора, а в необходимых случаях — подрывание отдельных льдин до подхода их к мосту. Перечень мостов, на которых необходимо проведение взрывных работ, утверждается дирекцией инфраструктуры и доводится до региональных сил МЧС России.

8.1.15. Во время паводков надлежит наблюдать за проходом вод (образованием водоворотов, заторами, косиной струй, изменением направления течений, за карчеходом, образованием заломов), а также проверять состояние конусов, насыпей на подходах, правильность работы регуляционных сооружений и достаточность их укрепления.

8.1.16. После спада уровня высоких вод, а также после сильных штормов на водохранилищах должно быть проверено состояние русла, опор, конусов, регуляционных сооружений и подходов к мостам. Повреждения, создающие угрозу безопасности движения или способные вызвать дальнейшее расстройство земляного полотна или элементов сооружения, необходимо исправлять немедленно. Все остальные повреждения должны быть исправлены до прохода очередного паводка.

8.1.17. При наличии наледей в сооружениях за их развитием и работой противоналедных устройств должны быть организованы режимные наблюдения, результаты которых (со съемкой плана и профиля наледей) заносятся в Книги искусственных сооружений. На основании результатов наблюдений должны разрабатываться и осуществляться мероприятия по борьбе с наледями или составляться соответствующие проекты.

8.1.18. В трубах, работающих с напором, должна быть обеспечена полная водонепроницаемость стыков между звеньями, а также надежное укрепление выходного русла. Фильтрация воды в насыпь во время паводков указывает на серьезные неисправности напорной трубы и на необходимость срочного ее ремонта вплоть до переустройства.

8.1.19. Прокладка в водопропускных трубах и руслах мостов инженерных коммуникаций не допускается.

8.1.20. Для обеспечения безопасности движения поездов по железнодорожным путепроводам над автомобильными дорогами и мостами, отверстия которых используются для пропуска транспортных средств, при высоте проезда под ними менее 5 м, необходимо совместно с местными администрацией и органами Государственной инспекции по безопасности дорожного движения разрабатывать мероприятия по предупреждению повреждения пролетных строений негабаритными грузами (установка габаритных ворот, дорожных знаков и нанесение дорожной разметки по ГОСТ Р 52289-2004; ограничение скорости движения автотранспорта; своевременная очистка автопроезда под сооружениями от снега и льда и т.д.).

Перед искусственными сооружениями с высотой проезда менее 5 м устанавливают габаритные ворота (приложение Г).

Устройство дорог для пропуска транспортных средств и прогона скота под искусственными сооружениями допускается при согласовании дирекцией инфраструктуры, при подтверждении оснащенности автодороги требованиям к автодорогам соответствующей категории, а также обеспечения защиты пролетного строения и опор железнодорожного сооружения.

В случае обнаружения фактов проезда транспортных средств под искусственными сооружениями, перечень которых не согласован дирекцией инфраструктуры, принимаются незамедлительные меры к оборудованию искусственных препятствий, исключающих проезд транспортных средств.

8.2. Мостовое полотно и верхнее строение пути

на искусственных сооружениях

8.2.1. Рельсовый путь на мостах может быть на щебеночном балласте с железобетонными или деревянными шпалами, на деревянных, металлических поперечинах, на безбалластных железобетонных плитах, на безбалластных плитах из композитного материала.

8.2.2. Для железнодорожных тоннелей применяется путь на балласте или безбалластный утвержденной конструкции.

8.2.3. Тип рельсов и геометрия рельсовой колеи на искусственных сооружениях должны соответствовать тем же требованиям, что и на перегоне прилегающих участков.

8.2.4. Не допускается эксплуатация дефектных рельсов на больших, средних мостах, в тоннелях и на подходах к указанным сооружениям. Укладка на мостах и на подходах к ним разных типов рельсов и рельсовых рубок не допускается (кроме временных при производстве ремонтных работ и временного восстановления рельсовой плети). Не допускается перекладка рельсов с переменой рабочего канта на мостах длиной более 25 м, включая подходы к ним.

8.2.5. Профиль рельсового пути на мосту должен иметь плавное очертание. В каждом пролете металлических мостов стрела подъема рельсов должна быть равна 1/2000 длины пролета, но не более 1/1000 пролета. На железобетонных пролетных строениях рельсовому пути должна придаваться стрела подъема только в случаях, предусмотренных проектом.

Для мостов, на которых осуществляется движение поездов до 250 км/ч, стрела подъема рельсового пути на металлических разрезных и крайних пролетах неразрезных пролетных строений мостов должна быть в пределах 1/2500 — 1/3000, а в средних пролетах неразрезных систем 1/5000 — 1/6000 величины расчетного пролета. До сплошной смены мостовых брусьев разрешается сохранять существующий подъем рельсового пути со стрелой не более 1/2000 величины пролета. На пролетных строениях с ездой на балласте длиной до 30 м строительный подъем разрешается не устраивать за исключением случаев, предусмотренных в проекте на их изготовление.

Понижение отметок рельсового пути на пролетных строениях по сравнению с участками над опорами не допускается.

Условия обращения поездов при несоответствии стрелы подъема указанным значениям определяются мостоиспытательной станцией.

8.2.6. На мостах с безбалластным мостовым полотном в прямом участке ось верхнего строения пути не должна отклоняться от оси пролетного строения на величину более 30 мм. В кривых фактическое отклонение оси верхнего строения пути от проектного положения не должно превышать 20 мм. При езде на балласте допускаются отклонения соответственно не более 50 и 30 мм. При больших отклонениях необходимо произвести рихтовку рельсошпальной решетки или перешивку рельсового пути, а если это невозможно, то проверять расчетом их допустимость по условиям грузоподъемности пролетных строений и прочности мостовых брусьев. Кроме того, на мостах с ездой понизу и посередине необходимо проверять их соответствие габариту приближения строений.

8.2.7. Содержание верхнего строения пути в прямых участках с возвышением одного рельса над другим на 6 мм для обеспечения более плавного хода поездов при езде на балласте допускается на всех мостах, а при езде на мостовых брусьях или безбалластных железобетонных плитах — только на мостах длиной не более 25 м с ездой поверху. При езде на мостовых брусьях возвышение в 6 мм достигается соответствующей прирубкой брусьев или укладкой плоских металлических прокладок толщиной 6 мм под рельсовые подкладки, а при езде на безбалластных железобетонных плитах — укладкой регулировочных подкладок под рельс.

8.2.8. Условия укладки бесстыкового пути на искусственных сооружениях определяется утвержденным нормативно-техническим документом (приложение В, п. 10), а также проектным решением.

8.2.9. Бесстыковой путь в тоннелях длиной до 300 м с ездой на балласте устраивают так же, как и за пределами тоннеля. Температуры закрепления плетей при этом устанавливают, как для открытых участков. В тоннелях длиной более 300 м при расположении плетей полностью внутри тоннеля расчетную амплитуду температур рельсов принимают на 20 °C меньше, чем вне тоннеля.

8.2.10. Стыки рельсов на мостах необходимо располагать по наугольнику с нормативным значением зазоров. Рельсовый стык не должен располагаться над разрывами продольных балок, а также ближе 2 м от концов пролетных строений, задней грани устоев, а в арочных мостах — от деформационных швов и замка свода. Не допускает эксплуатация четырехдырных стыковых накладок на мостах и в тоннелях. При несоблюдении вышеуказанных рекомендаций ограничивается скорость движения поездов до 60 км/ч.

8.2.11. Передача угона рельсового пути с подходов на мост не допускается. В случае если при полном закреплении рельсового пути на подходах наблюдается угон в пределах самого моста, то закрепление рельсового пути от угона на многопролетном мосту с безбалластными конструкциями мостового полотна устанавливается по проекту, при езде на балласте — так же, как на перегоне.

Закрепление пути от угона не должно препятствовать температурному перемещению пролетных строений относительно рельсов при отсутствии уравнительных приборов, для чего противоугоны следует размещать со стороны неподвижных опорных частей.

На мостах с полотном на деревянных брусьях противоугоны ставят у брусьев, прикрепленных противоугонными уголковыми коротышами, а при езде на балласте — так же, как на перегоне. При езде на металлических поперечинах и безбалластных железобетонных плитах путь закрепляют с помощью соответствующего затягивания клемм прикрепления рельсов.

8.2.12. Рельсовые замки на концах подъемных (поворотных) пролетных строений разводных мостов должны обеспечивать быстрое и надежное соединение рельсов, а также плавный (без ударов) проход подвижного состава. Замки должны изготавливаться по проекту, содержаться в соответствии с конструкторской документацией.

8.2.13. Температурным пролетом является расстояние от неподвижных опорных частей одного пролетного строения до неподвижных опорных частей смежного пролетного строения или до шкафной стенки устоя. В консольных мостах учитываются только опорные части, расположенные на опорах и устоях. В арочных мостах (без затяжки) температурный пролет равен половине пролета арки. Размеры температурных пролетов при различных схемах мостов показаны на рисунке 3.

L_t — температурный пролет; Ур — место установки

уравнительного прибора; — неподвижные опорные части;

о — подвижные опорные части

а — с разрезными пролетными строениями в однопролетных мостах или при расположении на промежуточной опоре одной подвижной и одной неподвижной опорных частей смежных пролетных строений;

б — то же, при расположении на промежуточной опоре двух подвижных опорных частей;

в, г — с неразрезными пролетными строениями при расположении неподвижной опорной части в середине и на конце пролетного строения;

д — с консольными пролетными строениями;

е — с арочными пролетными строениями.

Рисунок 3. Температурные пролеты при различных схемах мостов

8.2.14. На металлических мостах с температурным пролетом более 100 м, а при годовой амплитуде температуры рельсов не превышающей 90 °C, — более 110 м необходимо укладывать уравнительные приборы и уравнительные стыки, расположение которых определяется проектом. Допускается укладка уравнительных или сезонных рельсов, количество которых определяется расчетом.

Уравнительные приборы и стыки должны изготавливаться по проекту.

Остряки стыков уравнительных приборов могут располагаться как пошерстно в отношении направления преимущественного движения, так и в противошерстном направлении.

В предприятиях должна быть заведена ведомость рельсовых замков, уравнительных приборов и стыков, уложенных на мостовых переходах с указанием наименования и местонахождения объекта, пропущенного тоннажа, произведенного ремонта.

При безбалластном мостовом полотне на железобетонных плитах участок расположения уравнительного стыка должен быть горизонтальным.

На участке расположения уравнительного стыка на железобетонных плитах высокопрочные шпильки, которые расположены под мостиками уравнительного стыка, разрешается не устанавливать, а плиты уравнительного стыка, где закреплены мостики, оставлять закрепленными на 4 шпильки (такая плита должна иметь отверстия для 6 шпилек прикрепления). Требуется, чтобы край столика не попадал на ближайшую шпильку, в противном случае его необходимо подрезать.

В уравнительных стыках и приборах все болты и прижимы должны быть плотно закреплены, а трущиеся поверхности остряков и рамных рельсов смазаны.

Лафеты уравнительных стыков и приборов должны плотно опираться на мостовые брусья, безбалластные плиты или шпалы. Остряки уравнительных стыков и приборов должны занимать положение, соответствующее температуре воздуха, с допуском +/- 20 мм.

Запрещается держать на мостах уравнительные стыки и приборы, имеющие хотя бы одну из следующих неисправностей: выкрашивание остряка на длине 200 мм и более (выкрашивание менее 200 мм должно быть зашлифовано); излом остряка или рамного рельса; понижение остряка против рамного рельса на 2 мм и более, измеряемое в границах (пределах), где расстояние от рамного рельса до рабочей грани остряка составляет от 50 до 120 мм. При измерении величины понижения остряков не учитывается величина его провеса.

Вертикальный износ остряков вне пределов вертикальной строжки (в сечении, где ширина его 50 мм и более) и рамных рельсов не должен превышать значений, приведенных в таблице 1.

Таблица 1

Вертикальный износ остряков вне пределов

вертикальной строжки

Тип уравнительного стыка или прибора	Вертикальный износ рамных рельсов и остряков, мм, при скорости движения поездов, км/ч
пассажирских	грузовых
141 — 250	121 — 140	101 — 120	До 100	90 — 120	81 — 90	До 80
Р65	3	5	6	8	6	8	8

При вертикальном износе остряков и рамных рельсов более 8 мм скорость движения поездов впредь до их замены должна быть ограничена с учетом технического состояния уравнительного стыка или прибора и мостового полотна и не должна превышать значений, установленных для стрелочных переводов.

Уравнительные стыки и приборы с вертикальным износом остряков и рамных рельсов более 10 мм эксплуатировать не допускается. Боковой износ остряков (в сечении, где ширина его 20 мм) и рамных рельсов допускается не более 8 мм.

Измерение вертикального и бокового износа остряков и рамных рельсов производятся инструментами, применяемыми для указанной цели при содержании стрелочных переводов. При этом вертикальный износ остряка и рамного рельса измеряется в местах, где имеются зазоры между лафетами и мостиками.

Боковой износ остряков и рамных рельсов измеряется на уровне 13 мм от верхней грани головки рельса за пределами строжки остряка, в сечении 50 мм и более. Боковой износ рамных рельсов измеряется перед остряком в наиболее изношенном месте.

8.2.15. В качестве балласта на мостах и подходах применяется щебень из твердых пород. Ширина плеча балластной призмы на мостах должна быть, как указано в таблице 8.2. Меньшая ширина, но не менее 25 см, допускается на мостах, расположенных на линиях 4 и 5 классов. В кривых радиусом менее 600 м ширина плеча балластной призмы со стороны наружной нити пути менее 35 см не допускается. Ширина плеча балластной призмы может быть уменьшена, если подошвы шпал расположены ниже верха бортиков балластного корыта не менее чем на 10 см.

Таблица 2

Ширина плеча балластной призмы на мостах в зависимости

от скорости движения поездов

Ширина балластной призмы (см) на мостах в зависимости от скорости поездов, км/ч
Пассажирских	Грузовых
141 — 250	121 — 140	101 — 120	до 100	90 — 120	81 — 90	до 80
50	45	40	35	40	35	35

В необходимых случаях должны предусматриваться мероприятия, предотвращающие осыпание балласта и обеспечивающие устойчивость рельсового пути: однократное наращивание бортов балластного корыта пролетных строений и боковых стенок устоев на величину не более 20 см (перечень таких мостов утверждает начальник службы пути дирекций инфраструктуры), срезка балласта или подъемка пролетных строений. Наращивание бортов более 20 см допускается при наличии расчета грузоподъемости пролетного строения и прочности консоли балластного корыта, а также равнопрочности с основными конструкциями моста.

8.2.16. Толщина слоя балласта под шпалой в подрельсовой зоне на мостах и в тоннелях должна быть 25 — 60 см, а на мостах с откидными консолями — не более 35 см. Толщина балласта не менее 15 см допускается на линиях 5 класса и на сооружениях старой постройки до их переустройства.

Условия пропуска поездов при толщине балласта на мостах менее 15 см и более 60 см определяются расчетами прочности и грузоподъемности соответственно.

Для возможности пропуска ремонтно-путевых машин при строительстве новых и реконструкции существующих мостов конструкция балластного корыта сооружений должна обеспечивать укладку балластного слоя толщиной под шпалой 40 см.

При езде на балласте возвышение наружного рельса в кривых достигается увеличением толщины балластного слоя, при этом пролетные строения при необходимости должны иметь повышенные борта балластного корыта.

На мостах с ездой на балласте необходимо следить за обеспечением отвода воды из балластного корыта, своевременно очищая водоотводные трубки, другие водоотводные и очистные устройства.

Вода из водоотводящих устройств не должна попадать на нижерасположенные конструкции, а также на железнодорожные пути, проезжую часть и тротуары автомобильных дорог и улиц, расположенных под мостовыми сооружениями.

8.2.17. Количество шпал на мостах без охранных приспособлений должно быть таким же, как на прилегающих участках пути. На мостах с охранными приспособлениями на 1 км пути укладывается по эпюре 2000 шпал или в соответствии с проектом устройства пути на мосту.

8.2.18. Мостовые брусья должны быть уложены по наугольнику с расстоянием в свету между ними не более 15 см и не менее 10 см. У поперечных балок расстояние между осями мостовых брусьев должно быть не более 55 см, если это позволяет конструкция пролетного строения.

На старых мостах с разрешения начальников служб пути дирекций инфраструктуры может быть допущено увеличение этого расстояния, но не более 70 см. Если по условиям конструкции пролетных строений это требование не может быть выполнено, то мостовое полотно укладывают по индивидуальному проекту, утвержденному начальником службы пути.

На мостах с устоями, расположенными под углом к пролетным строениям, допускается веерное расположение части мостовых брусьев.

Укладка мостовых брусьев на верхние пояса поперечных балок не допускается. Мостовые брусья не должны примыкать вплотную к поясам поперечных балок, чтобы не препятствовать стоку воды и их очистке. Зазор не менее 15 мм обеспечивается прикреплением мостовых брусьев к противоугонным уголкам, установленным у концов продольных балок.

Мостовые брусья должны быть плотно прирублены к поясам пролетных строений или продольных балок. Глубина врубок в мостовых брусьях должна быть не менее 0,5 см, а при укладке на деревянные прогоны — не менее 2 см. Во всех случаях глубина врубки для нормальных брусьев не должна превышать 3 см (для брусьев сечения, соответствующего таблице 6). Для головок заклепок и высокопрочных болтов поперек бруса вырубают канавки. Разрешается применять брусья большей высоты (при условии обеспеченной грузоподъемности пролетного строения), а также подкладки из досок длиной не менее 1 м и толщиной не менее 4 см. Доски должны быть прикреплены к брусу гвоздями (рисунок 4).

Рисунок 4. Увеличение высоты мостового бруса с помощью

дополнительной доски

Для надежной работы и увеличения срока службы мостовых брусьев необходимо обеспечивать плотное опирание рельсов на брусья, а самих брусьев — на продольные балки (фермы), своевременно производить ремонт брусьев, не допуская развития трещин, а также зачистку заусениц с антисептированием зачищенных мест. Лапчатые и другие болты должны находиться в правильном положении и быть плотно подтянутыми.

Для уменьшения износа мостовых брусьев под рельсовыми подкладками необходимо укладывать упругие прокладки. Не допускаются неплотности опирания рельсов и мостовых брусьев более 1 мм. Для ликвидации неплотности опирания рельсов на подкладки допускается укладка металлических карточек под всей площадью рельсовой подкладки.

Мостовые брусья должны изготовляться из сосны, лиственницы или композитных материалов нормированного качества. Деревянные брусья должны быть пропитаны маслянистыми антисептиками на шпалопропиточных заводах. Все места врубок и стенки отверстий, сделанных в брусьях после пропитки, должны быть обработаны маслянистым антисептиком. Для предупреждения появления трещин концы брусьев должны быть стянуты металлическими или деревянными винтами, полосовой сталью или проволокой. Все брусья должны иметь клеймо, на котором указан год укладки. Сечения мостовых брусьев должны соответствовать данным таблицы 3.

Таблица 3

Сечение мостовых брусьев

Расстояние между осями продольных балок или ферм, м	Сечения мостовых брусьев, см
при контруголках, не менее	при контррельсах, не менее
до 2,0	20 x 24	20 x 24
от 2,0 до 2,2	20 x 24	22 x 26
от 2,2 до 2,3	22 x 26	22 x 28
от 2,3 до 2,5	22 x 28	24 x 30

При необходимости сплошной замены мостовых брусьев сечением 22 x 28 см и 24 x 30 см, а также брусьев длиной 4,2 м должно производиться переустройство мостового полотна посредством укладки металлических поперечин, безбалластных железобетонных плит, а также оборудование мостов тротуарами на металлических консолях или проведение других мероприятий, исключающих применение брусьев повышенного сечения или длины.

Для пролетных строений с ездой поверху при двустенчатых верхних поясах с верхними поясными уголками, расположенными снаружи вертикальных листов, принимают сечение мостовых брусьев по таблице 3, исходя из расстояния между внутренними стенками поясов.

8.2.19. Для предупреждения провала колес сошедшего с рельсов подвижного состава над поперечными балками устраивают переходные столики, а при контруголках и охранных уголках — подвесные мостики установленной конструкции. Деревянные коротыши должны в плановом порядке заменяться на металлические столики и мостики.

Контруголки (контррельсы) укладывают:

на мостах с ездой на балласте (кроме путепроводов), имеющих полную длину более 50 м или расположенных на кривых радиусом менее 600 м;

на путепроводах с ездой на балласте при полной длине сооружений более 25 м или расположенных на кривых радиусом менее 1000 м;

на мостах и путепроводах с ездой на металлических или деревянных поперечинах (мостовых брусьях), безбалластных железобетонных плитах при длине мостового полотна более 5 м;

в двухпутных тоннелях.

Контруголки (контррельсы) протягивают до задней грани устоев или закладных щитов, далее концы их на протяжении не менее 10 м сводят «челноком» заканчивающимся металлическим башмаком. При строительстве, реконструкции металлических и железобетонных мостов с ездой на балласте, перекрываемых рельсовыми плетями и проведении на них реконструкции (модернизации) или капитального ремонта железнодорожного пути, начало челнока контруголков со стороны подвижных концов пролетных строений должно быть отнесено за заднюю грань устоя на расстояние: 5 м — для мостов с пролетными строениями длиной до 44 м; 10 м — от 44 до 66 м и 15 м от 66 м и более.

На путях под путепроводами (в том числе и специальными — для пропуска трубопроводов, силовых кабелей и т.п.), пешеходными мостами и в двухпутных тоннелях контруголки (контррельсы) укладывают на протяжении ширины путепровода (пешеходного моста) или длины тоннеля и далее их концы сводят «челноком» на протяжении не менее 10 м. Челноки должны укладываться на специальные железобетонные шпалы. Допускается до проведения капитальных работ или реконструкции железнодорожных путей укладка контрприспособлений (в т.ч. челнока) на деревянные шпалы.

Челноки должны укладываться на специальные железобетонные шпалы. Допускается до проведения капитальных работ или реконструкции железнодорожных путей содержание контрприспособлений (в т.ч. челнока) на деревянные шпалы.

На подвижных концах пролетных строений и в местах разрыва проезжей части необходимо устраивать подвижные стыки контруголков. В стыках контррельсов в этом случае не ставят болты с одной стороны стыка.

На многопутных мостах при наличии сплошного балластного корыта контруголки (контррельсы) разрешается укладывать только на крайних путях. Контруголки должны быть сечением не менее 160 x 160 x 16 мм. На эксплуатируемых мостах до их переустройства, капитального вида ремонта или сплошной замены мостового полотна допускаются контруголки меньшего сечения, но не менее 150 x 100 x 14 мм. Контррельсы должны быть на один тип легче или того же типа, что и путевые рельсы. Для контруголков (контррельсов) должны применяться уголки (рельсы) длиной не менее 6 м, в том числе из сварных элементов.

Расстояние от внутренней грани головки путевого рельса до контруголков (контррельсов) должно быть с допуском +/- 5 мм: при контруголках 160 x 160 x 16 мм — 310 мм; при контруголках 160 x 100 x 14 мм и контррельсах — 245 мм (при рабочих рельсах Р50 и легче — 220 мм).

На период проведения ремонтно-путевых работ, связанных с демонтажем контруголка (контррельса), а также при его отсутствии скорость движения поездов ограничивается до 40 км/ч.

8.2.20. На всех мостах при езде на мостовых брусьях или металлических поперечинах должны быть противоугонные (охранные) уголки или брусья. В качестве противоугонных уголков должны использоваться уголки сечением не менее 160 x 100 x 10 мм или сечением не менее 125 x 125 x 10 мм.

Охранные брусья должны быть сечением x 205 см. Противоугонные (охранные) уголки (брусья) укладываются на расстоянии не менее 300 мм (в исключительных случаях 250 мм) и не более 400 мм от наружной грани головки путевого рельса. На мостах с металлическими поперечинами противоугонные (охранные) уголки должны соответствовать проекту.

Укладка противоугонных (охранных) уголков и брусьев производится в соответствии с действующими Техническими указаниями по устройству и конструкции мостового полотна на железнодорожных мостах.

Противоугонные уголковые коротыши с вертикальной полкой не менее 120 мм ставят при отсутствии балочной клетки не менее двух на пролет и по одному на каждые 5 м длины, а при наличии балочной клетки — по одному у концов каждой продольной балки с горизонтальными полками, повернутыми в разные стороны.

8.2.21. Мосты полной длиной более 25 м, а также все мосты высотой более 3 м, мосты, расположенные в пределах станций, и все путепроводы должны иметь двухсторонние боковые служебные тротуары с перилами, располагаемыми вне габарита приближения строений. В северных условиях двусторонние боковые тротуары должны иметь все мосты полной длиной более 10 м.

На двухпутных пролетных строениях, а также на двухпутных и многопутных мостах с ездой поверху на общих опорах должны быть тротуары в междупутье. Настил из досок сечением не менее 20 x 2,5 см укладывают снаружи колеи (на тротуарах), а при отсутствии боковых тротуаров — внутри колеи. Металлический настил применяется шириной не менее 44 см при наличии боковых тротуаров и не менее 68 см при их отсутствии, при этом металлический настил не должен соприкасаться с контруголками (контррельсами).

Над подвижными концами пролетных строений настил должен иметь возможность перемещения вместе с подвижными концами пролетных строений. На тротуарах рекомендуется применять металлический настил просечного или рифленого профиля, допускается применять настил из арматурной стали, а также настил из железобетонных плит (при достаточной грузоподъемности пролетных строений и несущей способности консолей). Металлический настил разрешается укладывать внутри колеи.

8.2.22. Проезжая, прохожая часть, включая тротуары и лестничные сходы должны содержаться в состоянии, обеспечивающем безопасное передвижение транспорта и пешеходов соответственно, очищаться от снега и льда, посыпаться песком, гранитной крошкой или разрешенными антигололедными реагентами. Не допускается применение поваренной соли и других химически активных добавок агрессивных к бетону и металлу.

8.2.23. На вновь сооружаемых и реконструируемых пешеходных мостах и тоннелях следует устраивать пандусы, подъемные устройства или другие приспособления для передвижения маломобильных групп населения, тактильную плитку для слабовидящих на крайних ступеньках.

8.2.24. Ограждение проезжей части автодорожных путепроводов, предотвращающее падение автомобильного транспорта на железнодорожный путь, должно соответствовать требованиям обустройства автодороги соответствующей категории.

8.2.25. На новых и реконструируемых мостах с безбалластным мостовым полотном следует укладывать безбалластные плиты. На эксплуатируемых мостах при недостаточной грузоподъемности для укладки железобетонных плит следует укладывать безбалластные плиты из композитных материалов. Сплошная смена мостового полотна с укладкой деревянного бруса допускается на путях 3 — 5 класса, а также в других обоснованных случаях.

8.2.26. На мостах с безбалластным мостовым полотном на железобетонных или композитных плитах необходимо следить за состоянием плит и прокладного слоя или другой конструкции сопряжения плиты с балками пролетных строений, а также заделкой швов между плитами. Сквозные трещины в безбалластных плитах не допускаются, плиты с такими дефектами подлежат замене.

Периодически должна осуществляться проверка натяжения высокопрочных шпилек прикрепления плит к пролетному строению. Усилия прижатия высокопрочными шпильками плит безбалластного мостового полотна к балкам пролетных строений в зависимости от типа сопряжения железобетонных плит с балками пролетных строений должны быть не менее:

8 тс — для железобетонных плит при сплошном прокладном слое из армированного мелкозернистого бетона или высокопрочного раствора с модификаторами или дискретном опирании плит на металлические обоймы, заполненные бетоном;

12 тс — для железобетонных плит в случае опирания плит на сплошные двухслойные прокладки из антисептированных деревянных досок и резины;

6 тс — для композитных плит.

При укладке плит на прокладной слой из цементно-песчаного раствора, из мелкофракционного бетона или специальные минеральные быстротвердеющие материалы проверка натяжения проводится после набора прочности до 15 МПа. При прокладном слое из многослойной водостойкой фанеры или из антисептированной древесины проверка натяжения проводится в течение первой недели ежедневно, в течение первого месяца один раз в неделю. При дальнейшей эксплуатации сооружений с безбалластным мостовым полотном подтягивание шпилек крепления плит до нормативного усилия выполняется не реже двух раз в год.

После укладки композитных плит необходимо в течение первой недели ежедневно, а затем в течение первого месяца один раз в неделю контролировать величину натяжения шпилек, и при их ослаблении ниже 6 тс, доводить до 8 тс. После стабилизации величины натяжения усилия в шпильках необходимо проверять не реже двух раз в год.

8.2.27. На мостах с мостовым полотном на металлических поперечинах особое внимание необходимо обращать на состояние металла поперечин в местах их опирания на продольные балки в связи с возможным появлением трещин, неплотностей в связи с ослаблением заклепок и затяжки болтов, а также следить за состоянием изолирующих деталей при автоблокировке для обеспечения надежной ее работы.

8.2.28. Специальные конструкции участков переменной жесткости на подходах к мостам, в том числе при переходе с балластного на безбалластное верхнее строение пути, следует устраивать по проектам.

8.2.29. Конструкция и нормы содержания мостового полотна должны соответствовать утвержденному нормативно-техническому документу (приложение В, п. 8).

8.3. Металлические сооружения и конструкции

8.3.1. При содержании металлических пролетных строений и опор необходимо обращать особое внимание на состояние противокоррозионного покрытия, проверять состояние заклепочных, сварных, болтовых соединений и металла элементов (выявление слабых заклепок, ослабления затяжки или лопнувших болтов, усталостных трещин и др.), состояние элементов конструкции (искривления, погнутости и др.) и принимать меры к своевременному устранению появившихся дефектов и повреждений.

8.3.2. Металлические пролетные строения и опоры необходимо содержать в чистоте для предупреждения образования очагов коррозии металла. Наиболее подвержены засорению и коррозии проезжая часть, нижние пояса ферм, верхние пояса ферм при езде поверху, фасонки продольных связей, опорные узлы, а также имеющиеся пазухи и щели в конструкциях.

8.3.3. При распучивании элементов до их замены необходимо удалить ржавчину из щели, обработать противокоррозийными преобразователями ржавчины и заделать щель герметиком с последующей окраской.

8.3.4. В болтосварных пролетных строениях с герметическими замкнутыми сварными коробчатыми элементами не допускается наличие воды внутри коробчатых элементов. При осмотре пролетных строений следует обращать внимание на соединения элементов, следить за появлением потеков ржавчины. В случае обнаружения неисправности герметичности элементов необходимо принимать меры по удалению воды и восстановлению герметичности.

8.3.5. Для предупреждения скопления воды в коробчатых поясах и других местах возможного ее скопления должны быть в достаточном количестве отверстия диаметром не менее 23 мм с раззенкованными сверху краями, которые должны своевременно прочищаться.

8.3.6. Все металлические части пролетных строений и опор, кроме катков, плоскостей катания и скольжения опорных частей, должны быть окрашены. Окраска должна своевременно возобновляться в соответствии с установленной периодичностью учитывая при этом состояние защитного лакокрасочного покрытия и долгосрочный план замены конструкций.

8.3.7. Части металлических пролетных строений и опор, наиболее подверженные коррозии, необходимо окрашивать чаще других, применяя при этом особо устойчивые краски или защитные покрытия. При повреждении лакокрасочного покрытия только на отдельных участках элементов необходимо, не ожидая сплошной окраски, производить частичную их подкраску.

8.3.8. Металлоконструкции из атмосферостойкой стали не нуждаются в антикоррозийной обработке.

8.3.9. Окрасочные работы должны производиться полимерными лакокрасочными материалами и масляными красками в соответствии с утвержденной технологией.

8.3.10. На электрифицированных участках очистку и окраску поверхностей элементов, находящихся на расстоянии менее 2 м от токонесущих частей, разрешается выполнять только после снятия напряжения с контактной сети и проводов высоковольтных линий.

8.3.11. Работы по окраске должны производиться при отсутствии атмосферных осадков, тумана, росы и при температуре воздуха не ниже плюс 5 °C и не выше плюс 30 °C.

8.3.12. Очищенные поверхности металла подлежат приемке. При этом производится тщательный осмотр металла с целью выявления трещин, расслоений и других дефектов. Приемку очистки и результаты осмотра пролетных строений оформляют актом. Выявленные дефекты необходимо устранить до восстановления антикоррозийного покрытия. На работников, выполняющих окраску, должна быть возложена обязанность сообщать обо всех замеченных ими дефектах в металле.

8.3.13. При окраске элементов моста необходимо сохранять или возобновлять имеющуюся на них нумерацию узлов, маркировку мест установки нивелировочных реек, отметку поврежденных мест. По окончании окрасочных работ на портальной раме сквозных ферм и на вертикальном листе сплошных главных балок должна быть поставлена дата окраски. В Книгах искусственного сооружения указываются дата окраски, тип и марка лакокрасочных материалов, условия окраски, способы очистки и окраски.

8.3.14. Во время производства окрасочных работ должен вестись журнал, в котором делают приемочные записи по этапам работ.

8.3.15. Элементы проезжей части, фасонки и другие сильно ржавеющие детали мостов рекомендуется защищать от коррозии комбинированными металлизационно-лакокрасочными покрытиями: металлизация с последующим нанесением пропитывающего слоя лакокрасочного материала. Срок службы таких комбинированных цинковых, алюминиевых или цинко-алюминиевых покрытий толщиной 200 мкм в сочетании с нанесенным пропитывающим слоем лакокрасочных материалов составляет не менее 50 лет.

8.3.16. Общую приемку окраски проводят спустя двое суток после нанесения последнего слоя. При визуальном осмотре определяются дефекты — потеки краски, образование складок, пузырей, трещин и сетки, ряби и пр. Приборами неразрушающего контроля проверяется общая толщина лакокрасочного покрытия и адгезия к стали.

8.3.17. Места проведения окрасочных работ должны быть оборудованы средствами пожаротушения в соответствии с установленными нормами и табличками с указанием ответственного лица за пожарную безопасность.

8.3.18. В процессе эксплуатации слабые заклепки и возникновение трещин могут наблюдаться:

в прикреплениях раскосов, работающих на знакопеременные усилия, и шпренгелей преимущественно в верхних узлах ферм при прикреплении элементов односрезными заклепками (трещины образуются по первому или второму ряду заклепок);

в прикреплениях подвесок к верхним узлам;

в прикреплениях и пересечениях гибких элементов (плоских раскосов, диагоналей связей);

в прикреплениях продольных балок и их консолей к поперечным балкам, а также в рыбках;

в вертикальных и горизонтальных полках верхних поясных уголков продольных балок пролетных строений со сплошной стенкой и верхних поясах сквозных ферм (при опирании мостовых брусьев непосредственно на пояса);

в полках уголков и горизонтальных листах в местах разрывов продольных балок;

в прикреплениях соединительной решетки элементов;

в местах опирания продольных балок на поперечные и поперечных балок на пояса ферм при этажной проезжей части, в том числе в горизонтальных полках поясных уголков;

в опорных узлах пролетных строений.

8.3.19. Качество заклепок нужно проверять путем наружного осмотра и простукивания. Для слабых заклепок характерны подтеки ржавчины и трещины в краске. Особое внимание следует обращать на состояние головок заклепок в верхних горизонтальных поясах балок проезжей части при езде на мостовых брусьях. Усталостные разрушения заклепок происходят и в уголках прикреплений продольных балок к поперечным при отсутствии рыбок.

8.3.20. Все слабые заклепки подлежат замене на высокопрочные болты. После замены заклепок на высокопрочные болты необходимо проверить состояние расположенных рядом заклепок и, в случае расстройства, также заменить их на болты. Головки вновь поставленных болтов должны быть загрунтованы и окрашены. Замена заклепок в несущих элементах должна быть зафиксирована в Книге искусственного сооружения с указанием даты, количества и места замены.

8.3.21. При замене слабых заклепок в прикреплении, имеющем до 10 заклепок, допускается одновременно удалять не более одной заклепки, а в прикреплении с большим количеством заклепок — не более 10% общего числа заклепок данного прикрепления. Возможность одновременной замены большего числа заклепок должна быть подтверждена расчетом.

8.3.22. Головки дефектных заклепок, во избежание расшатывания смежных заклепок и порчи металла, рекомендуется удалять газовой резкой, высверливанием или фрезерованием. Стержень заклепки выбивается или высверливается. Замену заклепок производят в интервале между движением поездов.

8.3.23. В сварных конструкциях трещины могут возникать и развиваться как в сварных швах, так и в основном металле вблизи швов. Особо тщательно нужно осматривать места наиболее вероятного появления трещин. Местоположение и типы усталостных трещин, приведены в таблице 4.

Таблица 4

Типы усталостных трещин в элементах

металлических пролетных строений железнодорожных мостов

Тип	Местоположение трещин	Тип ПС
Т-1	В швах прикрепления распорок поперечных связей к фасонкам	проекты с 1940 по 1950 год
Т-2	В металле верхних горизонтальных фасонок поперечных связей с началом от трещины Т-1	проекты с 1940 по 1950 год
Т-3	В сварных швах прикрепления фасонок продольных связей к верхнему поясу главной балки	проекты с 1940 по 1950 год
Т-4	В швах прикрепления вертикальных ребер жесткости к верхним поясам балок или к «сухарикам»	проекты с 1940 по 1950 год, N 541, 821, 690
Т-5	На концах швов, прикрепляющих диагонали к фасонкам верхних продольных связей	проекты с 1940 по 1950 год
Т-6	В швах соединений горизонтальных и вертикальных ребер жесткости	проекты с 1940 по 1950 год, N 541, 821, 739
Т-7	В металле верхних фасонок поперечных связей от концов швов прикрепления распорок к фасонкам	проекты с 1940 по 1950 год
Т-8	В вертикальных ребрах жесткости у нижних концов фасонок поперечных связей	проекты с 1940 по 1950 год
Т-9	В стенках главных продольных балок у верхних концов швов приварки вертикальных ребер жесткости	проекты с 1940 по 1950 год, N 541, 821, 690
Т-10	В стенках главных продольных балок у нижних концов швов вертикальных ребер жесткости	N 541, 821, 690, 563, 1062
Т-11	В вертикальных ребрах жесткости от концов наружных швов прикрепления горизонтальных ребер к вертикальным ребрам жесткости	N 541, 821
Т-12	В вертикальных ребрах жесткости у верхнего пояса балки, начинаются от закругленной части выреза в ребре и распространяются под углом 45°	N 541, 821
Т-13	В стенках главных балок по линии сплавления шва прикрепления верхнего пояса к стенке балки у вертикальных ребер жесткости	N 821, 739, 563
Т-14	В верхних поясах главных балок и продольных балок проезжей части вдоль шва прикрепления вертикального ребра жесткости	N 541, 690
Т-15	В стенках главных балок в уровне нижнего болта прикрепления уголков опорного ребра жесткости, развиваются параллельно нижнему поясу	N 563
Т-16	В стенках главных балок у опорного ребра жесткости по линии сплавления нижнего поясного шва	N 563
Т-17	В стенках продольных балок в месте прикрепления их к поперечной балке проезжей части по линии сплавления верхнего поясного шва	N 563
Т-18	В стенках домкратных балок у верхнего и нижнего поясов, развиваются от вырезов в стенке в зоне шва прикрепления пояса по металлу стенки под углом 45° к поясу	N 541, 821
Т-19	В горизонтальных фасонках прикрепления опорных поперечных балок к нижним поясам главных балок, появляются у конца нижнего пояса поперечной балки и развиваются под углом до 45° к поясу с выходом на край фасонки	N 563
Т-20	В фасонках, расположенных в местах пересечения диагоналей нижних продольных связей главных ферм, развиваются параллельно торцу одной из половин составной диагонали от ближнего к этому торцу болта ее прикрепления к фасонке либо вдоль торца	N 690
Т-21	В продольных швах соединений листов составных верхних поясов балок, обычно появляются с внутренней стороны поясов у вертикальных ребер жесткости	N 821
Т-22	В стенках поперечных балок проезжей части в местах прикрепления балок к узлам ферм от выреза у нижнего пояса, развиваются под углом 45° к нижнему поясу	N 690
Т-23	В стенках поперечных балок проезжей части, начинаются от выкружки в стенке в месте прикрепления верхнего пояса балки к ферме и развиваются под углом 45° к верхнему поясу	N 690
Т-24	В уголках — подвесках прикрепления смотровых трапов к нижнему поясу продольных балок у сварных швов прикрепления уголков к поясу продольной балки или к поручням	N 1062
Т-25	В верхнем поясе поперечной балки под продольным ребром жесткости, растет симметрично в обе стороны от оси стенки ребра на 15 — 20 мм и поворачивает в металл пояса поперечной балки под углом 45°	N 1298
Т-26	В нижнем поясе продольного ребра жесткости ортотропной плиты вдоль углового шва прикрепления нижнего пояса к вертикальной стенке ребра по линии сплавления шва с металлом нижнего пояса	N 1298
Т-27	В стенках поперечных балок проезжей части, начинаются от выкружки в стенке в месте прикрепления верхнего или нижнего пояса балки к ферме и развиваются по линии сплавления шва прикрепления верхнего пояса к стенке балки, могут выходить на основной металл стенки	N 690, 690К, 930, 1293
Т-28	В сварных швах прикрепления вертикальных фасонных листов-«косынок» к верхним горизонтальным листам поперечных балок, могут выходить на основной металл «косынки»	N 690К, 1293
Т-29	В стенках распорок поперечных связей между продольными балками проезжей части, начинаются от выкружки у нижнего пояса и развиваются под углом 45° к нижнему поясу	N 1062
Т-30	В стенках распорок поперечных связей между продольными балками проезжей части, начинаются от выкружки у верхнего пояса и развиваются под углом 45° к поясу	N 1062
Т-31	Вдоль краев угловых сварных швов, прикрепляющих торец продольного ребра к стенке поперечной балки. Возможно появление усталостных трещин по основному металлу от кромки продольного ребра в зоне выкружки на примыкании к поперечной балке и от кромки листа в местах радиального перехода поперечной балки к вертикальному ребру (в случае отсутствия обечайки)	ПС с одноярусной ортотропной плитой с продольными ребрами, примыкающими к поперечной балке
Т-32	По краю углового сварного шва, соединяющего стенки продольной и поперечной балок и в стыковом шве, соединяющем их нижние окаймляющие листы	ПС с ортотропной плитой с продольными
Т-33	По продольному ребру от свободной кромки по основному металлу и далее вдоль углового сварного шва, соединяющего ребро со стенкой поперечной балки. По стенке поперечной балки от конца углового сварного шва, присоединяющего стенку продольного ребра вдоль самого шва, иногда с ответвлением в основной металл стенки	ПС с ортотропной плитой, имеющей продольные ребра, пропущенные сквозь поперечную балку через вырез с

8.3.24. Выявление трещин в металле осуществляется визуальным осмотром, в необходимых случаях — с использованием лупы и специальных микроскопов, а также с помощью дефектоскопов. Предприятием ведутся реестры усталостных повреждений в элементах металлических болтосварных пролетных строений, в которые заносятся все выявленные повреждения в пролетном строении. При отсутствии повреждений, в реестре делается запись «Повреждений не обнаружено». Реестр прикладывается к книге искусственного сооружения.

8.3.25. При осмотре необходимо обращать внимание на трещины в краске, подтеки и следы проступающей ржавчины, являющиеся косвенными признаками появления трещин в металле. Такие места должны быть очищены от краски и осмотрены с применением лупы или микроскопа. В случае сомнения в наличии трещины необходимо узким острым зубилом срубить тонкую стружку с поверхности металла по направлению предполагаемой трещины. Раздваивание стружки подтверждает наличие трещин в данном месте. При работе с зубилом нельзя допускать зарубок металла. Очищенные от краски участки металла, а также металл в местах образования усталостных трещин рекомендуется окрасить светлой краской для облегчения последующих наблюдений.

8.3.26. Места наиболее вероятного появления трещин при каждой окраске металлических конструкций необходимо очищать от старой краски до металла (независимо от состояния окрасочного слоя) и тщательно осматривать.

8.3.27. Все выявленные в металлических пролетных строениях и опорах дефекты, снижающие прочность и устойчивость элементов конструкции — трещины, повреждения соединительной решетки сжатых элементов (отрыв диагоналей) и другие подобные дефекты, должны быть, немедленно устранены. Влияние других повреждений на прочность и устойчивость элементов конструкции при необходимости устанавливается расчетом, и если они не снижают требуемой грузоподъемности, то могут быть устранены в плановом порядке.

8.3.28. Поверхностные дефекты и острые подрезы на глубину до 2 мм необходимо исправить плавной зачисткой металла с помощью шлифовальной машинки. Глубина подреза на торце стыкового шва определяется по изготовленному макрошлифу.

8.3.29. За усталостными трещинами длиной до 20 мм необходимо установить наблюдение. Усталостные трещины длиной более 20 мм для прекращения их дальнейшего развития должны быть локализованы засверливанием по концам на всю толщину поврежденного металла сверлом диаметром 23 мм с раззенковкой и установкой в эти отверстия высокопрочных болтов диаметром 22 мм с двухсторонними шайбами и натяжением 20 тонн. При этом центр отверстия должен располагаться на расстоянии половины диаметра сверла за концом трещины. Отверстие следует раззенковывать с обеих сторон на глубину 2 — 3 мм.

8.3.30. За засверленными трещинами необходимо установить наблюдение, и, в случае их дальнейшего развития, производить повторную локализацию либо усиление конструкции по проекту.

8.3.31. Устранение трещин может быть выполнено пайкой в соответствии с утвержденной методикой. Ликвидированная таким образом трещина не учитывается при оценке технического состояния сооружения, не снижает ее.

8.3.32. Треснувшие уголки прикрепления продольных балок к поперечным подлежат замене новыми. Трещины в поясных уголках продольных балок следует перекрывать уголковыми накладками; при большом числе трещин поясные уголки нужно заменять.

8.3.33. Для предупреждения появления усталостных трещин в пролетных строениях необходимо производить усиление элементов, имеющих низкую грузоподъемность с учетом выносливости.

8.3.34. При обследовании соединений и прикреплений элементов на высокопрочных болтах, а также высокопрочных болтов в смешанных клепано-болтовых и болтосварных соединениях надлежит обращать внимание на состояние головок болтов, гаек и шайб. Высокопрочные болты со следами сварных швов или прихваченные сваркой подлежат замене. Резьба болтов должна выступать за пределы гайки не менее, чем на один виток.

8.3.35. При обследовании высокопрочных болтов в прикреплениях продольных балок к поперечным в конструкции без рыбок наряду с состоянием головок болтов, гаек и шайб следует проверять затяжку болтов в крайних рядах прикреплений. В этих местах высокопрочные болты проверяются и затягиваются до расчетного усилия. В других соединениях проверку натяжения болтов следует производить только при возникновении сомнений в достаточности их натяжения (наличие трещин в краске по торцам элементов и по периметру шайб, потеков ржавчины из-под шайб).

8.3.36. В сквозных пролетных строениях необходимо следить за прямолинейностью и жесткостью элементов ферм. При этом особое внимание следует обращать на состояние соединительной решетки (планок) и их прикреплений в сжатых и сжато-вытянутых элементах.

8.3.37. Если стрела искривления сжатых и сжато-вытянутых элементов превышает для двухстенчатых элементов 1/30 высоты сечения элемента в плоскости фермы и 1/15 — из плоскости фермы, для одностенчатых сечений 1/30 высоты сечения, как в плоскости, так и из плоскости фермы, а растянутых элементов — более 1/10 высоты сечения, то необходимость их выправления или усиления определяется на основании расчета.

8.3.38. За искривленными элементами и состоянием соединительной решетки в них должны быть установлены наблюдения, результаты которых записываются в Книгу искусственного сооружения.

8.3.39. Дефектные и слабые элементы соединительной решетки должны заменяться при отсутствии поезда поочередно по одной диагонали, распорке или планке. При внезапном выпучивании, например, вследствие механических повреждений сжатого раскоса, должны приниматься немедленные меры по временному усилению и замене деформированного элемента.

8.3.40. В связях между фермами необходимо проверять прямолинейность элементов и состояние прикреплений. Особое внимание на связи и их прикрепления следует обращать при наличии значительных колебаний пролетных строений и самих связей при проходе поездов. Искривленные элементы связей (если стрела превышает 1/300 длины хорды) должны быть выправлены, а при необходимости — усилены.

8.3.41. В сталежелезобетонных пролетных строениях необходимо следить за состоянием бетона плиты балластного корыта, сопряжением плиты с металлической конструкцией, обращая особое внимание на неисправности снижающие грузоподъемность пролетных строений: недостаточная прочность бетона швов омоноличивания плиты, частичное или полное разрушение бетона швов, трещины и зазоры по контакту между бетоном омоноличивания швов и блоками железобетонных плит заводского изготовления, разрушение объединения выпусков продольной арматуры блоков, продольные трещины по контакту между бетоном плиты и поясом металлической балки, сколы бетона в местах установки гибких упоров.

8.3.42. При обнаружении в указанных местах трещин и других повреждений нужно произвести обследование пролетных строений мостоиспытательной станцией с расчетом грузоподъемности.

8.3.43. Плиты, не включенные в совместную работу, должны быть надежно прикреплены и плотно оперты на пролетные строения. При осмотре таких конструкций, помимо состояния плит, необходимо обращать внимание на коррозию металла в местах опирания плит.

8.3.44. О выявленных дефектах в металлических пролетных строениях и опорах делаются записи в Книге искусственного сооружения с указанием наименования, местоположения, характеристики дефектов и принятых мерах. Для трещин указываются длина, направление и местоположение на прилагаемой схеме.

8.3.45. Для последующего наблюдения дефектные места обводят по контуру масляной краской и нумеруют, отмечают границы распространения трещин и указывают дату осмотра. Отметку и нумерацию краской делают рядом с повреждением не закрашивая его.

8.3.46. В металлических трубах необходимо обращать особое внимание на состояние металла и не допускать образования очагов коррозии.

8.3.47. В гофрированных трубах, кроме того, необходимо следить за состоянием металла в районе болтовых соединений, где могут появиться трещины и разрывы, а также за состоянием защитных покрытий, особенно в агрессивных средах, и лотков внутри трубы. Выявленные дефекты должны своевременно устраняться. Необходимо следить за состоянием болтовых соединений, не допускать их раскручивания.

8.3.48. При массовых разрывах металла трубы подлежат переустройству.

8.4. Железобетонные, бетонные и каменные сооружения

и конструкции

8.4.1. При содержании железобетонных, бетонных и каменных пролетных строений и опор особое внимание должно быть обращено на предупреждение застоя воды в балластных корытах, на подферменных площадках и в других местах, обеспечение исправного состояния гидроизоляции, защиту арматуры от ржавления, предупреждение образования и развития трещин и других повреждений.

8.4.2. Поверхности сооружений, на которых может застаиваться вода, должны иметь продольные и поперечные уклоны, обеспечивающие сток воды непосредственно или через водоотводные приспособления — трубки, желоба, дренажи. Если уклоны для отвода воды отсутствуют или недостаточны, при ремонте сооружений нужно увеличить уклоны не менее чем до .

8.4.3. Подферменные площадки опор должны иметь сливы с уклоном не менее , которые надлежит содержать в чистоте и исправности.

8.4.4. Долговечность эксплуатируемых пролетных строений в значительной мере зависит от состояния водоотвода из балластных корыт. Водоотводные трубки во избежание засорения и заполнения льдом должны иметь диаметр не менее 150 мм, без колен и перегибов. Для возможности осмотра и очистки они должны располагаться вне путевой решетки, а сверху закрываться колпаками, обкладываемыми крупным щебнем или галькой.

8.4.5. Водоотводным трубкам и желобам должны быть приданы соответствующие направления и вынос, чтобы вытекающая вода не смачивала и не загрязняла наружных поверхностей сооружений. Трубки должны выходить из конструкции не менее чем на 150 мм. Для предупреждения смачивания и загрязнения пролетных строений водой, стекающей с поверхности балластного слоя, в нижней части бортиков необходимо устраивать «слезники».

8.4.6. Воду из насыпи за устоями с обратными стенками и при необходимости в других случаях отводят при помощи дренажей, которые должны содержаться в исправном состоянии. При наличии застоев воды за устоями, появлении на кладке устоев мокрых пятен и потеков, пучения грунта за устоями необходимо в плановом порядке принимать меры к обеспечению нормального водоотвода путем замены загрязненного грунта на дренирующий, восстановления или устройства новых дренажей. Балластному корыту в пределах обратных стенок должен быть придан уклон в сторону насыпи.

8.4.7. Для предупреждения проникания влаги все внутренние поверхности балластных корыт пролетных строений и опор мостов должны быть защищены надежной гидроизоляцией. Гидроизоляция должна быть водонепроницаемой, прочной и эластичной (не должна повреждаться при деформации конструкции от нагрузки, изменений температуры), морозостойкой и теплостойкой, долговечной и стойкой от агрессивных загрязнителей.

8.4.8. Особое внимание при содержании и ремонте гидроизоляции должно быть уделено ее сопряжению с водоотводными трубками. В местах, где гидроизоляцией перекрывают деформационные швы, нужно устраивать компенсаторы, обеспечивающие сплошность изоляции.

8.4.9. В каменных мостах с засыпкой между щековыми стенками изоляцией покрываются внутренние поверхности свода или бетонного заполнения над ними и поверхности стенок.

8.4.10. Наружные поверхности бетонных и железобетонных пролетных строений и опор, не покрытые гидроизоляционным слоем или гидрофобным бетоном, рекомендуется окрашивать специальными красками для бетона.

8.4.11. Поверхности балластных корыт, на которые укладывается новый гидроизоляционный слой, должны иметь уклон не менее для обеспечения стока воды к водоотводным устройствам.

8.4.12. Для предохранения от механических повреждений гидроизоляционный слой балластных корыт должен быть покрыт защитным слоем.

8.4.13. В случае обнаружения на поверхности конструкций мокрых пятен, потеков выщелачивающегося раствора или иных следов просачивания влаги должны быть выяснены причины обводнения (путем вскрытия балластного слоя, закладки шурфов) и в плановом порядке провести мероприятия по их устранению и ремонту поврежденных участков.

8.4.14. Замена и ремонт гидроизоляции на сооружении должны производиться в соответствии с проектом.

8.4.15. В железобетонных и бетонных конструкциях мостов могут возникать силовые, усадочные и температурные трещины, а также трещины, вызванные коррозией арматуры. При содержании железобетонных и бетонных конструкций мостов, имеющих трещины, необходимо руководствоваться следующим:

силовые трещины в растянутой зоне конструкций из обычного железобетона раскрытием до 0,1 мм (отдельные трещины — до 0,2 мм), а также усадочные трещины раскрытием до 0,2 мм в бетонных и железобетонных конструкциях не представляют опасности для прочности и долговечности конструкции. При большом количестве трещин следует производить окраску наружных поверхностей конструкций;

за силовыми трещинами в растянутой зоне конструкции из обычного железобетона раскрытием более 0,2 мм, а также за всеми трещинами, заходящими в сжатую зону, должны быть установлены наблюдения, выполнен перерасчет грузоподъемности конструкции, по результатам которого решен вопрос об их ремонте, усилении или замене;

наличие поперечных трещин в растянутой зоне предварительно напряженных железобетонных конструкций указывает на недостаточность или потерю предварительного напряжения. Такие конструкции должны быть обследованы мостоиспытательной станцией или другой специализированной организацией на предмет возможности дальнейшей эксплуатации;

при наличии трещин, вызванных ржавлением арматуры (трещины располагаются вдоль арматуры), в случае достаточной прочности защитного слоя необходимо принимать меры по предупреждению доступа влаги к арматуре путем нанесения на поверхность гидроизоляционных покрытий с предварительной заделкой трещин;

при появлении в опорных узлах пролетных строений и в оголовках опор температурных трещин, вызываемых обычно недостаточной подвижностью опорных частей, необходимо принимать меры по увеличению их подвижности, ремонту опор, а при необходимости, устройству на опорах железобетонных поясов;

усадочные (температурно-усадочные трещины) раскрытием до 0,2 — 0,3 мм не представляют опасности для прочности конструкций. Для исключения негативного влияния попадания влаги в бетон и к арматуре такие трещины должны быть подвергнуты поверхностной герметизации (окраске).

8.4.16. При появлении трещин в пролетных строениях или опорах следует выяснить причины их образования. Для этого в необходимых случаях должны быть установлены регулярные наблюдения за трещинами с измерением их раскрытия и протяженности, а также с постановкой маяков. Наблюдения за трещинами, включая маяки, осуществляется не реже 1 раза в месяц до их ремонта или заключения обследования сооружения мостоиспытательной станцией, в котором указано об изменении порядка наблюдений. В зависимости от характера трещин и причин их появления должны быть выполнены ремонтные работы.

8.4.17. Трещины, за которыми установлены наблюдения (поставлены маяки), должны быть пронумерованы и зарисованы на эскизных чертежах конструкции с указанием размеров трещин (длины, величины раскрытия). Эскизы прикладываются к Книге искусственного сооружения, в которой, кроме того, должны быть указаны время появления трещин, дата установки маяков, температура воздуха, при которой измерялась величина раскрытия трещин. На самом сооружении масляной краской отмечают границы распространения трещин с указанием даты. Изменения, выявленные при дальнейших наблюдениях, должны отмечаться в Книге искусственного сооружения, на эскизах и самом сооружении.

8.4.18. Наблюдения за трещинами следует производить при помощи микроскопа с измерительной шкалой, щелемеров и других приборов. Для определения глубины и характера распространения трещин необходимо производить тщательное исследование кладки посредством щупов, вскрытия облицовки, нагнетания подкрашенных жидкостей. На больших мостах необходимо периодически обследовать подводную часть опор.

8.4.19. Если причиной появления трещин являются деформации опор, необходимо исследовать основание сооружения посредством бурения, заложения штолен, шурфов.

8.4.20. Если причиной образования трещин в опорах является слабость облицовки, недостаточная перевязка ее с бутовой кладкой или слабость материала кладки, необходимо в зависимости от характера и степени повреждения производить цементацию кладки, торкретирование по металлической сетке, частичную перекладку облицовки, устройство железобетонных прокладных рядов, железобетонных рубашек или поясов, перекладку всей поврежденной части сооружения.

8.4.21. При появлении трещин в устое вследствие пучения грунта между обратными стенками, кроме ремонта кладки, необходимо заменить засыпку дренирующим материалом с устройством или восстановлением дренажей за устоем.

8.4.22. Опоры из бетонных блоков при наличии развивающихся трещин в швах и самих блоках необходимо отремонтировать посредством расшивки швов, заделки трещин в блоках, цементации кладки и устройства железобетонных поясов или сплошной железобетонной рубашки. В случае стабилизированных трещин, не увеличивающихся в течение ряда лет, можно ограничиться тщательной расшивкой швов и заделкой трещин.

8.4.23. В случае существенного поверхностного разрушения облицовки, бетонной (бутовой) кладки опор, щековых стен и сводов арочных мостов необходимо выполнить ремонт поврежденных участков. Если бутовая кладка опор и массивных мостов имеет пустоты, трещины, недостаточно связана раствором или произошло выщелачивание цементного камня из раствора, следует произвести инъектирование (цементацию) кладки.

8.4.24. Подферменники с трещинами и сколами, расположенными в пределах распределения давлений от опорных частей, подлежат замене новыми или укреплению железобетонными или металлическими обоймами. В качестве временной меры разрешается устанавливать объемлющие металлические хомуты. В случае отсутствия на опорах железобетонных оголовков при замене или усилении подферменников рекомендуется устройство сплошной железобетонной плиты (прокладного ряда).

8.4.25. При содержании железобетонных мостов со сборными пролетными строениями и опорами необходимо обращать внимание на состояние омоноличенных стыков элементов. Появление здесь трещин, сколов, разрушение бетона может указывать на недостатки конструкции, низкое качество производства работ или примененных материалов. Причины появления дефектов и эффективный способ их устранения устанавливаются на основании детального обследования и расчетов.

8.4.26. В пролетных строениях и опорах, при этапном бетонировании, не исключено появление трещин по швам бетонирования. При стабилизированном состоянии такие трещины раскрытием более 0,3 мм следует заделывать.

8.4.27. В зависимости от характера и степени развития трещин рекомендуется применять следующие способы ремонта конструкции:

при наличии поверхностных трещин раскрытием до 0,3 мм — нанесение защитных пленок и покрытий;

при наличии «дышащих» от нагрузки и изменения температуры трещин раскрытием более 0,3 мм — герметизацию (заполнение) трещин водонепроницаемым эластичным материалом;

при наличии сквозных не дышащих трещин раскрытием более 0,3 мм — прочностная заделка жестким составом;

усиление железобетонных пролетных строений внешним армированием ламинатов (пластин) или тканых полотен (холстов) с помощью полимерного клея.

8.4.28. Различного рода дефекты защитного слоя (обнаженная арматура, сколы бетона, раковины) рекомендуется заделывать полимеррастворами, полимербетонами, цементными растворами с подготовительным слоем из полимеррастворов. Допускается защита обнаженной арматуры от коррозии путем окраски.

8.4.29. В каменной кладке мостов необходимо своевременно производить расшивку швов. Наибольшему разрушению подвержен раствор швов в пределах колебания горизонта вод и в подводной части опор, особенно в районе ледорезов.

8.4.30. В балочных мостах между смежными пролетными строениями и между концами пролетных строений и шкафными стенками устоев должны быть зазоры, обеспечивающие перемещение пролетных строений при их работе и температурном расширении. Деформационные швы должны быть перекрыты сверху от просыпания балласта.

8.4.31. В железобетонных балочных пролетных строениях при осмотрах следует проверять: плотность опирания на опоры каждой из балок; наличие трещин и сколов бетона в опорных узлах балок вследствие их неравномерного опирания; наличие трещин в примыкании диафрагм к балкам и в самих диафрагмах, также вызываемых неравномерным опиранием пролетного строения на опоры и неудовлетворительным омоноличиванием диафрагм.

8.4.32. Пазухи сводов, а также надсводные части арочных мостов под балластным слоем должны быть заполнены бетоном, сухой кладкой или щебнем. Толщина щебеночной засыпки над верхом свода в замке, должна быть не менее 0,7 м.

8.4.33. Мероприятия по ремонту мостов с деформированными опорами устанавливаются проектом в зависимости от причин деформаций, конструкции и состояния сооружения. При морозном пучении опор необходимо проводить противопучинные мероприятия в виде обсыпок или утепления.

8.4.34. При общей деформации обделки тоннеля или местном ее выпучивании и появлении в обделке тоннелей или в конструкциях галерей трещин, при резком увеличении обводненности, а также при появлении других повреждений, должны быть приняты меры по обеспечению безопасности движения поездов (установка временных кружал для подкрепления неисправной обделки, усиление контроля за техническим состоянием неисправных участков).

8.4.35. Для осмотра тоннелей и галерей, устранения обнаруженных дефектов необходимо иметь в исправном состоянии передвижные подмости, оборудованные смотровыми площадками и электроосветительной арматурой с самостоятельным источником электроэнергии или проводкой, подключаемой к электросети сооружения.

8.4.36. На участках электрифицированных железных дорог указанные мероприятия осуществляются только после снятия напряжения с контактной сети.

8.4.37. В случае течи из швов для расшивки должен применяться расширяющийся цемент.

8.4.38. Трещины, появившиеся в обделке тоннелей или в конструкциях галерей, необходимо тщательно осмотреть, замерить и нанести на чертеж развертки тоннеля или конструкции галереи.

8.4.39. Устранение дефектов в каменных, бетонных и железобетонных конструкциях должно осуществляться в соответствии с технологией, утвержденной нормативно-техническим документом (приложение В к Инструкции, п. 11).

8.5. Деревянные сооружения и конструкции

8.5.1. При содержании деревянных мостов и опор особое внимание необходимо обращать на предупреждение появления и развития гнили в деревянных элементах путем антисептирования, тщательной очистки от загрязнения и своевременной заделки трещин, а также на состояние сопряжения всех элементов и строгое проведение противопожарных мероприятий.

8.5.2. Все деревянные мосты и опоры необходимо содержать в чистоте и не допускать наличия посторонних горючих предметов. Наиболее подвержены загрязнению прогоны в промежутках между мостовыми поперечинами, места примыкания подкосов к стойкам опор, врубки и связи.

8.5.3. Зимой деревянные мосты необходимо очищать от снега и льда.

8.5.4. Все деревянные элементы, должны быть антисептированы. Стальные части деревянных конструкций (накладки, тяжи, шайбы, головки и гайки болтов) должны быть защищены от коррозии окраской или покрытием битумом. Резьба на болтах должна быть смазана.

8.5.5. В деревянных мостах подвержены загниванию плохо проветриваемые места, в которых может задерживаться влага. Такими частями являются плоскости сопряжений в узлах и врубках, соприкасающиеся постели и торцы прогонов, стенки отверстий, швы в пакетах из брусьев, бревен и досок. Способствует загниванию древесины конденсация влаги на металле в местах контакта деревянных и металлических деталей.

8.5.6. В наиболее неблагоприятных условиях находятся детали опор деревянных мостов, подвергающиеся переменному увлажнению у горизонта воды и поверхности земли (сваи, нижние венцы ряжевых опор). Элементы деревянных опор мостов в относительно сухих песчаных грунтах могут загнивать на глубине до 2 м, в увлажненных и плотных грунтах до 0,5 м ниже уровня земли.

8.5.7. Для выявления гнили должны производиться: тщательный осмотр, отстукивание молотком и, в необходимых случаях, сверление отверстий обычным или пустотелым сверлом либо стеска верхних слоев деревянных элементов, подверженных гниению.

8.5.8. Поверхностную гниль в сваях, прогонах, подкосах, стойках и других элементах моста нужно стесывать до обнажения здоровой древесины; при наличии гнили глубиной более 10 — 20 мм и более 15% от площади поперечного сечения элемента возможность оставления его в конструкции должна быть проверена расчетом. После стески гнили свежая древесина должна быть покрыта антисептиком. При поражении элементов внутренней или недопустимой поверхностной гнилью должна быть произведена замена их новыми антисептированными элементами.

8.5.9. Трещины, в которых возможно скопление влаги, должны быть расчищены, обработаны антисептической пастой и зашпаклеваны. Для предупреждения развития трещин в необходимых случаях нужно ставить хомуты.

8.5.10. Антисептирование производится аналогично мостовым брусьям.

8.6. Опорные части

8.6.1. Железобетонные пролетные строения длиной до 10 м включительно опираются на плоские опорные части из металлических листов толщиной не менее 20 мм, при длине от 10 до 20 м — тангенциальные, а при длине более 20 м — катковые или секторные. Металлические пролетные строения пролетом до 10 м должны иметь плоские опорные части, при пролетах от 10 до 25 м — тангенциальные, а при пролетах более 25 м — катковые или секторные.

8.6.2. Использование шарнирно-катковых, опорных частей стаканного типа, сферических опорных частей устанавливается проектом.

8.6.3. Металлические пролетные строения длиной менее 5 м до их замены могут быть установлены на пропитанные антисептиком деревянные брусья.

8.6.4. Металлические пролетные строения временных мостов, в том числе устраиваемых при производстве работ по ремонту или переустройству сооружений, могут быть установлены на деревянные брусья не более чем в два яруса.

8.6.5. Опорные части должны содержаться в чистоте. Катки, плоскости катания и скольжения металлических опорных частей после предварительной очистки нужно натирать графитом. В зимнее время опорные части надлежит очищать от снега и льда. Для предупреждения загрязнения опорные части должны иметь футляры.

8.6.6. Опорные части должны находиться в исправном состоянии и правильном положении, а также плотно опираться на подферменники или подферменные площадки. Все анкера и болты, крепящие опорные части, должны быть плотно подтянуты.

8.6.7. Правильность расположения опорных частей выявляется обмером взаимного расположения опорных плит, балансиров, катков и самих опор, а также положения опорных частей на подферменниках. Величина отклонения оси верхнего балансира от оси опорной плиты плоских, тангенциальных, секторных, катковых и шарнирно-катковых подвижных опорных частей измеряется при помощи отвеса и стальной линейки или рулетки. Величина отклонения оси плиты скольжения от оси нижней анкерной плиты подвижной опорной части стаканного типа или сферической опорной части — по специальной шкале на опорной части. Результаты обмера опорных частей с приложением схемы и указанием температуры каждый раз должны фиксироваться в Книгах искусственных сооружений и сравниваться с предыдущими результатами.

8.6.8. При проверке положения подвижных опорных частей следует учитывать нормальное для данной температуры отклонение оси балансира от оси опорной плиты (отклонения оси плиты скольжения от оси нижней анкерной плиты) :

где — нормальное для данной температуры отклонение оси балансира от оси опорной плиты (при отклонении наружу пролета результат получается со знаком плюс, внутрь пролета — со знаком минус), мм;

— коэффициент линейного расширения стали и железобетона, равный 0,000012;

l — расчетный пролет балки или фермы (для неразрезного пролетного строения — расстояние до оси неподвижной опорной части), мм;

t — температура воздуха в момент проверки, °C;

t_о — температура, при которой оси балансира опорной плиты и центр катков должны совпадать, °C:

t_ср — среднее алгебраическое наивысшей t_max и наинизшей t_min годовых температур, °C;

— продольное перемещение подвижного конца фермы от временной нагрузки (приближенно ).

Знак плюс соответствует расположению опорных частей под нижними поясами ферм, а знак минус — под верхними поясами. Значения температуры подставляются в формулы со своими знаками (знак плюс — выше нуля).

Нормальное отклонение центра катков от оси опорной плиты определяется величиной .

При проверке правильности расположения опорных частей необходимо учитывать возможное несовпадение осей балансира и плиты при температуре t°.

8.6.9. В сферических опорных частях должны производиться замеры зазоров скольжения и зазоров поворота (рисунок 5). Места для выполнения замеров маркируются производителем. Если они не указаны на опорной части, следует их наметить краской в соответствии с положением зазоров контактирующих поверхностей в местах, где удобно и надежно проводятся замеры.

Рисунок 5. Схема измерения зазоров

на сферических опорных частях

8.6.10. Перечень мероприятий, в зависимости от величины зазора скольжения устанавливается производителем, в качестве справочных значений приведен в таблице 5.

Таблица 5

Перечень мероприятий для сферических опорных частей

в зависимости от величины зазора скольжения

Значение зазора скольжения, мм	Требуемые мероприятия
ЗС >= 1,0	измерения производить один раз в год
0,5 <= ЗС < 1,0	измерения производить два раза в год при периодических осмотрах
0,2 <= ЗС < 0,5	производится экспертная оценка технического состояния опорной части
ЗС < 0,2	приведение к норме или замена опорной части

8.6.11. В случае обнаружения смещений, превышающих нормальные отклонения, или других неисправностей опорных частей должны быть выяснены причины этих неисправностей и осуществлен соответствующий ремонт. Если состояние опорных частей вызвано деформацией опор, то мероприятия по ремонту, в зависимости от причин деформации опор, конструкции и состояния всего сооружения, устанавливаются проектом.

8.6.12. В случае неравномерного опирания отдельных катков, нарушения их подвижности, а также при появлении трещин в опорных плитах и балансирах неисправные элементы опорных частей следует заменить.

8.6.13. Катки при перекосах и угоне необходимо выправлять с установкой (в особенности при срезных катках) специальных противоугонных зубьев и планок в случае их отсутствия или повреждения. Срезанные фиксирующие болты следует заменять высокопрочными болтами.

8.6.14. При значительном смещении балансиров подвижных опорных частей относительно опорных плит (отклонениях оси плиты скольжения от оси нижней анкерной плиты) вследствие неправильной установки опорных частей или деформации опор необходимы передвижка опорных плит или балансиров подвижных опорных частей, продольная передвижка пролетного строения вместе с неподвижными опорными частями или без них, комбинация обоих приемов. После перестановки должно быть зафиксировано на чертеже положение всех опорных частей.

8.6.15. При наличии поперечного смещения пролетного строения на подвижном конце необходимо выяснить причины этого явления и произвести обратную передвижку пролетного строения с устройством или усилением по проекту реборд на балансирах, опорных плитах или катков опорных частей.

8.6.16. Неподвижные опорные части мостов в случае их сдвига по подферменнику необходимо закрепить анкерными болтами после передвижки пролетного строения в проектное положение.

8.6.17. Неплотное опирание опорных частей на подферменники должно быть устранено при помощи свинцовых, резиновых подкладок, подливкой цементного раствора под давлением, подсыпкой цемента или применением полимерцементных составов.

8.6.18. При упирании торцов главных балок, торцов ферм или консолей продольных балок в шкафные стенки устоев или в смежные пролетные строения, а также при недостаточном зазоре между ними, необходимо передвинуть пролетное строение или укоротить торцы ферм и балок, вырубить в кладке ниши.

8.7. Основания сооружений

8.7.1. По всем мостам, трубам и другим сооружениям, расположенным на многолетнемерзлых грунтах, в Книгах искусственных сооружений и карточках на основании проектной документации должен быть указан принцип использования таких грунтов:

принцип 1 — грунты основания используются в мерзлом состоянии в течение всего периода эксплуатации;

принцип 2 — грунты основания используются в оттаявшем или оттаивающем состоянии.

8.7.2. При содержании мостов и труб на многолетнемерзлых грунтах, используемых по принципу 1, необходимо следить за температурой грунтов, а также за исправностью имеющихся охлаждающих установок. Для наблюдения за состоянием грунтов привлекаются инженерно-геологические базы (мерзлотные станции). Измерения температуры необходимо производить не реже одного раза в год (при осеннем осмотре), при наличии деформаций — не реже двух раз в год в период их максимального промораживания и максимального оттаивания, с записью результатов в ведомости, вкладываемые в Книги искусственных сооружений. Кроме измерения температуры грунтов основания, необходимо производить нивелировку опор для выявления возможных просадок или кренов, а также нивелировку лотков труб. Нивелировку опор необходимо производить по четырем точкам на каждой опоре относительно неподвижного репера, а лотков труб — по концам трубы, оси пути и не менее чем в двух промежуточных точках.

8.7.3. В случае повышения в течение ряда лет температуры вечномерзлых грунтов или нарастающих осадок и кренов опор необходимо принимать меры по восстановлению и сохранению вечномерзлого состояния грунтов основания по проекту.

8.7.4. При содержании сооружений на многолетнемерзлых грунтах, используемых по принципу 1, не должно допускаться застоя воды под мостами и у оголовков труб, способствующего оттаиванию грунтов основания.

8.7.5. При заложении труб и опор мостов на просадочных грунтах, а также в условиях развития опасных геологических процессов и явлений, ежегодно необходимо производить нивелировку опор мостов и лотков труб.

8.8. Эксплуатационные обустройства

8.8.1. Для укрытия людей при проходе поездов, размещения противопожарного инвентаря, а также механизмов, оборудования и материалов при производстве ремонтных работ на мостах длиной свыше 50 м должны устраиваться убежища. Убежища на мостах должны располагаться через 50 м с каждой стороны пути в шахматном порядке (при длине моста от 50 до 100 м убежища располагают в середине моста с каждой стороны пути).

8.8.2. На участках со скоростью движения пассажирских поездов более 140 км/ч и в северных условиях расстояние между убежищами должно быть 25 м. Допускается сохранить существующие расстояния между убежищами 50 м при условии разработки для каждого моста специальных мер техники безопасности, утверждаемых руководителем подразделения.

8.8.3. Ниши должны быть во всех тоннелях длиной более 50 м, а камеры — в тоннелях длиной более 300 м. Ниши и камеры располагаются с каждой стороны пути в шахматном порядке, соответственно через 60 и 300 м. В тоннелях длиной от 50 до 100 м допускается устройство по одной нише с каждой стороны пути, а в тоннелях длиной от 300 до 400 м — одной камеры в середине тоннеля. Ниши и камеры должны быть обрамлены побелкой или плитками белого цвета для облегчения их отыскания.

8.8.4. При достаточном габаритном очертании вместо ниш и убежищ устраиваются балконы с перильным ограждением на протяжении всего тоннеля. Для схода и захода на балкон устраиваются лестничные площадки, которые располагаются через 30 м.

8.8.5. Для возможности осмотра всех частей пролетных строений, видимых поверхностей опор, тоннелей и труб, а также внутренних поверхностей пустотных конструкций должны быть смотровые приспособления в виде лестниц, перильных ограждений, люлек, специальных устройств на плавсредствах, железнодорожном или автодорожном ходу.

8.8.6. Подферменные площадки устоев и оголовки или ригели промежуточных опор, с которых производится осмотр, и выполняются работы по содержанию и ремонту опорных частей и других элементов мостов, при высоте опор более 3 м над землей или водой должны быть ограждены перилами высотой не менее 1,1 м. При недостаточных размерах подферменных площадок, оголовков или ригелей для указанных целей в случае невозможности использования других средств должны устраиваться смотровые приспособления (балконы) в верхней части опор. Для спуска с мостового полотна наверх опор или на балконы должны быть постоянные или переносные лестницы.

8.8.7. Для осмотра пролетных строений мостов должны быть переносные лестницы (для мостов высотой не более 5 м), настилы внутри пролетных строений при езде поверху, переносные люльки, откидные платформы, передвижные тележки. Пролетные строения с ездой понизу должны иметь перила по верхним поясам ферм и лестницы с перилами по опорным раскосам или стойкам.

8.8.8. Устройство и эксплуатация смотровых приспособлений, находящихся на электрифицированных участках, осуществляются в соответствии с требованиями по электробезопасности.

8.8.9. У каждого мостового сооружения или трубы при высоте насыпи свыше 2 м следует устраивать по откосам один, а при необходимости два постоянных лестничных схода.

8.8.10. Не реже одного раза в год при очередном периодическом осмотре необходимо проверять исправность всех постоянных смотровых приспособлений (смотровые тележки, лестницы, перила и т.п.) с отражением результатов в акте.

8.8.11. На деревянных мостах и на мостах с ездой на деревянных поперечинах необходимо иметь противопожарные средства в виде бочек с водой вместимостью 200 л и ящиков с песком вместимостью 0,25 м³, а на охраняемых мостах, кроме того, огнетушители, гидропульты и другие специальные противопожарные приспособления.

8.8.12. На однопутных и двухпутных металлических и железобетонных мостах длиной от 10 до 25 м с ездой на деревянных поперечинах устанавливают одну бочку на конце моста; при длине мостов более 25 м — по одной бочке на концах моста и по одной бочке на каждые 50 м длины моста. На однопутных и двухпутных мостах длиной от 5 до 15 м с деревянными пролетными строениями или деревянными опорами устанавливают одну бочку на конце моста; при длине моста более 15 м — по одной бочке на концах и по одной бочке на каждые 25 м длины моста. Бочки устанавливаются на площадках-убежищах, а при отсутствии убежищ — на специальных помостах.

8.8.13. При отсутствии или пересыхании в летнее время водотока у деревянных опор устанавливают бочки с водой по одной на каждые 25 м длины моста.

8.8.14. Кроме бочек с водой, на металлических и железобетонных мостах длиной более 25 м с ездой на деревянных поперечинах и на деревянных мостах длиной более 15 м ставят ящики с песком на площадках, располагаемых по длине моста между площадками для бочек. Ящики с песком должны иметь крышки на петлях. Песок в ящиках должен быть сухим.

8.8.15. На путепроводах над электрифицированными участками взамен бочек с водой должны быть поставлены ящики с песком.

8.8.16. На пешеходных мостах с деревянным настилом устанавливают ящики с песком по одному на каждые 50 м длины моста (со сходами).

8.8.17. В зимний период бочки должны быть пустыми, а в остальное время — наполнены водой. В засушливых и безводных районах на металлических и железобетонных мостах длиной до 25 м с ездой на деревянных поперечинах, а также на деревянных мостах длиной до 15 м и у деревянных опор допускается вместо бочек с водой устанавливать ящики с песком вместимостью 0,25 м³.

8.8.18. На мостах с деревянными пролетными строениями пространство между контррельсами или между специальными брусками должно быть покрыто дощатым настилом и засыпано щебнем или гравием, а пространство между путевым рельсом и контррельсом (или бруском) покрыто полосовой сталью. На мостах с металлическими пролетными строениями на деревянных опорах указанные покрытия необходимо устраивать над всеми опорами и в обе стороны от них на расстоянии 2 — 5 м (в зависимости от высоты опоры).

8.8.19. На охраняемых мостах, помимо бочек с водой и ящиков с песком, должны быть следующие противопожарные средства: химические огнетушители, устанавливаемые в специальных деревянных ящиках на концах моста и через каждые 100 м его длины; гидропульты (или ведра) — по одному на каждые 200 м длины моста, но не менее одного на пост охраны; противопожарный инвентарь (не менее чем по две штуки): лопаты, ломы, топоры, багры, а также ведра с веревкой и блоком для пополнения воды в бочках. Указанный инвентарь должен храниться на щитах у моста. В зимнее время огнетушители и гидропульты необходимо переносить в теплое помещение.

8.8.20. На охраняемых мостах через реки необходимо иметь спасательные приспособления — спасательные круги, шары, веревки, а также лодки и катера (в зависимости от ширины реки и скорости течения).

8.8.21. В помещениях охраны мостов (тоннелей) и мостовых обходчиков должна быть прямая телефонная связь с ближайшей станцией и с поездным диспетчером.

8.8.22. Линии связи и другие железнодорожные коммуникации должны прокладываться на специальных мостиках, защищены от повреждения коробами и обеспечивать возможность беспрепятственного производства работ по ремонту и содержанию сооружений. Расположение коммуникаций внутри пролетных строений, на опорах, тротуарах и перильных ограждениях не допускается.

8.8.23. На эксплуатируемых мостах не допускается прокладка нефтепроводов, нефтепродуктопроводов, газопроводов, канализационных трубопроводов, тепловых сетей и водопровода, а также не связанных с работой железных дорог линий электропередачи и связи.

8.8.24. Искусственные сооружения, на которых установлены опоры контактной сети или находятся узлы крепления проводов контактной сети, питающих или отсасывающих линий тягового электроснабжения, а также линии электропередачи напряжением свыше 1000 В, должны быть заземлены в соответствии с требованиями действующих руководящих документов.

8.8.25. Заземлению подлежат также отдельно стоящие металлические конструкции мостов и путепроводов, расположенные на расстоянии менее 5 м от частей контактной сети и линий электропередачи, находящихся под напряжением; металлические конструкции мостов и путепроводов, расположенные в зоне влияния контактной сети или линий электропередачи переменного тока; мосты и путепроводы, которые могут оказаться под напряжением вследствие падения на них проводов, тросов или других деталей контактной сети или линий электропередачи при их повреждении.

8.8.26. Опасная зона для работ на мостах электрифицированных участков (2 м от токонесущих частей контактной сети), а также при наличии на мостах линий электропередачи (в зависимости от напряжения линии электропередачи, но не менее 2 м) должна быть обозначена красной полосой на элементах пролетных строений или конструкций подвески линии электропередачи.

8.8.27. Контактная сеть и линии электропередачи, кроме подвешенных на расстоянии, обеспечивающем безопасность производства работ на мостах, должны секционироваться с обеих сторон моста с установкой разъединителей с ручным приводом.

8.8.28. Конструкции крепления контактной сети городского транспорта (трамвай, троллейбус) на железнодорожных путепроводах должны исключать возможность попадания рабочего напряжения на конструкции путепроводов и железнодорожные коммуникации. С этой целью к нижней конструкции путепровода должны крепиться диэлектрические щиты, шириной 1200 мм с бортами по краям, исключающими сход штанги; щиты должны выступать по концам конструкций путепровода на 250 мм.

8.8.29. На путепроводах и пешеходных мостах, расположенных над электрифицированными путями, для ограждения частей контактной сети, находящихся под напряжением, должны быть установлены предохранительные щиты и сплошной настил в местах прохода людей. Щиты могут быть вертикальные высотой 2 м и горизонтальные, прикрывающие находящиеся под напряжением части контактной сети на расстоянии не менее 1,5 м от края путепровода или пешеходного моста.

8.8.30. Тоннели протяжением более 300 м на прямых и более 150 м на кривых участках пути должны быть оборудованы постоянным (общим и дежурным) электрическим освещением, а также обеспечены продольным энергоснабжением. На электрифицированных линиях, а также в других случаях при наличии электроэнергии освещение и продольное энергоснабжение рекомендуется устраивать во всех тоннелях. В целях экономии электроэнергии при отсутствии людей в тоннеле должно быть включено только дежурное освещение.

8.8.31. Охраняемые мосты и тоннели, мосты на судоходных реках должны быть оборудованы телефонной связью. Телефонные аппараты устанавливают в закрытых шкафах по концам сооружений, а при длине их более 1000 м — также и в середине.

8.8.32. Железнодорожные мосты с разводными пролетами, а также мосты с совмещенной проезжей частью (для одновременного движения рельсовых и безрельсовых транспортных средств) должны быть ограждены с обеих сторон сигналами прикрытия, находящимися на расстоянии не менее 50 м от въездов на них. Для городских мостов расстояния от въездов до сигналов прикрытия устанавливаются по согласованию с Государственной инспекцией безопасности дорожного движения Министерства внутренних дел Российской Федерации. Открывание сигналов прикрытия должно быть возможным только при неразведенном положении разводного пролета, а также при незанятом состоянии совмещенного проезда.

8.8.33. Железнодорожные мосты с разводными пролетами, а также однопутные мосты на двухпутных участках дороги должны быть защищены предохранительными (улавливающими) тупиками или устройствами путевого заграждения.

8.8.34. Мосты и тоннели по перечню, утвержденному дирекцией инфраструктуры, оборудуются оповестительной сигнализацией, заградительными светофорами и контрольно-габаритными устройствами.

8.8.35. В судоходных пролетах мостов должна быть судоходная сигнализация. Порядок ее устройства и обслуживания определяются проектом с учетом требований законодательства в области морского и речного транспорта.

8.8.36. Перед мостами с контррельсами или охранными брусьями на участках, где работают снегоочистители, с обеих сторон устанавливаются временные сигнальные знаки.

8.8.37. Оборудование запретных зон мостов и тоннелей осуществляется в соответствии с проектным решением на основании оценки уязвимости, выполненной специализированной организацией в области транспортной безопасности, после утверждения плана обеспечения транспортной безопасности объекта транспортной инфраструктуры.

8.8.38. Около больших, а также всех разводных мостов и у тоннелей следует предусматривать служебно-бытовые помещения для обслуживания сооружений и для хранения инструмента и материалов. На больших мостах для механизации работ по текущему содержанию и ремонту следует предусматривать устройство линий подачи сжатого воздуха и воды, а также линий продольного электроснабжения с токоотборными точками.

8.8.39. Для предупреждения протекания атмосферных вод в тоннели и галереи надлежит следить, чтобы на поверхности над сооружениями не было заболоченных мест, низин и ям, где могла бы скапливаться вода. В случае значительного обводнения сооружений вследствие поступления атмосферной воды должны быть приняты предупредительные меры на поверхности над тоннелем или галереей: планировка, устройство нагорных канав, осушение заболоченных мест посредством дренажей и канав, отводящих воду в сторону за пределы возможного ее поступления в сооружение.

8.8.40. Все дренажи, водоотводные и нагорные канавы должны иметь продольный уклон не менее и достаточное сечение. Лотки канав в пористых и трещиноватых грунтах должны быть замощены камнем, зацементированы или забетонированы и во всех случаях содержаться в чистоте.

8.8.41. В случае недостаточной эффективности планировки поверхности и устройства поверхностного водоотвода, а также при обводнении тоннелей (галерей) грунтовыми водами должны приниматься меры по осушению сооружений: устройство дренажных скважин, штолен, нагнетания различных мастик по специальным проектам.

8.8.42. В обводненных тоннелях и галереях должны быть лотки для беспрепятственного отвода воды. Уклон продольных водоотводных лотков в тоннелях должен быть не менее . Лотки должны быть закрыты, при необходимости утеплены. В суровых климатических условиях может применяться искусственный обогрев лотков.

8.8.43. Концевые участки штолен, а также поперечные заходки из штолен в тоннель следует, как и лотки, предохранять от промерзания. Для борьбы с наледями и предотвращения «размораживания» бетона в сложных климатических условиях должен предусматриваться обогрев тоннелей по проекту.

8.8.44. В обводненных тоннелях и галереях необходимо периодически определять и записывать в тоннельную книгу дебет воды, поступающей в тоннель (галерею) и в дренажные штольни.

8.8.45. В тоннелях длиной более 500 м, а также во всех плохо проветриваемых тоннелях необходимо периодически брать пробу воздуха для анализа содержания вредных газов. В зависимости от результатов анализа корректируется режим и распорядок работы людей в тоннеле, а также систем вентиляции, при ее наличии.

8.8.46. В железнодорожных тоннелях предусмотренные проектом системы пожаротушения, освещения, сигнализации, эвакуации, тепловентиляции, подогрева, а также автоматизированная система управления технологическим процессом должны содержаться в исправном состоянии.

9. Проверка габарита, инструментальные измерения

9.1. Проверка габарита приближения строений на мостах и в тоннелях должна производиться периодически габаритообследовательскими станциями не реже одного раза в пять лет, а также регулярно эксплуатирующим подразделением при обнаружении деформаций (например, обделки тоннеля) и после производства работ, которые могут вызвать нарушение габарита: перекладка обделки, рихтовка, подъемка и понижение пути, сплошная замена мостовых брусьев, усиление, переустройство перил и др. Приборы и оборудование приведены в приложении Д.

9.2. Приведение мостов к габаритному состоянию может быть осуществлено переустройством связей, подъемкой пролетных строений или понижением пути (для путепроводов), заменой негабаритных конструкций, а также передвижкой пути на мосту до совпадения с осью пролетного строения или передвижкой самих пролетных строений. Устранение или снижение негабаритности в тоннелях может быть достигнуто рихтовкой и понижением пути, подтеской обделки или ее перекладкой согласно проектному решению.

9.3. При наличии в тоннелях каких-либо коммуникаций (линии связи, электропередачи, водопровод) необходимо следить за тем, чтобы эти устройства находились вне пределов габарита приближения строений.

9.4. Съемка профиля и плана рельсового пути производится на мостах после замены мостовых брусьев или укладки железобетонных плит безбалластного мостового полотна; на мостах с ездой на балласте и в тоннелях — после ремонтов верхнего строения пути, а также во всех случаях изменения положения пути (рихтовка, понижение или подъемка, в том числе при пучении).

9.5. Для всех мостовых переходов с пролетными строениями длиной более 20 м должны иметься профили и планы пролетных строений, снятые геодезическими инструментами. Периодические инструментальные съемки плана и профиля должны производиться:

при удовлетворительном состоянии пролетных строений — не реже одного раза в 10 лет;

на мостах, имеющих дефекты в очертании профиля или плана пролетных строений (значительные их провесы, искривления) — по заключению мостоиспытательной станции, но не реже, чем через 5 лет;

на мостах с предварительно напряженными железобетонными пролетными строениями (съемки профиля) — не реже одного раза в 5 лет;

на мостах со сквозными открытыми металлическими пролетными строениями (съемка плана верхних поясов ферм) — по заключению мостоиспытательной станции, но не реже одного раза в 5 лет;

на всех мостах до и после усиления или ремонта, связанного с подъемкой ферм, а также в случаях повреждений или деформаций пролетных строений.

9.6. Съемка профиля металлических и деревянных ферм производится по поясам ферм в их узлах. Рейку в каждом узле устанавливают в одних и тех же местах: при нивелировке нижних поясов — на верхние горизонтальные листы поперечных балок; при нивелировке верхних поясов — на верхние горизонтальные листы поясов, причем должны быть приняты во внимание число и толщина горизонтальных листов. Съемка профиля балок со сплошной стенкой выполняется по верху горизонтальных листов нижних поясов либо по низу горизонтальных листов верхних поясов в начале, ¹/₄, ¹/₂, ³/₄ и в конце пролета.

9.7. Съемка профиля железобетонных мостов производится по металлическим маркам или, в крайнем случае, по борту балластного корыта. По возможности такую съемку следует выполнять по низу балок. Железобетонные балочные пролетные строения нивелируют не менее чем в шести точках — в середине полетного строения и у опор с каждой стороны пролетного строения.

9.8. Съемка плана ферм производится в плоскости обоих поясов по узлам ферм, плана балок со сплошной стенкой — по узлам прикрепления связей. При этом сначала с помощью тахеометра или нивелира и горизонтально расположенной нивелирной рейки снимается план одной плоской фермы, затем лазерным дальномером или рулеткой измеряются расстояния между одноименными узлами двух плоских ферм пролетного строения. План ферм (балок) можно снимать электронным тахеометром.

9.9. Результаты съемки профиля и плана ферм и рельсового пути оформляют в виде графиков, на каждом из которых необходимо указать температуру и условия съемки. На отдельном графике последняя съемка совмещается с предыдущими для сравнения.

9.10. Допускаемое отклонение величины ординат строительного подъема после установки пролетного строения на опорные части (с учетом упругого прогиба от собственного веса пролетного строения) не более 10% от проектного.

9.11. Допускаемая разность (в поперечном направлении) отметок узлов пролетного строения после установки его на опорные части при расстоянии B между осями ферм (главных балок), не более опорных узлов ферм (главных балок) — 0,001B, одноименных узлов смежных ферм (главных балок) — 0,002B.

9.12. Допускаемое отклонение в плане оси ферм от проектной — не более 0,0002L, где L — величина пролета.

9.13. Допускаемое отклонение одного из узлов в плане от прямой, соединяющей два соседних с ним узла, не более 0,001 длины панели.

9.14. Вертикальные упругие прогибы пролетных строений, вычисленные при действии подвижной временной вертикальной нагрузки, не должны превышать значений, определяемых по формуле:

L/(800 — 1,25L), но не более 1/600, м.

9.15. Положение опор каждого моста должно быть зафиксировано нивелировкой подферменных площадок, осевыми знаками и измерениями расстояний между осями опор и шкафными стенками устоев. В балочных мостах разрешается вместо этого промерять расстояние между осями опорных частей (балансиров и подушек) смежных пролетных строений на опорах и между осью опорных частей и шкафной стенкой на устоях; в арочных мостах — зазоры деформационных швов.

9.16. Различные по величине осадки соседних опор не должны вызывать появления в продольном профиле дополнительных углов перелома, превышающих для железнодорожных мостов .

9.17. Предельные продольные и поперечные смещения верха опор железнодорожных мостов с разрезными балочными пролетными строениями с учетом общего размыва русла не должны превышать значения:

, но не менее 25 м,

где l₀ — длина меньшего примыкающего к опоре пролета.

9.18. Изменение положения опор (наклон, осадка, сдвиг) может быть определено по результатам нивелировки подферменных площадок, связанных с репером, по тахеометрической съемке наклона граней опор, при помощи отвесов и т.п. Кроме того, в балочных мостах наклон или сдвиг опор может быть определен по изменению расположения элементов подвижных опорных частей и других подвижных сопряжений, а в арочных мостах — по изменению раскрытия деформационных швов. В необходимых случаях, определяемых мостоиспытательными станциями, применяют более точные методы с установкой специальных марок, реперов и устройством постоянных площадок для установки тахеометров. Результаты измерений положения опор оформляют в виде сравнительных схем и таблиц.

9.19. В тоннелях отклонения оси рельсовой решетки в плане и в профиле от проектного положения не должны вызывать нарушения габарита или увеличения негабаритности сооружения. Для контроля за положением верхнего строения пути, в тоннелях должны быть постоянные реперы (рисунок 6), заделываемые в обделку стен через каждые 20 м на прямых и через каждые 10 м на кривых. В однопутных тоннелях реперы располагают на прямом участке со стороны правой по счету километров рельсовой нитки, а на кривой — со стороны наружного рельса. В двухпутных тоннелях реперы устанавливают по обеим сторонам. В стене тоннеля у каждого репера прикрепляют марку, на которой указывают номер репера, расстояние до рабочей грани ближайшего рельса и возвышения над головкой рельса. Для контрольных измерений применяют специальный шаблон, устанавливаемый на головку путевого рельса и на репер.

а — конструкция репера; б — проверка положения пути

в тоннеле по реперу; 1 — путевой репер; 2 — обделка тоннеля;

3 — предохранительный колпачок (заполняется густой смазкой

и закрепляется на репере шплинтом); 4 — шплинт; 5 — шаблон;

6 — подвижный упор; 7 — уровень; 8 — путевой рельс

Рисунок 6. Путевые реперы в тоннеле

9.20. На чертежах поперечных сечений (рекомендуемый масштаб 1:50), должны быть нанесены: ось тоннеля, положение пути и контактного провода (на электрифицированных участках), габарит приближения строений. Заснятые сечения должны быть привязаны к пикетажу (а на неисправных участках, кроме того, отмечены и в натуре) для того, чтобы все последующие проверки были сопоставимы.

9.21. Контрольную нивелировку обделки и промеры ширины колец (в середине кольца) следует повторять не реже одного раза в 5 лет. Для контрольных нивелировок на обоих порталах тоннелей должны быть установлены геодезические реперы или путевые реперы.

9.22. За неисправными кольцами (деформированными или имеющими горизонтальные и косые трещины), а также смежными с ними кольцами, должны проводиться регулярные инструментальные наблюдения. Для этого в тоннельную обделку по ее поперечному сечению заделывают постоянные металлические марки с обеих сторон пути: на уровне головки рельса, на высоте 2560 и 5300 мм от головки рельса, а также в замке свода. При наблюдениях производят нивелировку марок, а также измерение горизонтальных и диагональных расстояний между ними.

9.23. Положение марок с их отметками и взаимными расстояниями между ними должно быть показано на чертеже поперечного сечения обделки в данном месте, привязанном к пикетажу. Результаты последующих измерений записывают в тоннельной книге со ссылкой на чертеж, а все изменения в положении марок отмечают в ведомости и на чертеже с указанием даты.

9.24. Судоходный габарит отсчитывается от расчетного судоходного уровня воды, определяемого расчетом в соответствии с действующими нормативами в области морского и речного транспорта.

9.25. Строительной высотой пролетного строения является: в пролете — расстояние от подошвы рельса до низа конструкции пролетного строения, на опоре — расстояние от подошвы рельса до верха подферменной площадки.

9.26. Все материалы по проверке габарита, съемкам плана и профиля рельсового пути и пролетных строений, а также другим инструментальным наблюдениям за искусственными сооружениями должны прилагаться к Книгам искусственных сооружений.

Приложение А

к Инструкции по содержанию

искусственных сооружений

ПЕРЕЧЕНЬ

основных повреждений искусственных сооружений,

требующих ограничения скорости движения поездов

до проведения специальных обследований, расчетов

и испытаний сооружений или их устранения

Вид повреждения	Максимальная скорость движения поездов, км/ч
Трещина более 20% сечения, коррозия более 30% сечения несущих элементов металлических пролетных строений	25
Трещина более 20% сечения, коррозия более 30% сечения связей металлических пролетных строений	60
Отсутствие более 10% болтов (заклепок) в узле крепления металлического пролетного строения (более 1 шт. в узле из 10 болтов (клепок))	60
Поперечная трещина более 1 мм в растянутой зоне железобетонного пролетного строения, раскрывающиеся под временной нагрузкой	25
Наличие косых трещин в растянутой зоне мест опирания бетонных пролетных строений	25
Повреждение нижнего пояса железобетонных пролетных строений с обрывом несущей арматуры (до 10% от площади рабочей арматуры)	40
Продольная трещина вдоль консоли балластного корыта на длине более 2 м, либо более 30% длины пролетного строения	40
Крен более 25 градусов, сдвиг более 20% площади опирания наращенной части продольного борта балластного корыта пролетного строения	40
Неплотное (свыше 4 мм) опирание пролетных строений длиной 23 и более метров на опорные части, или их опорных частей на подферменники	60
Сплошная поперечная трещина посередине свода арочного моста, углам свода рамно-арочного моста	40
Трещина в опоре моста, раскрывающаяся под временной нагрузкой	60
Размыв конуса устоя моста, подмыв опоры без ее крена	60
Трещина в теле трубы и оголовков, раскрывающаяся под временной нагрузкой	60
Сквозные вывалы кладки водопропускной трубы, просыпания грунта насыпи в швы между звеньями водопропускной трубы с образованием пустот в грунте	40
Просыпания грунта насыпи в швы между звеньями водопропускной трубы с образованием воронки в теле насыпи или балластной призмы диаметром до 1 м	15
Подмыв оголовка трубы с угрозой нарушения целостности земляного полотна	60

Приложение Б

к Инструкции по содержанию

искусственных сооружений

ПЕРЕЧЕНЬ

форм первичного учета

Формы первичного учета, используемые для учета и наглядного представления основных данных о конструкции и состоянии искусственных сооружений, должны соответствовать утвержденному нормативно-техническому документу (приложение В, п. 5). Их ведение осуществляется в Единой корпоративной автоматизированной системе управления инфраструктурой.

Перечень форм первичного учета:

1. ПУ-12 Книга большого и среднего моста;

2. ПУ-12а Тоннельная книга;

3. ПУ-13 Книга малого искусственного сооружения;

4. ПУ-15 Карточка на мост;

5. ПУ-15а Карточка на пешеходный мост;

6. ПУ-15б Карточка на автодорожный путепровод;

7. ПУ-15в Карточка на мост-трубу;

8. ПУ-15г Карточка на акведук;

9. ПУ-16 Карточка на железнодорожный тоннель;

10. ПУ-16а Карточка на подпорную стенку;

11. ПУ-16б Карточка на галерею;

12. ПУ-16в Карточка на селеспуск;

13. ПУ-17 Карточка на водопропускную трубу, лоток, коллектор, дюкер, сифон, фильтрующую насыпь;

14. ПУ-17а Карточка на пешеходный тоннель;

15. ПУ-17б Карточка на автодорожный путепровод тоннельного типа;

16. ПУ-17в Карточка на железнодорожный путепровод тоннельного типа;

17. ПУ-17г Карточка на акватоннель;

18. ПУ-30 Книга записи результатов осмотров искусственных сооружений;

19. ПУ-28 Книга записи результатов проверки пути, сооружений, путевых устройств и земляного полотна;

20. ПУ-35 Журнал обходчика железнодорожных путей и искусственных сооружений.

Приложение В

к Инструкции по содержанию

искусственных сооружений

ПЕРЕЧЕНЬ

нормативно-технических документов ОАО «РЖД»,

применение которых на обязательной основе обеспечивает

соблюдение требований инструкции по текущему содержанию

искусственных сооружений

1. Руководство по определению грузоподъемности металлических пролетных строений железнодорожных мостов, утвержденное распоряжением ОАО «РЖД» от 31 декабря 2015 г. N 3227р.

2. Руководство по определению грузоподъемности железобетонных пролетных строений железнодорожных мостов, утвержденное распоряжением ОАО «РЖД» от 30 декабря 2015 г. N 3166р.

3. Руководство по определению грузоподъемности опор железнодорожных мостов, утвержденное распоряжением ОАО «РЖД» от 30 декабря 2015 г. N 3165р.

4. Руководство по пропуску подвижного состава по железнодорожным мостам, утвержденное распоряжением ОАО «РЖД» от 31 декабря 2015 г. N 3226р.

5. Альбом форм первичной документации по хозяйству пути, утвержденный ОАО «РЖД» 9 декабря 2004 г.

6. Инструкция по диагностике и мониторингу технического состояния искусственных сооружений, утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 27 октября 2017 г. N 2201/р (отменена).

7. Инструкция по оценке состояния и содержания искусственных сооружений ОАО «РЖД», утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 1 октября 2019 г. N 2162/р.

8. Инструкция по устройству и конструкции мостового полотна на железнодорожных мостах ОАО «РЖД», утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 14 января 2019 г. N 28/р.

9. Инструкция по устройству, укладке, содержанию и ремонту бесстыкового пути, утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 14 декабря 2016 г. N 2544р.

10. Технологические правила ремонта каменных, бетонных и железобетонных конструкций железнодорожных мостов, утвержденные распоряжением ОАО «РЖД» от 13 апреля 2016 г. N 649р.

11. Нормативы численности работников, занятых на текущем содержании искусственных сооружений, утвержденные распоряжением ОАО «РЖД» от 21 октября 2019 г. N 2308/р.

12. Положение об организации комплексного обслуживания объектов инфраструктуры хозяйства пути и сооружений, утвержденное распоряжением ОАО «РЖД» от 29 ноября 2019 г. N 2675р.

13. Технические условия на проведение планово-предупредительных ремонтов инженерных сооружений железных дорог России, утвержденные МПС России от 23 декабря 1998 г. (отменены).

14. Методика ранжирования объектов искусственных сооружений и земляного полотна для оценки приоритетности их включения в капитальные виды ремонта, утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 29 апреля 2020 г. N 948/р.

15. Положение об обеспечении безопасной эксплуатации технических сооружений и устройств железных дорог при строительстве, реконструкции и (или) ремонте объектов инфраструктуры ОАО «РЖД», утвержденное распоряжением ОАО «РЖД» от 30 августа 2013 г. N 1932.

16. Инструкция по гидрологическому мониторингу мостовых переходов ОАО «РЖД», утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 12 декабря 2012 г. N 2540р.

17. Инструкция по классификации эксплуатируемых малых искусственных сооружений по водопропускной способности, утвержденная распоряжением ОАО «РЖД» от 15 ноября 2013 г. N 2465р.

18. Регламент технического оснащения дистанций пути, инженерных сооружений, путевых машинных станций, утвержденный распоряжением ОАО «РЖД» от 16 апреля 2014 г. N 241.

19. Пооперационные нормы расхода материалов на текущее содержание земляного полотна и искусственных сооружений (статья управленческого учета затрат «Работы по текущему содержанию земляного полотна и искусственных сооружений» N 2104) Центральной дирекции инфраструктуры — филиала ОАО «РЖД», утвержденные распоряжением ОАО «РЖД» от 6 марта 2020 г. N 512/р.

Действие нормативно-технических документов целесообразно проверить в информационной системе общего пользования. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящей инструкцией следует руководствоваться замененным (измененным) документом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Приложение Г

к Инструкции по содержанию

искусственных сооружений

Основные требования при проезде транспортных средств

под искусственными сооружениями

Габаритные ворота устанавливают на расстоянии 1 — 15 м от искусственных сооружений с обеих сторон. В случае подхода к искусственному сооружению нескольких автомобильных дорог габаритные ворота должны быть установлены в месте, исключающем проезд, минуя их.

Горизонтальную контрольную планку габаритных ворот располагают на 20 см ниже высоты нижней кромки искусственного сооружения (рисунок 7).

1 — дорожные знаки 2.6 «Преимущество встречного движения»

или 2.7 «Преимущество перед встречным движением»;

2 — дорожный знак 3.13 «Ограничение высоты»;

3 — габаритные ворота; 4 — барьерное ограждение;

5 — передние грани мостовых

Рисунок 7. Обустройства и знаки перед проездами

под искусственными сооружениями

На габаритных воротах размещают дорожный запрещающий знак 3.13 «Ограничение высоты» (рисунок 8), а при ширине проезда менее 3,5 и у деревянных мостов, кроме того, дорожный запрещающий знак 3.14 «Ограничение ширины». В черте города или иных случаях, затрудняющих установку габаритных ворот, дорожные знаки 3.13 и 3.14 размещают на искусственном сооружении в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52289-2004, ГОСТ Р 52290-2004 Технические средства организации дорожного движения. Правила применения.

а — с плоской металлической фермой; б — деревянные;

в — с металлическими растяжками;

1 — опоры; 2 — металлическая ферма; 3 — ограничительные

планки; 4 — металлическая цепь или проволочные подвески;

5 — проезжая часть автодороги; 6 — сплошная осевая линия;

7 — дорожный знак 3.13 «Ограждение высоты»;

8 — металлические растяжки

Рисунок 8. Габаритные ворота перед

искусственными сооружениями

Если встречный разъезд транспортных средств затруднен по причине недостаточного габарита в свету, то на подходах к такому сооружению с одной стороны должен быть установлен дорожный знак приоритета 2.6 «Преимущество встречного движения», а с другой стороны знак приоритета 2.7 «Преимущество перед встречным движением».

Указываемая на дорожном знаке 3.13 высота должна быть меньше фактических габаритных размеров поезда под искусственным сооружением на 30 — 40 см. Разницу между фактической или указываемой высотой допускается увеличивать в зависимости от ровности дорожного покрытия.

Ширина, указываемая на дорожном 3.14, должна быть меньше фактической на 20 см.

Если ширина проезда под искусственным сооружением меньше проезжей части дороги, то устанавливают предупредительные знаки 1.18.1 — 1.18.3 «Сужение дороги».

В целях недопущения повреждения опор и других частей искусственных сооружений в зависимости от их конфигурации и местных условий должны устанавливаться ограждения барьерного типа или высокий бордюр.

На ограждения наносится вертикальная разметка черными и белыми полосами в соответствии с ГОСТ Р 51256-2011, ГОСТ Р 52289-2004 и ГОСТ Р 52290-2004.

Приложение Д

к Инструкции по содержанию

искусственных сооружений

ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

для проведения испытаний

Для исследования напряженно-деформированного состояния элементов конструкций в натурных условиях, величины раскрытия трещин, местных перемещений и пр. рекомендуется применять механические тензометры и электрические тензометрические системы. Механические тензометры и деформометры применяют только при испытании сооружений статическими нагрузками. Электрические тензометрические системы применяются как для статических, так и для динамических испытаний.

Общие прогибы и линейные перемещения конструкций при испытаниях могут быть измерены с использованием геодезических инструментов, различного типа механических прогибомеров и клинометров, а также тензометрических прогибомеров. Для длительного наблюдения за деформационными перемещениями элементов конструкции применяются измерители линейных деформаций и геодезические инструменты с закреплением специальных марок на сооружении и реперов на местности. Возможно применение спутниковых GPS-приемников.

Для проверки размеров сооружения и его элементов используется мерный инструмент — лазерные дальномеры, тахеометры, нивелиры, рулетки со стальной лентой, штангенциркули, стальные линейки и пр. Толщина металлических элементов и лакокрасочного покрытия измеряется приборами измерения геометрических параметров.

Параметры применяемых приборов (точность, пределы измерений, частотные характеристики и др.), способы их установки и используемые установочные приспособления должны позволять получать стабильные показания измеряемых величин с возможно меньшими погрешностями и искажениями. При испытаниях используют стандартные приборы, прошедшие поверку. Допускается использование иных сертифицированных приборов, если по их применению имеются технологические инструкции.

Определение механических характеристик и качества материала сооружения производится при помощи приборов неразрушающего контроля.

Для измерения прочности стали может быть применен прибор Польди или твердомеры, при необходимости в сомнительных случаях качество металла определяют металлографическими исследованиями, с использованием спектрального анализа и испытаниями образцов в лабораторных условиях.

Оценка прочности бетона может быть осуществлена склерометрическими методами, методом пластических деформаций, ультразвуковыми методами. При этом необходимо учитывать то, что бетон и железобетон — это неоднородный материал, прочность которого зависит от многих факторов, и может значительно изменяться в пределах одного элемента. Рекомендуется брать контрольные керны бетона и проводить их испытания в лабораторных условиях для повышения достоверности получаемых неразрушающими методами результатов.

Для выявления скрытых дефектов в элементах мостовых конструкций (трещины, раковины, пустоты, инородные включения и пр.) могут быть использованы акустические, магнитные, рентгено- и гаммаграфические методы. Рекомендуется использовать ультразвуковую диагностику. Достоверные результаты дают георадары.

Контроль расположения и диаметра арматуры железобетонных конструкций при отсутствии достоверных арматурных чертежей может быть осуществлен с помощью измерителей толщины защитного слоя. Проконтролировать показания прибора можно в местах обнажения арматурных стержней или выполнив вскрытие защитного слоя бетона.

Проверки величин моментов закручивания высокопрочных болтов и усилий натяжения высокопрочных шпилек крепления плит БМП производятся динамометрическими ключами.

УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 июня 2003 года

Дата введения — 30 июня 2003 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

РУКОВОДСТВО ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ

РУКОВОДСТВО
Р 4.1.1672-03

1. Разработано: ГУ НИИ питания РАМН (руководитель В.А. Тутельян, ответственный исполнитель К.И. Эллер, Ю.П. Алешко-Ожевский, Т.В. Аристархова, В.Г. Байков, Н.А. Бекетова, В.В. Бессонов, С.В. Волкович, Л.Ш. Воробьева, О.А. Вржезинская, М.М.Г. Гаппаров, Н.А. Голубкина, Г.Ф. Жукова, М.Г. Киселева, Т.В. Киселева, В.М. Коденцова, С.Н. Кулакова, Л.Г. Левин, Ф.А. Медведев, Г.В. Никольская, В.В. Пименова, И.М. Скурихин, О.И. Соловьева, В.Б. Спиричев, Л.А. Харитончик, С.А. Хотимченко); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (И.В. Брагина); Фармакопейным комитетом Минздрава России (В.Л. Багирова, Е.Л. Ковалева); ВИЛАР РАСХН (С.А. Пинеев).

2. Утверждено и введено в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 июня 2003 г.

3. Вводится впервые.

Область применения

Настоящее Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее — Руководство) разработано в соответствии с Федеральными законами «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.99 N 52-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, N 14, ст. 1650), «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 02.01.00 N 29-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, N 2, ст. 150), Постановлением Правительства Российской Федерации от 21.12.00 N 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов».

Руководство устанавливает методы контроля ингредиентного состава и показателей качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее — БАД).

Руководство предназначено для юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, осуществляющих деятельность в сфере производства и оборота БАД, а также для организаций и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации (далее — госсанэпидслужбы России), осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль за безопасностью и эффективностью БАД в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» и другими нормативными документами.

Методы контроля, изложенные в Руководстве, применяются на этапах экспертизы и регистрации БАД, при разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и реализации на территории Российской Федерации, при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.

Глава 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАКРОНУТРИЕНТОВ

I. Методы определения азотистых соединений

1. Метод определения общего белка

Метод заключается в определении азота по Кьельдалю с последующим пересчетом на белок. Сущность метода состоит в разложении органического вещества пробы кипящей концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония, переведении аммония в аммиак, отгонке его в раствор кислоты, количественном учете аммиака титрометрическим методом и расчете содержания азота в исследуемом материале.

Подготовка к испытанию

Среднюю пробу БАД готовят согласно прописи отбора проб по стандарту определения белка на соответствующий продукт, в случае отсутствия стандарта — по техническим условиям на БАД. Для пересчета содержания белка на сухое вещество (в случае необходимости определения данного показателя) определяют влажность исследуемого БАД или пищевого сырья.

Подготовка реактивов и растворов

Приготовление смешанных катализаторов

Катализатор 1. Смешивают 1 весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

Катализатор 2. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди, 100 весовых частей сернокислого калия и 2 весовые части селена. Тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять сернокислый калий надсернокислым калием в том же количестве.

Катализатор 3. Перекись водорода, 30%-ный водный раствор.

Приготовление 4%-ного раствора борной кислоты

40 г борной кислоты растворяют в небольшом количестве теплой дистиллированной воды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 куб. см. После охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1000 куб. см.

Приготовление 0,05 моль/куб. дм (0,1 н) раствора серной кислоты

Используют стандарт-титр серной кислоты. Раствор готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.

Допускается приготовление 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты из концентрированной серной кислоты в соответствии с ГОСТ 25791.1-83.

Приготовление смешанного индикатора

Растворяют 0,20 г метилового красного и 0,10 г бромкрезолового зеленого в 100 куб. см 96%-ного этилового спирта.

Проведение испытания

Приготовление минерализата

Из усредненной измельченной гомогенной пробы исследуемого БАД для анализа взвешивают на обеззоленном фильтре или в пробирке точную навеску, с погрешностью не более 0,1%. Содержание азота в анализируемой пробе должно быть не менее 10 мг. Навеску количественно переносят в колбу Кьельдаля.

Минерализацию осуществляют одним из двух способов.

Способ 1

Добавляют в колбу Кьельдаля 1,5 — 2 г смешанного катализатора 1 или 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10 — 15 куб. см концентрированной серной кислоты.

Способ 2

Добавляют в колбу Кьельдаля 7 — 10 куб. см 30%-ной перекиси водорода в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции приливают такое же количество концентрированной серной кислоты.

Колбу покрывают стеклянной воронкой и устанавливают на нагреватель так, чтобы ее ось была наклонена под углом 30 — 45° к вертикали. Вначале колбу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразование.

При нагревании навеску время от времени помешивают вращательными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усиливают, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. При этом следят за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось черных несгоревших частиц, смывая их легким встряхиванием содержимого колбы или прибавлением небольшого количества серной кислоты.

После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают в течение 30 мин.

После охлаждения к содержимому колбы постепенно приливают, взбалтывая, около 70 куб. см дистиллированной воды, охлаждают и приступают к отгонке аммиака.

В бачок-парообразователь через воронку наливают дистиллированную воду (несколько больше половины общего объема бачка) и открывают кран на воронке и зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля.

Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке. Присоединяют пустую колбу Кьельдаля к каплеуловителю холодильника и воронке для щелочи и после того, как вода в бачке закипит, закрывают кран воронки бачка-парообразователя. Включают холодильник, подставляют под него пустую коническую колбу и в течение 5 — 10 мин. «пропаривают» прибор.

После пропаривания открывают краны воронки бачка-парообразователя и воронки для щелочи и закрывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля.

Под холодильник подставляют вместо пустой конической колбы коническую колбу с предварительно налитыми в нее из пипетки 20 куб. см 4%-ной борной кислоты и 5 капель смешанного индикатора или 25 куб. см 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты. Колбу подставляют под холодильник так, чтобы его кончик был погружен в раствор кислоты на глубину не менее чем 1 см. Вместо пустой колбы Кьельдаля присоединяют колбу с сожженной навеской анализируемой пробы.

Закрывают кран воронки для щелочи, наливают в воронку 33% раствора щелочи и открывают понемногу кран воронки для щелочи при осторожном покачивании колбы Кьельдаля, приливают избыток щелочи, при этом цвет раствора должен резко измениться — от прозрачного до синего или бурого. Открывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля и закрывают остальные краны, при этом пар будет проходить через жидкость в колбе Кьельдаля и увлекать аммиак. В холодильнике пар конденсируется. Раствор аммиака попадает в колбу с 0,1 н. раствором серной кислоты. При нормальном кипении объем раствора в приемной колбе через 20 — 30 мин. обычно составляет 150 — 180 куб. см. Конец отгонки можно установить с помощью красной лакмусовой бумажки. Для этого приемную колбу отставляют от аппарата, предварительно обмыв конец холодильника дистиллированной водой, и подставляют лакмусовую бумажку под стекающие капли дистиллята. Если лакмус не синеет, отгон аммиака закончен. Если лакмус синеет, приемную колбу снова подставляют под холодильник и продолжают отгонку. После окончания отгонки приемную колбу опускают и конец холодильника обмывают дистиллированной водой в приемную колбу. После этого открывают краны на воронке бачка-парообразователя и воронке для щелочи и закрывают зажим отводящей пар трубки в колбу Кьельдаля. Содержимое приемной колбы титруют 0,1 моль/куб. дм раствором гидроокиси натрия до перехода окраски в зеленую.

Необходимо параллельно с определением азота в исследуемой пробе проводить определение азота в реактивах («холостой опыт») для внесения соответствующей поправки в результат анализа. Определение азота в реактивах следует повторять каждый раз после замены партии серной кислоты, катализатора или титрованных растворов. Допускается отгонка аммиака (особенно в случае применения больших колб для сжигания) без использования пара непосредственно нагревом колбы на электрическом нагревателе. Проведение отгонки аммиака и все последующие операции проводятся так же, как и с применением пара.

Способ 3

Определение содержания азота проводят на автоматическом анализаторе типа «Кьельдек», фирма Текатор, Швеция, в соответствии с инструкцией к прибору.

Обработка результатов

Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака в борную кислоту вычисляют по формуле:

где:

— объем раствора серной кислоты, израсходованный на титрование испытуемого раствора, куб. см;

— объем раствора серной кислоты, израсходованный на титрование в контрольном опыте, куб. см;

К — поправка к титру 0,05 ммоль/куб. дм раствора серной кислоты, если он приготовлен не из стандарт-титра;

0,0014 — количество азота, эквивалентное 1 куб. см раствора серной кислоты, г;

М — масса навески, г.

Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при отгонке аммиака в серную кислоту вычисляют по формуле:

где:

— объем 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование 0,05 моль/куб. дм серной кислоты в контрольном опыте, куб. см;

— объем 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование серной кислоты в испытуемом растворе, куб. см;

K — поправка к титру 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия;

0,0014 — количество азота, эквивалентное 1 куб. см 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты;

M — масса навески, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных испытаний. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

Расчет содержания общего азота в пробе при использовании автоматического анализатора (способ 3) проводят в соответствии с инструкцией к прибору.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между двумя параллельными определениями (r) не должно превышать значений, вычисляемых по формуле:

но не более 0,1% абсолютного содержания общего азота, где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, вычисляемых по формуле:

но не более 0,2% абсолютного содержания общего азота, где — среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, %.

Массовую долю азота в пересчете на сухое вещество продукта () в процентах вычисляют по формуле:

где:

— массовая доля азота в испытуемой пробе, %;

W — влажность испытуемой пробы, %.

Массовую долю белка (Y) в процентах вычисляют по формуле:

где К — коэффициент пересчета азота на белок БАД:

с высоким (более 15%) содержанием липидов — 6,25;

с умеренным (2 — 15%) содержанием липидов — 6,38;

с низким содержанием липидов — 5,70.

2. Определение аминокислотного состава

Сущность метода заключается в гидролизе образца до аминокислот и последующем количественном определении образовавшихся аминокислот на аминокислотном анализаторе.

Подготовка к испытанию

В пробе определяют общий белок, содержание липидов и влажность по методикам, описанным в настоящем Руководстве.

Для жидких БАД учитывают содержащуюся воду в процессе приготовления гидролизующей смеси таким образом, чтобы концентрация соляной кислоты была 6 М. При содержании липидов более 5% проводят обезжиривание способом, указанным в табл. 1. После обезжиривания остаток подсушивают на воздухе и определяют содержание общего белка. Рассчитывают величину навески образца для гидролиза исходя из соотношения белка к кислоте, представленных в табл. 1, и при условии содержания белка в пробе не менее 5 мг.

Таблица 1

УСЛОВИЯ ПОДГОТОВКИ ПРОБ К АНАЛИЗУ ДЛЯ БАД, СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ УРОВНИ ЛИПИДОВ

Проведение испытания

Три навески БАД или обезжиренного остатка, подготовленных к гидролизу в соответствии с разделом 1, взятых с точностью 0,0001 г, помещают в стеклянную ампулу с оттянутым концом, заливают расчетным количеством соляной кислоты (в случае жидких БАД берут расчетное количество концентрированной кислоты и доводят до концентрации 6 М).

Ампулы запаивают, устанавливают в строго вертикальном положении в металлический патрон или фарфоровый стакан с парафином и помещают в сушильный шкаф с заранее отрегулированной температурой 110 +/- 2 °С. Нагревание проводят непрерывно в течение 24, 48 и 72 ч. Затем ампулы охлаждают до комнатной температуры. Необходимость трех временных отрезков гидролиза объясняется различиями в скорости отщепления отдельных аминокислот. На основании результатов последующих анализов содержания аминокислот за каждое время гидролиза строят кривую и методом интерполяции или экстраполяции до нулевого времени находят максимальную величину.

Каждую ампулу вскрывают и сразу приступают к удалению соляной кислоты. Если в гидролизате образовался видимый осадок, его удаляют центрифугированием или фильтрованием с последующим доведением фильтрата в мерной колбе до 25 куб. см до точного объема. В случае конечного объема больше 5 куб. см и при использовании высокочувствительных приборов для удаления соляной кислоты берут аликвоту.

Удаление соляной кислоты проводят одним из следующих способов:

а) помещают ампулу или пробирку в вакуум-эксикатор над гранулированным гидратом окиси натрия (NaOH) на 12 — 18 ч;

б) на роторном испарителе при температуре не выше 60 °С. Для этого гидролизат количественно переносят в грушевидную колбу, ополаскивая ампулу дистиллированной водой.

Остаток переносят количественно в мерную колбу с помощью цитратного буфера, pH 2,2, или раствора соляной кислоты 0,02 М и доводят до метки. Полученный раствор гидролизата подвергают анализу на аминокислотном анализаторе в соответствии с инструкцией к прибору.

В случае, если анализ не может быть проведен немедленно, осадок освобождают от следов соляной кислоты путем добавления к нему дистиллированной воды и повторного испарения на роторном испарителе или в вакуумном эксикаторе. Операцию повторяют до полного исчезновения запаха соляной кислоты.

Хранят образец в морозильной камере или нижней камере холодильника при температуре не выше 5 °С, перед анализом разводят цитратным буфером до необходимой концентрации. Обнаруженный осадок отфильтровывают через плотный фильтр.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) для основных аминокислот при концентрациях, характерных для трех важнейших групп продуктов, приведены в табл. 2.

Таблица 2

ДОПУСТИМЫЕ ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ В ОСНОВНЫХ ГРУППАХ БАД

II. Методы определения липидов

1. Методы определения содержания жира в БАД на растительной и жировой основе

1.1. Гравиметрический метод

Метод основан на извлечении сырого жира из БАД растворителем, последующем удалении растворителя, высушивании и взвешивании извлеченного жира.

Подготовка проб к испытанию

Перед началом определений продукт, отобранный из средней пробы по ГОСТ 26312.1-84, тщательно перемешивают, отбирают навеску массой 50 г и измельчают на мельнице.

Приготовление патрона из фильтровальной бумаги

Для приготовления патрона фильтровальную бумагу обезжиривают следующим образом. Листы фильтровальной бумаги свертывают в трубку и помещают в цилиндр с пришлифованной пробкой так, чтобы вся бумага поместилась в цилиндре. В цилиндр перед помещением бумаги наливают 100 — 200 куб. см диэтилового эфира или гексана. После того как растворитель поднимется по бумаге до его верхнего края, цилиндр открывают, бумагу вынимают и дают растворителю испариться, затем ножницами от верхнего края отрезают полоску шириной 4 — 5 см, а остальную часть бумаги используют для приготовления патронов. Вату обезжиривают также в цилиндре. Обезжиренную вату и бумагу хранят в закрытой посуде. Обезжиренный прямоугольный кусок бумаги навертывают на деревянную болванку. По мере навертывания свободный край бумаги подворачивают складками для образования донышка патрона. Бумагу и болванку берут таким образом, чтобы стенки патрона получились двойными, а его диаметр был на 0,5 см меньше диаметра экстрактора. На дно патрона кладут кусочек обезжиренной ваты.

Проведение испытания

В патрон из фильтровальной бумаги отвешивают 1 — 5 г испытуемой пробы, с погрешностью не более 0,01 г, сверху кладут кусочек обезжиренной ваты. Приготовленный таким образом патрон помещают в экстрактор аппарата Сокслета так, чтобы он не был выше верхнего изгиба трубки. Колбу аппарата Сокслета высушивают при температуре 105 +/- 5 °С в течение 2 ч и после охлаждения взвешивают. Колбу наполняют примерно на 2/3 объема гексаном или диэтиловым эфиром и присоединяют к экстрактору. Пускают воду в холодильник и колбу с растворителем нагревают на водяной или песочной бане. При этом растворитель, находящийся в колбе, испаряется и в виде паров проходит через широкую трубку экстрактора в холодильник, где охлаждается и в виде капель поступает в экстрактор с патроном. При заполнении экстрактора растворителем до верхнего изгиба сифонной трубки последний переливается в колбу, унося с собой жир. В течение 1 ч должно быть 7 — 9 сливов растворителя. Экстракцию ведут 2 ч. Затем патрон удаляют из экстрактора и отгоняют растворитель из колбы в экстрактор. После заполнения экстрактора до верхнего изгиба сифонной трубки чистый растворитель сливают из экстрактора, который затем вновь присоединяют к аппарату Сокслета, и отгоняют оставшийся в колбе растворитель. По окончании отгонки растворителя отсоединяют экстрактор, колбу выдерживают на бане до испарения растворителя. После испарения растворителя колбу помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре 105 +/- 5 °С в течение 60 мин., охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Последующее взвешивание проводят после повторной сушки в течение 30 мин. Высушивание и взвешивание повторяют до тех пор, пока разность результатов двух последовательных взвешиваний будет не более 0,001 г. Одновременно определяют влажность.

Обработка результатов

Массовую долю сырого жира в процентах, в пересчете на сухое вещество, в испытуемой пробе (X) вычисляют по формуле:

где:

M — масса пробы, г;

— масса пустой колбы, г;

— масса колбы с жиром, г;

W — массовая доля влаги в испытуемой пробе, %.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое результатов () двух параллельных определений.

Вычисления проводят с точностью до 0,1%.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

1.2. Определение содержания жира в БАД на зерновой основе

Для определения массовой доли жира в БАД на зерновой основе используют три варианта метода:

а) экстракционный метод с предварительным гидролизом навески;

б) рефрактометрический;

в) бутирометрический.

А. Экстракционный метод с предварительным гидролизом навески

Метод основан на извлечении жира из предварительно гидролизованной навески изделия растворителем и определении количества жира взвешиванием после удаления растворителя из определенного объема полученного раствора.

Проведение испытания

Навеску продукта в 1 — 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,05 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 300 куб. см, приливают 100 куб. см 1,5% соляной кислоты (или 10 куб. см 5% серной кислоты), кипятят в колбе с обратным холодильником на кипящей бане 30 мин. Затем колбу охлаждают водой до комнатной температуры, приливают в колбу 50 куб. см хлороформа, плотно закрывают хорошо пригнанной пробкой, энергично взбалтывают в течение 15 мин., затем выливают содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 2 — 3 мин. при 3000 об./мин.

В пробирке образуются три слоя. Верхний водный слой отбирают пипеткой. Пипеткой, снабженной резиновой грушей, отбирают хлороформенный раствор жира и фильтруют его в сухую колбу через небольшой ватный тампон, вложенный в узкую часть воронки, причем кончик пипетки должен при этом касаться ваты.

Фильтрат 20 куб. см помещают в предварительно доведенную до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах колбу вместимостью 100 куб. см.

Отбор и фильтрация должны производиться в течение 2 мин.

Хлороформ из колбы отгоняют на горячей водяной бане, пользуясь холодильником. Оставшийся в колбе жир сушат до постоянной массы (обычно 1 — 1,5 ч) при температуре 100 — 105 °С, охлаждают в эксикаторе в течение 20 мин. и взвешивают колбу на аналитических весах.

Допускается также следующий способ расслаивания.

После гидролиза в охлажденную колбу добавляют 5 куб. см раствора аммиака, 50 куб. см хлороформа, затем содержимое колбы взбалтывают в течение 15 мин. и оставляют на 1 ч для отстаивания. За это время полностью отделяется и четко виден нижний хлороформный слой.

Если расслаивания не произойдет, добавляют еще 2 — 3 куб. см аммиака, следя за тем, чтобы реакция по фенолфталеину оставалась кислой.

После расслаивания отбор, фильтрацию, отгон хлороформного слоя и высушивание жира ведут, как описано выше.

Примечания.

1. Отгон и фильтрацию растворителя проводят под вытяжкой.

2. При отсутствии хлороформа допускается применение дихлорэтана, который следует хранить в темных склянках.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

где:

М — масса колбы с высушенным жиром, г;

— масса пустой колбы, г;

50 — объем хлороформа, взятого для растворения жира, куб. см;

— масса навески исследуемого изделия, г;

20 — объем хлороформного раствора жира, взятого для отгона, куб. см;

W — массовая доля влаги в испытуемом изделии, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое () результатов двух параллельных определений.

Вычисления проводят с точностью до 0,1%.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

Б. Рефрактометрический метод

Метод основан на извлечении жира из навески образца альфа’-бромнафталином или альфа’-хлорнафталином. Массовую долю жира в образце определяют по разности коэффициентов преломления растворителя и раствора жира в растворителе.

Подготовка к испытанию

Определение коэффициента преломления растворителей. Определяют коэффициент преломления альфа’-бромнафталина или альфа’-хлорнафталина при температуре 20 °С, нанося 1 — 2 капли этих растворителей на призму рефрактометра.

Определение плотности растворителей

Плотность растворителей (ро, г/куб. см, при 20 °С) определяют пикнометром и вычисляют по формуле:

где:

Q — водное число пикнометра, г;

М — масса растворителя, г.

Взвешивание проводят с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.

Калибровка пипеток. Микропипетки калибруют по растворителю, отмеривая ими соответствующий объем растворителя и взвешивая его в стаканчике с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.

Из трех взвешиваний берут среднее арифметическое и вычисляют объем пипетки (V) в куб. см по формуле:

где:

М — масса растворителя, соответствующая объему взятой пипетки, г;

ро — плотность растворителя при температуре 20 °С.

Проведение испытания

При анализе взвешивают 2 г БАД с точностью до 0,05 г и помещают в фарфоровую ступку. Затем калиброванной пипеткой приливают 4 куб. см растворителя. Содержимое ступки энергично растирают в течение 3 мин. Смесь переносят из ступки на маленький складчатый фильтр. Первые 2 — 3 капли фильтрата отбрасывают, а последующий фильтрат в количестве 2 — 3 капель помещают на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.

При анализе изделий с низкой влажностью перед добавлением песка измельченную навеску смачивают 1 куб. см воды. Охладив массу, приливают точно 4 — 6 куб. см растворителя и вновь все растирают в течение 3 мин., затем добавляют 2 г безводного углекислого натрия, перемешивают, смесь из ступки переносят на складчатый фильтр и фильтруют в стаканчик.

Из полученного фильтрата наносят 2 — 3 капли на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.

Определение коэффициента преломления проводят при 20 +/- 0,2 °С или любой комнатной температуре.

В последнем случае показатель преломления раствора приводят к температуре 20 °С путем внесения поправки по табл. 3.

Таблица 3

ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПОПРАВКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРЕЛОМЛЕНИЯ РАСТВОРА ЖИРА В альфа’-БРОМНАФТАЛИНЕ

Отсчет показателя преломления раствора жира можно также производить при любой комнатной температуре без учета поправки на температуру при условии одновременного определения показателя преломления растворителя при той же температуре.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

где:

— объем растворителя, взятого для извлечения жира, куб. см;

ж — относительная плотность жира при 20 °С;

— коэффициент преломления растворителя;

— коэффициент преломления раствора жира в растворителе;

— коэффициент преломления жира;

М — масса изделия, г;

W — влажность изделия, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое () двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,6% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 1,2% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

При вычислении процентного содержания жира пользуются показателями преломления и плотности жиров, указанными в табл. 4

Таблица 4

КОЭФФИЦИЕНТЫ ПРЕЛОМЛЕНИЯ ЖИРОВ

Примечания.

1. Если в исследуемом образце находится неизвестный жир или имеется смесь жиров, поступают следующим образом: 1 — 5 г измельченного изделия заливают трехкратным количеством растворителя (хлороформа, тетрахлоруглерода и др.), взбалтывают в течение 15 мин., вытяжку фильтруют в колбочку, растворитель полностью отгоняют, остаток подсушивают и определяют коэффициент преломления смеси жиров или неизвестного жира.

2. Для смеси жиров или неизвестного жира плотность принимается равной 0,920.

3. При хорошем растирании навески с растворителем в ступке, когда смесь перенесена на фильтр, разрешается стекающие из воронки капли раствора жира и растворитель наносить на призму рефрактометра, не дожидаясь, пока профильтруется вся смесь.

4. Вся работа с органическими растворителями проводится в вытяжном шкафу или хорошо вентилируемой камере.

В. Бутирометрический метод

Метод основан на растворении исследуемой навески в 60%-ной серной кислоте и отделении слоя жира в молочном бутирометре центрифугированием в присутствии изоамилового спирта, который образует с серной кислотой изоамилово-серный эфир, уменьшающий величину поверхностного натяжения жировых шариков и способствующий слипанию их в единый жировой слой.

Объем выделившегося жира измеряют в градуированной части бутирометра.

Проведение испытания

Из средней пробы готовых образцов отбирают по две навески массой по 2 г каждая. Навески помещают в фарфоровые стаканчики и заливают 9 куб. см 60%-ной серной кислоты.

Стаканчики погружают в водяную баню с температурой воды 80 °С и производят растворение навески в серной кислоте в течение 20 мин. при периодическом перемешивании стеклянной палочкой.

После растворения навески темную жидкость переносят в молочные бутирометры, смывая остатки из стаканчика с помощью 10 куб. см 60% серной кислоты.

В бутирометры осторожно (чтобы не замочить горлышко) приливают по 1 куб. см изоамилового спирта, плотно закрывают резиновыми пробками, плавно перемешивают в течение 3 мин. и помещают в гнезда водяной бани с температурой воды 80 °С на 5 мин. (пробками вниз).

По истечении 5 мин. бутирометры вынимают из водяной бани, размещают в молочной центрифуге (пробками к периферии) и центрифугируют 5 мин. После центрифугирования бутирометры снова помещают на 5 мин. в водяную баню с температурой воды 80 °С (пробками вниз), после чего вынимают и отмечают высоту желтого жирового слоя над темной жидкостью по числу малых делений градуированной части бутирометра.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

где:

N — высота жирового слоя в бутирометре по числу малых делений;

0,01133 — количество жира, соответствующее одному малому делению бутирометра, г;

W — влажность, %;

Q — навеска изделия, г.

Для удобства и ускорения расчета можно использовать данные табл. 5.

Таблица 5

ПОКАЗАНИЯ БУТИРОМЕТРА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ ЖИРА

Для дальнейшего пересчета на сухое вещество умножают массовую долю жира в процентах, найденную по таблице, на 100 и делят на разность (100 — W). За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое () результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

1.3. Определение массовой доли жира в БАД с высоким содержанием жира методом экстракции в аппарате Сокслета

Метод предназначен для определения массовой доли жира в БАД с высоким содержанием жира при проведении исследований и арбитражного анализа.

Диапазон измеряемых концентраций от 40 до 85%.

Метод основан на экстракции растворителем в аппарате Сокслета.

Подготовка к испытанию

Гигроскопическую вату и фильтровальную бумагу помещают в аппарат Сокслета и экстрагируют этиловым эфиром в течение 2 — 3 ч.

Подготовка экстракционных патронов

Патроны для экстракционных насадок типа НЭТ готовят, как указано выше.

Подготовка БАД к экстракции

В фарфоровую ступку взвешивают по разности 5 г БАД с записью значения массы до четвертого десятичного знака. Смешивают с 15 г прокаленного сульфата натрия и переносят в подготовленный экстракционный патрон, после чего ступку и шпатель с помощью пинцета протирают несколько раз ватой, сначала сухой, а затем смоченной этиловым эфиром. Всю вату помещают в тот же патрон. Сверху кладут небольшой слой ваты, затем края патрона завертывают.

Экстракция жира

Патрон с навеской БАД помещают в экстрактор. К экстрактору присоединяют чистую колбу, предварительно высушенную в течение 1 ч при 100 — 105 °С и взвешенную после охлаждения. Через холодильник при помощи воронки наливают в экстрактор этиловый эфир так, чтобы патрон в экстракторе был полностью покрыт слоем эфира. В колбу наливают также эфир на 1/3 ее объема.

Колбу собранного аппарата нагревают на закрытой водяной бане, обеспечивающей равномерное, не слишком сильное кипение эфира. Через 3 ч проверяют полноту экстракции. Для этого, охладив колбу, отсоединяют ее на мгновение от остальной части прибора и 1 — 2 капли эфира с нижнего конца сифона экстрактора наносят на чистое часовое стекло или кусочек фильтровальной бумаги. Экстракцию считают законченной, если после испарения эфира не остается масляных пятен на стекле или бумаге.

По окончании аппарат разбирают, вынимают патрон из экстрактора, последний присоединяют снова к колбе и отгоняют растворитель на водяной бане. Колбу сушат с жиром в сушильном шкафу в течение 1 ч при температуре 100 — 105 °С. Колбу взвешивают после охлаждения ее в эксикаторе. Последующие взвешивания производят через каждые 15 мин. сушки. Масса считается постоянной, если отличается от предыдущей не более чем на 0,0004 г.

Расчет результата определения

Массовую долю жира в БАД в % (X) вычисляют по формуле:

где:

— масса колбы с высушенным жиром, г;

— масса пустой колбы, г;

М — навеска БАД, г.

Конечным результатом считают среднее арифметическое двух параллельных определений () отдельных проб БАД. Вычисления проводят до второго десятичного знака.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где — среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

2. Методы определения жирнокислотного состава

Метод основан на разделении метиловых эфиров жирных кислот, полученных из липидов БАД, с помощью газожидкостной хроматографии.

Выделение липидов из БАД

Липиды выделяют экстракционным методом, предложенным для данной группы БАД, исключающим термическое воздействие на объект и изложенным в вышеприведенных разделах.

Получение метиловых эфиров жирных кислот

Метанолиз в щелочной среде нейтральных масел и жиров проводят по ГОСТ 30418-96 «Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава». Получение метиловых эфиров жирных кислот может быть проведено метанолизом в кислой среде или переэтерификацией липидов метанолом в среде хлористого водорода по ГОСТ Р 51486-99 «Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот».

Для определения абсолютных количеств жирных кислот проводится анализ с применением внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют маргариновую кислоту или дибутилфталат.

Анализ метиловых эфиров жирных кислот методом ГЖХ

Метод основан на использовании газожидкостной хроматографии (ГЖХ) метиловых эфиров жирных кислот по ГОСТ Р 51483-99 «Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме». Результаты выражают в массовых долях каждого индивидуального компонента БАД.

Эталонный стандарт — смесь метиловых эфиров известного состава, желательно, аналогичного составу анализируемого вещества.

Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводят по относительным приведенным временам удерживания или эквивалентным длинам цепи (ЭДЦ).

В качестве неподвижных жидких фаз используют полиэфиры типа полиэтиленгликольадипат, полипропиленгликольадипат, диэтиленгликольсукцинат, цианосиликоны (SP-100, FFAP, силары OV-275, Sil-88) или другие жидкости, дающие необходимое хроматографическое разделение.

Комментарий к условиям анализа

Температура термостата колонок:

а) при анализе смесей метиловых эфиров жирных кислот с длиной цепи более 14 углеродных атомов 170 — 190 °С (изотермический режим). Условия подбирают таким образом, чтобы метилолеат выходил из колонки за 15 мин.;

б) при анализе смесей метиловых эфиров, содержащих низкомолекулярные компоненты, температуру термостата программируют в пределах от 120 до 195 °С со скоростью 6 — 8 °С в 1 мин. (при наличии метилового эфира масляной кислоты начальная температура программирования 70 °С).

Величина вводимой пробы — около 1 — 2 мкл раствора метиловых эфиров в гексане для набивных колонок и 0,2 — 0,3 мкл для капиллярных.

В случае необходимости рекомендуется производить анализ на двух зафиксированных фазах с различными полярностями с целью проверки отсутствия скрытых пиков (для рыбьего жира или в случае одновременного присутствия С18:3, С20:0, С20:1).

Обработка результатов

Качественный анализ

Анализируют эталонную смесь метиловых эфиров. Строят график зависимости логарифма времени удерживания от числа углеродных атомов в цепи. Получают ряд параллельных прямых для насыщенных, моно-, ди- и т.д. ненасыщенных метиловых эфиров кислот или находят величины эквивалентной длины цепи ЭДЦ для ненасыщенных и разветвленных жирных кислот по формуле:

где:

n — число атомов углерода в насыщенной кислоте нормального строения, находящейся на хроматограмме перед неизвестным компонентом;

— логарифм времени удерживания кислоты с n-числом атомов углерода;

— логарифм времени удерживания кислоты с (n+1)-числом атомов углерода;

— логарифм времени удерживания неизвестного компонента.

Идентифицируют пики на хроматограмме анализируемой смеси по полученному графику или по величинам ЭДЦ. Следует избегать условий анализа, при которых происходит наложение пиков метиловых эфиров различных кислот (например, метиллинолената и метиларахината).

Количественный анализ и способы расчета

За исключением специальных анализов расчет проводят методом внутренней нормализации, когда все компоненты смеси представлены на хроматограмме и площадь всех пиков компонентов составляет 100%. При наличии интегратора пользуются полученными с его помощью цифрами. При отсутствии интегратора площади пиков измеряют, умножая высоту пика на его ширину (или ширину пика на половине его высоты) и учитывая переключения чувствительности усилителя, используемые во время записи хроматограммы.

Расчет без использования поправочных коэффициентов

Расчет массовой доли i-го компонента в % проводят по формуле:

где:

С — массовая доля i-го компонента;

— площадь пика i-го компонента;

— сумма всех площадей пиков.

За результат анализа принимают среднее арифметическое () из двух параллельных измерений.

Расчет с использованием поправочных коэффициентов

В случае, когда в анализируемой смеси присутствуют кислоты с 12 и менее углеродными атомами в цепи, расчет ведется с применением поправочных коэффициентов.

Поправочные коэффициенты () рассчитывают по хроматограммам эталонных смесей известного состава, полученным в условиях, применяемых для анализа образца по формуле:

где:

— масса i-го компонента в эталонной смеси, г;

— масса эталонной смеси, г.

Часто используют относительные поправочные коэффициенты () по отношению к поправочному коэффициенту метилпальмитата ():

Массовую долю i-го компонента анализируемой смеси определяют по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое из двух параллельных измерений с записью до первого десятичного знака.

Расчет с применением внутреннего стандарта

В случаях, когда не все компоненты в анализируемой смеси элюируются из колонки или присутствуют очень летучие компоненты, используют для расчета метод внутреннего стандарта.

В качестве внутреннего стандарта применяют метиловые эфиры кислот, отсутствующие в анализируемой смеси. При анализе проб, содержащих масляную кислоту, в качестве внутреннего стандарта используют валериановую кислоту, в остальных случаях — пентадекановую или маргариновую кислоту. Массовую долю i-го компонента пробы определяют по формуле:

где:

m — содержание липидов в продукте, мг в 100 г;

— масса внутреннего стандарта, мг;

М — масса образца, мг;

— поправочный коэффициент внутреннего стандарта;

— площадь пика внутреннего стандарта.

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения содержания жирных кислот в продукте рассчитывают (в %) по следующим формулам:

но не более 1% абсолютного содержания кислоты;

но не более 3% абсолютного содержания кислоты.

3. Методы определения стеринов

3.1. Колориметрический метод определения содержания стеринов после омыления проб

Метод основан на колориметрической реакции стеринов, извлекаемых диэтиловым эфиром из омыленных проб растительных масел, с уксусным ангидридом в присутствии концентрированной серной кислоты.

Условия проведения анализа

Экстракцию неомыленных веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.

Подготовка к проведению анализа

Приготовление и очистка реактивов

Безводный сернокислый натрий прокаливают в течение 1 — 1,5 ч при температуре 110 °С. Диэтиловый эфир обрабатывают марганцовокислым калием (5 г на л) и гидратом окиси калия (10 г на 1 куб. дм) в течение суток, а затем перегоняют. Этиловый спирт ректификованный технический освобождают от альдегидов. Начальную и конечную порции отгона отбрасывают. Хлороформ сушат в течение суток под хлористым кальцием и перегоняют.

Построение градуировочного графика

Градуировочный график строят на основании результатов анализа проб с известным содержанием чистого бета-ситостерина.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см отвешивают 0,15 — 0,20 г бета-ситостерина (с записью результата до 4-го знака после запятой). Навеску растворяют в 100 куб. см хлороформа. Из полученного раствора готовят серию стандартных растворов с содержанием бета-ситостерина 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20 г/куб. дм. Из каждого раствора отбирают пипеткой 3 куб. см, добавляют 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель серной кислоты. Через 10 мин. после добавления кислоты измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм. В качестве контроля служит раствор, состоящий из 3 куб. см хлороформа, 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.

Градуировочный график строят в координатах: оптическая плотность (D) — концентрация стандартных растворов бета-ситостерина. Градуировочный график строят для каждого спектрофотометра и проверяют при смене партий путем определения оптической плотности стандартных растворов двух разных концентраций.

Проведение анализа

Испытуемый образец (1 — 3 г) взвешивают в колбе вместимостью 100 куб. см (с записью результата взвешивания до 4-го знака после запятой), добавляют 0,1 — 0,3 г аскорбиновой кислоты и 10 — 30 куб. см свежеприготовленного 2 н. спиртового раствора KOH. Смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин.

Содержимое колбы охлаждают и количественно переносят в делительную воронку с 30 — 90 куб. см дистиллированной воды. Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым эфиром 3 — 4 раза порциями по 20 — 60 куб. см. Объединенный эфирный экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной реакции промывной воды по фенолфталеину. Промытую эфирную вытяжку помещают в коническую колбу, засыпают 5 — 10 г безводного сульфата натрия и оставляют в темном месте на 30 мин., периодически взбалтывая. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу, фильтр ополаскивают эфиром. Эфир отгоняют под вакуумом при температуре не выше 25 — 30 °С.

Остаток в колбе после отгонки эфира растворяют в зависимости от навески исследуемого образца в 1 — 3 куб. см бензола. Затем производят разделение компонентов смеси неомыляемых веществ методом тонкослойной хроматографии. Для этого на пластинку «Силуфол» наносят 50 — 150 мкл бензольного раствора неомыляемых веществ в виде полоски, отстоящей на 2 см от нижнего и боковых краев пластинки.

На одном уровне с пробой на расстоянии 1 см от краев пластинки наносят по капле раствор бета-ситостерина. Пластинку помещают вертикально в хроматографическую камеру, в которую заранее наливают смесь диэтилового и петролейного эфиров, взятых в соотношении 1:1. Количество растворителя зависит от размеров хроматографической камеры и регулируется высотой его слоя, равной 1 см.

Развитие хроматограммы продолжается до тех пор, пока фронт растворителя не поднимается на 10 — 12 см. Обычно это занимает 10 — 12 мин. Затем пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе до исчезновения запаха эфира. Края хроматограммы шириной 2 см опрыскивают 5%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты, после чего пластинки помещают на 1 — 5 мин. (до проявления) в термостат с температурой около 90 °С. На уровне окрашенного пятна свидетеля соскребают слой адсорбента. Адсорбент элюируют хлороформом 6 — 8 раз порциями по 1 куб. см. После каждого элюирования адсорбент отделяют центрифугированием или фильтрацией. Объединенный элюат собирают в градуированную пробирку и упаривают до объема 3 куб. см. К хлороформному раствору стеролов приливают 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты (по капле). Через 10 мин. измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм.

Контролем служит раствор, состоящий из 3 куб. см хлороформа, 2 куб. см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.

Обработка результатов

Массовую долю стеринов в пробе (X, %) рассчитывают по формуле:

где:

V — объем хлороформного раствора, взятого для проведения колориметрической реакции, куб. см;

— объем бензольного раствора неомыляемых веществ, куб. см;

— объем бензольного раствора неомыляемых веществ, нанесенный на пластинку, куб. см;

С — концентрация стеролов, определяемая по градуировочному графику, г/куб. дм;

М — масса образца, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 6.

Таблица 6

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

3.2. Определение состава стеринов методом ГЖХ

Метод основан на прямом газохроматографическом анализе стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ.

Условия проведения анализа

Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов, предложенных для данного продукта и исключающих разрушение стеринов.

Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.

Подготовка к проведению анализа

Подготовку проводят по п. «Колориметрический метод определения содержания стеринов».

Проведение анализа

Выделение стеролов из липидов

Омыление липидов, экстракцию неомыляемых веществ, выделение стеринов методом тонкослойной хроматографии проводят по п. «Колориметрический метод определения содержания стеринов».

Газохроматографический анализ

Аппаратура, используемая для проведения анализа, выбор оптимальных условий для разделения стеринов, определение эффективности хроматографических колонок изложены в п. выше.

Устанавливают следующие условия анализа на хроматографе: стеклянная или стальная колонка длиной 1,5 — 2,0 м и внутренним диаметром 3 — 4 мм, заполненная силанизированным целитом 545 (60 — 100 меш.), обработанным 3% полиметилсилоксаном SE-30 или аналогичной неподвижной фазой. Скорость потока газа-носителя 60 — 100 куб. см/мин. Температура термостата колонки 250 — 270 °С, инжектора 300 °С, детекторов 280 °С.

Вводят в хроматограф около 3 мкл каждого компонента.

Обработка результатов

Рассчитывают площади пиков каждого компонента () по формуле:

где:

— ширина i-го пика на половине его высоты, мм;

— высота i-го пика, мм;

— поправочный коэффициент.

Для получения поправочных коэффициентов составляют 3 — 4 стандартные смеси стеролов, входящих в исследуемые образцы, и холестерола. По хроматограммам стандартных смесей, полученных в идентичных условиях, определяют поправочные коэффициенты по отношению к холестеролу, коэффициент которого принят за единицу, по формуле:

где:

— масса i-го компонента и стандарта (холестерина);

— площади их пиков соответственно.

Молярную долю каждого стерина () рассчитывают методом нормализации по формуле, принимая сумму площадей всех типов за 100%:

где:

— площадь пика i-го компонента;

— сумма площадей пиков стеринов.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 7

Таблица 7

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

3.3. Метод хромато-масс-спектрометрии в анализе стеринов

Метод основан на прямом хромато-масс-спектрометрическом анализе стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ.

Условия проведения анализа

Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов, предложенных для данного БАД и исключающих разрушение стеринов.

Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света, отгонку растворителя следует проводить под вакуумом на ротационном испарителе при комнатной температуре.

Подготовку к проведению анализа и выделение стеринов из липидов проводят по п. «Колориметрический метод определения содержания стеринов».

Условия анализа: хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных, энергия ионизирующих электронов 70 eV; диапазон массовых чисел 39 — 500 а.е.м.; температура источника ионов 120 °С; хроматографическое разделение на капиллярной колонке 47 м х 0,3 мм с химически связанной фазой SE-30, начальная температура колонки 50 °С — 2 мин., 240 °С — 8 мин. с последующим программированием со скоростью 4 °С/мин. до 300 °С и изотермой (30 мин.), температура испарителя 280 °С, переходных линий 275 °С. Скорость газа-носителя гелия 1,3 куб. см/мин., в момент ввода пробы сброс перекрыт на 30 с, далее деление потока 1:60.

Структуру компонентов определяют путем сравнения полученных масс-спектров с имеющейся базой данных, а также по молекулярным и характеристическим осколочным ионам, выбор которых определяется эмпирическими корреляциями между масс-спектром и структурой изучаемых стеринов.

Таблица 8

СОСТАВ ФРАКЦИЙ СТЕРИНОВ, % ОТН., ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЯДА БАД НА РАСТИТЕЛЬНОЙ ОСНОВЕ И НА ОСНОВЕ МОРЕПРОДУКТОВ, ПОЛУЧЕННЫЙ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

4. Метод определения фосфолипидов (определение суммарного фосфора)

Метод основан на способности фосфора, соединяясь с молибденом аммония, образовывать фосфорно-молибденовую кислоту, которая восстанавливается амидоловым реагентом и дает голубое окрашивание.

Специфические приборы и реактивы

Спектрофотометр.

Молибдат аммония, 8,4%-ный.

Амидоловый реагент, 1%-ный, свежеприготовленный.

Спиртовой раствор фосфора, 1,097 г КН2РО4 растворяют в 250 куб. см воды, этот запасной раствор разбавляют водой и получают рабочий раствор, содержащий 10 мкг фосфора в 1 куб. см.

Подготовка проб

Пипеткой отбирают аликвотную часть раствора липидов (содержащую 10 — 100 мкг фосфора, но не более 2 мг липидов) и переносят ее в толстостенную пирексовую пробирку с делениями, соответствующими 12,5 и 25 куб. см. Растворитель упаривают досуха в токе воздуха при 350 °С, к остатку прибавляют 2,0 куб. см хлорной кислоты, немного стеклянных шариков и нагревают пробирку на электрической плитке или газовой горелке до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и бесцветным. Охлажденный раствор разбавляют водой по 12,5 куб. см, тщательно перемешивают, добавляют 1,0 куб. см раствора молибдата аммония, перемешивают и оставляют на 20 мин. до появления голубой окраски.

Проведение испытания

Окрашенный раствор разбавляют водой по 25 куб. см, перемешивают. На спектрофотометре типа СФ-46 в парных кюветах 1 см определяют поглощение при 680 нм полученного раствора и р-ра холостого опыта.

Обработка результатов

Расчет производят по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору КН2РО4. Используют аликвотные пробы стандартного раствора, содержащие от 30 до 60 мкг фосфора. Закон Бера соблюдается в интервале 10 — 100 мкг фосфора.

III. Методы определения углеводов

1. Определение содержания крахмала с помощью поляриметрического метода

Метод определения массовой доли крахмала в БАД на зерновой основе распространяется на продукты с массовой долей крахмала выше 10%. Содержание крахмала определяют поляриметрическим методом путем его гидролиза раствором соляной кислоты.

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Сахариметр или поляриметр.

Мельница лабораторная, обеспечивающая требуемую крупность размола.

Сито из проволочной сетки N 08 по ТУ 14-4-1374-86.

Соляная кислота по ГОСТу 3118-77, раствор массовой концентрацией 11,24 г/куб. дм, для анализа картофеля — 3,77 г/куб. дм.

Калий железистосинеродистый по ГОСТу 4207-75, раствор массовой концентрацией 150 г/куб. дм.

Цинка сульфат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией 150 г/куб. дм.

Аммония молибдат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией 100 г/куб. дм.

Натрия молибдат по ГОСТу 10931-74, раствор массовой концентрацией 150 г/куб. дм.

Фосфорно-вольфрамовая кислота, раствор массовой концентрацией 40 г/куб. дм.

Подготовка к испытанию

Пробы, влажность которых превышает 17%, предварительно подсушивают на воздухе или в одном из следующих устройств: сушильном шкафу, термостате, лабораторном сушильном аппарате при температуре воздуха не более 50 °С. Пробу тщательно перемешивают, измельчают до такой степени, чтобы весь размолотый материал прошел при просеивании через сито из проволочной сетки N 8.

Одновременно со взятием навесок для анализа берут навески для определения влажности. Определение влажности осуществляется по ГОСТам, принятым в соответствующей отрасли.

Проведение испытания

Из аналитической пробы берут навеску массой 5 г с погрешностью не более 0,01 г, помещают в 100 куб. см центрифужный стакан, доливают 18 куб. см 10% раствора этанола (при определении массовой доли крахмала в отрубях — 28 куб. см раствора этанола) и перемешивают стеклянной палочкой. Стеклянную палочку ополаскивают 2 куб. см раствора этанола. Закрывают центрифужный стакан резиновой пробкой и вручную сильно встряхивают в течение 2 мин.

После встряхивания стенки центрифужного стакана и резиновую пробку ополаскивают 25 куб. см этанола. Затем в течение 20 мин. пробу центрифугируют при 4000 об./мин., после чего прозрачный центрифугат сливают. К остатку постепенно добавляют 20 куб. см соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой до образования суспензии и переносят в мерную колбу на 100 куб. см. Прилипшие к стенкам центрифужного стакана и к стеклянной палочке остатки пробы многократно ополаскивают раствором соляной кислоты массовой концентрацией 11,24 г/куб. дм в мерную колбу; общее количество раствора соляной кислоты составляет 50 куб. см.

Мерную колбу при постоянном встряхивании погружают в кипящую водяную баню. Из-за погружения мерной колбы не должен нарушаться процесс кипения водяной бани: с помощью специальных уплотнительных колец ее следует держать по возможности закрытой. По секундомеру встряхивают мерную колбу в течение 3 мин., при этом колбу из водяной бани не поднимают. После этого выдерживают колбу без встряхивания для всех крахмалосодержащих БАД 12 мин.

По истечении в общей сложности 15 мин. для всех крахмалосодержащих БАД колбу вынимают из бани и быстро приливают столько холодной воды, чтобы до мерной черты оставался объем не более 10 — 15 куб. см. Содержимое колбы охлаждают в проточной воде до температуры 20 °С.

Белковые вещества в растворе осаждают добавлением 2 куб. см раствора калия железистосинеродистого (150 г/куб. дм) и после перемешивания 2 куб. см раствора цинка сульфата (150 г/куб. дм). Затем мерную колбу в течение 10 — 15 мин. выдерживают при комнатной температуре, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и в течение 5 мин. дают отстояться. Взамен обоих указанных реактивов в случае их отсутствия для осаждения белков и осветления раствора в колбу приливают 5 куб. см раствора аммония молибдата (100 г/куб. дм), или 5 куб. см раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (40 г/куб. дм), или 3 куб. см раствора натрия молибдата (165 г/куб. дм). При использовании молибдатов в качестве осадителей белков рекомендуется избегать попадания солнечных лучей на реактивы. Содержимое колбы через сухой складчатый фильтр фильтруют в сухую коническую колбу, первые несколько капель фильтрата отбрасывают. Прозрачным фильтром заполняют трубку поляриметра и в поляриметре измеряют оптическое вращение. Угол вращения испытуемого раствора в трубке поляриметра измеряют 5 раз.

До начала и после каждого второго измерения производят контроль установки поляриметра на нуль. Средняя величина 5 измерений служит исходной величиной для дальнейших вычислений массовой доли крахмала.

Обработка результатов

Массовую долю крахмала (X) в процентах вычисляют по следующим формулам.

При использовании сахариметра с нормальной шкалой:

или при использовании поляриметра с круговой шкалой:

где:

К — переводной коэффициент, который при длине трубки 2 дм равен 1,9;

а — показатель сахариметра или поляриметра в градусах шкалы (переводные коэффициенты К для длины трубки 1 дм умножают на 2).

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных определений (r) не должны превышать значений:

но не более 0,5% абсолютного содержания крахмала в БАД, где — среднее арифметическое двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать значений:

но не более 1,2% абсолютного содержания крахмала в продукте,

где — среднее значение результатов измерений, выполненных в двух разных лабораториях.

2. Определение содержания и состава углеводов

2.1. Определение состава углеводов с помощью метода ГЖХ

Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы, сорбита и инозита в БАД в триметилсилильные производные с последующим их газохроматографическим анализом.

Специфические реактивы, материалы и аппаратура

Гексан х.ч.

Гексаметилдисилазан.

Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан.

Пиридин х.ч., безводный.

Ксилит х.ч. или инозит.

Свинец уксуснокислый х.ч.

Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50.

Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и устройством для программирования температуры.

Стеклянная насадочная колонка длиной 2 — 3 м и диаметром 3 — 4 мм или капиллярная колонка длиной 25 — 30 м с нанесенной фазой.

Микрошприц емкостью 1,0 — 10 мкл.

Роторный испаритель.

Подготовка образцов

БАД с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5%)

Содержание лимонной кислоты устанавливается по «Таблицам химического состава». Навеску гомогенизированной пробы БАД с высоким содержанием сухих веществ (более 60%) наносят на полиэтиленовую пластинку в количестве 50 — 150 мг и взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,0001 г. На этой же пластинке взвешивают 5 — 10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную колбу емкостью 10 — 25 куб. см и силилируют без обезвоживания с использованием трифторуксусной кислоты. При использовании триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом. В случае медленного упаривания в колбу добавляют 1 куб. см бензола. После упаривания проводят силилирование.

Жидкие БАД отмеряют пипеткой в количестве 0,5 — 1,0 куб. см и помещают в круглодонную колбу емкостью 10 — 25 куб. см, снабженную шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5 — 10 мг ксилита, взвешенного с точностью до 0,0001 г. Содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе.

БАД с содержанием лимонной кислоты более 1,5%

Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты на ТМС-производное бета-глюкозы лимонную кислоту осаждают уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы БАД (содержащие лимонную кислоту как пищевую или консервирующую добавку) в количестве 1 — 15 г взвешивают с точностью до 0,001 г в конической колбе емкостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см 75 — 80% раствора этанола и экстрагируют 30 мин. при температуре 60 — 70 °С. Используют водяную баню и обратный холодильник. Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют.

Колбу доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную пробирку на 10 куб. см вносят пипеткой 5 куб. см отфильтрованного экстракта, 0,5 куб. см насыщенного раствора уксуснокислого свинца. Осадок центрифугируется. 1 куб. см надосадочной жидкости переносят в шлифную круглодонную колбу емкостью 10 — 25 куб. см. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску ксилита 5 — 10 мг. Содержимое колбы упаривается на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом.

Получение триметилсилильных (ТМС) производных

Способ с использованием трифторуксусной кислоты

В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 куб. см пиридина, 0,9 куб. см гексаметилдисилазана, 0,1 куб. см трифторуксусной кислоты, плотно закрывают и энергично встряхивают в течение 30 с. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы, при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в течение 20 — 30 мин. это расслоение исчезает и начинает выделяться аммиак, что указывает на успешное протекание реакции силилирования. После прекращения выделения аммиака раствор выдерживают 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 60 °С. Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не полностью из-за высокого содержания влаги (более 40%) или повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время высушивания на роторном испарителе.

Способ с использованием триметилхлорсилана

В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 куб. см пиридина, 0,2 куб. см гексаметилдисилазана и 0,1 куб. см триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 мин. и нагревают в термостате 45 мин. при 60 °С, затем хроматографируют.

Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10 куб. см пиридина и выдерживают в термостате при 80 °С в течение 2 ч. Охлаждают и далее приливают силилирующие реагенты.

Газохроматографический анализ

Подготовка хроматографической колонки

Условия: стеклянная колонка, наполненная сорбентом, с 3 — 5% неподвижной жидкой фазы, длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм. Температуру колонки программируют от 125 до 270 °С со скоростью 4 °С в 1 мин., температура испарителя 250 °С, расход газа-носителя 40 куб. см/мин., температура пламенно-ионизационного детектора 250 °С.

Газохроматографическое определение

1,0 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных углеводов вводят в испаритель хроматографа и элюируют из колонки газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных производных проводят по времени удерживания триметилсилильных производных сахаров-метчиков и методом добавки.

Приготовление калибровочных растворов

Сахара, имеющие альфа- и бета-аномеры

Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с точностью до 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после чего проводят силилирование.

Сахара, не имеющие аномеров

Сахара, не имеющие аномеров, силилируют без предварительного растворения.

Обработка результатов

Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске БАД определяют по формуле:

где:

— содержание отдельного сахара в навеске, %;

— поправочный коэффициент данного сахара;

С — масса навески стандарта, мг;

Q — навеска образца

— площадь пика стандарта в относительных единицах;

— площадь пика данного сахара в относительных единицах.

Расчет площадей хроматографических пиков сахарозы и альфа-лактозы при их совместном присутствии в пробе

Ввиду того, что альфа-лактоза и сахароза выходят на хроматограмме одним пиком, площадь пика альфа-лактозы определяют исходя из соотношения площадей альфа- и бета-лактозы в модельном соединении лактозы. За основу берется площадь пика бета-лактозы. Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика сахарозы пика альфа-лактозы, рассчитанного из пика бета-лактозы. За окончательный результат принимают среднеарифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Окончательный результат округляют до трехзначной цифры.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) зависят от содержания сахаров в продукте.

При содержании отдельных сахаров типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, рафинозы, инозита и сорбита в продукте в пределах от 1 до 5%:

— значения Rr = 20%, RR = 40% для каждого сахара; при содержании отдельного сахара в продукте свыше 5%;

— значения Rr = 10%, RR = 25% для каждого сахара.

2.2. Определение состава углеводов с помощью метода ВЭЖХ

Настоящий метод основан на выделении, разделении и количественном определении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии моно-, ди-, олигосахаров, а также сахарных спиртов. Он распространяется на определение глюкозы, фруктозы, арабинозы, фукозы, галактозы, ксилозы, лактозы, лактулозы, мальтозы, мальтотриозы, маннозы, сахарозы, раффинозы, стахиозы, сорбита, инозита, мальтита, ксилита, изомальта, лактитола, добавленных в БАД.

Приборы и реактивы

Прибор для проведения хроматографии методом ВЭЖХ, состоящий из насоса, детектора-рефрактометра, колонки 250 мм х 4 мм Сепарон SGX NH2 или аналогичной.

Компьютер с программным обеспечением по приему и обработке хроматографических данных.

Ротационный испаритель, водяная баня, обратный холодильник, две стеклянные колонки 7 — 10 см (внутренний диаметр 10 мм).

Ацетонитрил CH3CN для хроматографии.

Этиловый спирт 80%.

Ионообменная смола Дауэкс 50 х 4, 200 — 400 меш. ( — форма).

Ионообменная смола Дауэкс 1 x 8, 200 — 400 меш. (формиатная форма).

2Н NaOH, 3Н HCl, 3Н формиат натрия, бидистиллированная вода.

0,1%-ный раствор азотнокислого серебра.

Изопропиловый спирт.

Экстракция

Углеводы извлекают из БАД 80% этиловым спиртом с учетом естественной влаги. Навеску БАД заливают в колбе в соотношении 1:4 по сухим веществам 96% этанолом и необходимым количеством воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80 — 82%. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70 — 80 °С в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают. К остатку приливают опять раствор 80%-ного спирта и экстракцию повторяют в тех же условиях. Всего углеводы экстрагируют из продукта 3 — 4 раза.

Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Очистка экстракта

Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и др.). Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей, экстракты пропускают через колонку с дауэксом 50 х 4, непосредственно соединенную с колонкой, содержащей дауэкс 1 x 8.

Подготовка дауэкс 50 х 4, 200 — 400 меш.

Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2н NaOH, дистиллированной водой, 3н HCl и опять водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения колонки.

Ионообменная способность для дауэкса 50 х 4 в сухом виде составляет 5,1 мэкв/куб. см и во влажном 1,7 мэкв/куб. см соответственно.

Подготовка дауэкс 1 x 8, 200 — 400 меш.

Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из дауэкса 1 x 8 ( — форма), пропуская через смолу на бюхнеровской во нке 3н формиат натрия до тех пор, пока проб на не станет отриц ельной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу п мывают льшими ъемами дистилли ванн воды и заполняют лонку. Ионо менная способность для дауэкса 1 х 8 в сухом виде составляет 3,2 мэкв/куб. см и во влажном виде 1,4 мэкв/куб. см.

С двух колонок собирают элюент и, если необходимо, его концентрируют в роторном испарителе. Чтобы упарить воду и не поднимать температуру, к образцу добавляют этанол. Упаренный образец переносят в мерную посуду и замеряют объем и хроматографируют.

Анализ ВЭЖХ

Подготовка колонки

Для этого колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Условия ВЭЖХ

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (77:23). Смесь дегазируют на роторном испарителе. Подвижная фаза для мальтотриозы, стахиозы и рафинозы: ацетонитрил — вода (60:40).

Детектирование — рефрактометр. Скорость потока 2,5 куб. см /мин. Стандартный раствор углевода 10 мг/куб. см предварительно высушивают в сушильном шкафу при 105 °С до постоянного веса в стеклянных бюксах. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows или аналогичной. Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +/- 5%.колонку.

Определение содержания глюкозы в смеси с сорбитом

При описанных выше условиях хроматографирования время удерживания глюкозы и сорбита одинаковое и на хроматограмме они выходят единым пиком. В таких случаях количество глюкозы определяют глюкозооксидазным методом с использованием соответствующего ферментативного набора. Проведение анализа описано в соответствующем наборе. Количество сорбита определяют расчетным способом как разницу суммарного содержания глюкозы и сорбита (по хроматограмме) и глюкозы (полученной ферментативным методом). В связи с разницей рефрактометрического индекса глюкозы и сорбита в расчетную формулу вводят поправочный коэффициент:

где К — коэффициент пропорциональности, взятый из программы МультиХром.

3. Определение содержания пектина

Образец измельчают, взвешивают около от 1 до 5 г (в зависимости от того, сколько содержится пектина в образце), переносят в стеклянную колбу, заливают кипящей водой, в которую добавлена концентрированная соляная кислота из расчета 0,8 куб. см на 250 куб. см дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании в течение 30 мин. при 95 — 100 °С. Охлаждают до температуры ниже 25 °С, чтобы свести к минимуму тепловое разрушение пектина, и фильтруют на воронке Бюхнера через капроновую ткань с отсасыванием. Если смесь плохо фильтруется, ее центрифугируют при 5000 об./мин. в течение 30 мин. Экстракцию проводят дважды, экстракты и промывную воду объединяют, измеряют количество и к охлажденному раствору пектина прибавляют 1,5 объема этанола (можно использовать изопропиловый спирт или ацетон), содержащего 2 куб. см концентрированной соляной кислоты (уд. вес 1,19) на 1 л. Смесь перемешивают вручную медленно и тщательно и оставляют стоять на 30 мин. с тем, чтобы пектин всплыл на поверхность. Большую часть не содержащего пектина раствора можно отделить сифонированием. Осадок пектина отделяют центрифугированием, промывают спиртом до тех пор, пока реакция с нитратом серебра на ион-хлорид в промывных растворах будет отрицательной. Осадок сушат в термостате при 60 °С до постоянного веса.

Содержание пектина определяют гравиметрически.

Ошибка метода 5%. Метод не пригоден для БАД, содержащих большие количества (более 30%) сахарозы.

4. Методы определения содержания редуцирующих веществ, общего сахара и сахарозы

4.1. Колориметрический метод

Метод основан на колориметрировании избытка щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия после реакции с редуцирующими сахарами объекта исследования. При этом гексацианоферрат (III) восстанавливается до гексацианоферрата (II), что ведет к ослаблению окраски, так как K3[Fe(CN)6] окрашен значительно интенсивнее, чем K4[Fe(CN)6].

Специфические реактивы

Глюкоза кристаллическая гидратная, х.ч. по ГОСТу 975-88.

Гексацианоферрат (III) калия, х.ч. по ГОСТу 4206-75.

Гидроксид калия, ч.д.а. по ГОСТу 24363-80 или гидроксид натрия, ч.д.а., по ГОСТу 4328-77, раствор с концентрацией NaOH (или KOH) 2,0 М и 1,25 М.

Кислота хлороводородная, х.ч. по ГОСТу 3118-77, раствор с концентрацией 1 М.

Натрия хлорид, х.ч., по ГОСТу 4233-77.

Метиленовый голубой, индикатор, 1 г растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды и фильтруют.

Сахароза, х.ч. по ГОСТу 5833-75 или сахар-рафинад по ГОСТу 22-78.

Цинка сульфат, х.ч., по ГОСТу 4174-77, раствор с концентрацией 0,5 М.

Внимание! Перед проведением анализа необходимо в обязательном порядке проверить вместимость мерной посуды и пипеток по I классу точности!

Подготовка к анализу

Приготовление раствора гексацианоферрата (III) калия — основной реактив. Взвешивают 8 г K3[Fe(CN)6] и 20 г NaOH (или 28 г KOH). Отдельно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем оба раствора сливают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор готов к использованию через сутки. Раствор можно хранить в склянке из темного стекла в течение 2 мес.

Приготовление стандартного раствора глюкозы

1,6000 г безводной глюкозы взвешивают с точностью до 0,0002 г и растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см. Предварительно глюкозу выдерживают в эксикаторе над свежепрокаленным хлоридом кальция в течение 3 сут. После растворения навески раствор в колбе доводят до метки. Если раствор готовят на месяц, необходимо внести в колбу 150 г хлорида натрия и хранить в холодильнике.

Построение градуировочного графика

В 6 конических колб вместимостью 100 куб. см вносят пипеткой по 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и по 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5 куб. см стандартного раствора глюкозы. Из бюретки соответственно приливают 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 куб. см дистиллированной воды, тем самым доводят объем жидкости в каждой колбе до 41 куб. см. Содержимое каждой колбы нагревают до кипения за 3 мин. и кипятят в течение 1 мин., закрыв часовым стеклом. Затем охлаждают и измеряют оптическую плотность на ФЭК со светофильтром, имеющим лямбда эф = 440 нм (синий светофильтр). Раствором сравнения служит дистиллированная вода. Кювету подбирают такого размера, чтобы оптическая плотность была в пределах 0,3 — 0,6 для раствора, содержащего 8,5 куб. см раствора глюкозы (10, 20 или 30 мм). Оптическую плотность определяют в каждом растворе не менее 3-х раз и из полученных данных берут среднее арифметическое значение. Строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации глюкозы в растворе. Полученный график используют для определения содержания общего сахара, восстанавливающих сахаров и сахарозы.

Приготовление исследуемого раствора

Объект исследования тщательно измельчают в ступке. Затем готовят водную вытяжку объекта исследования. Массу навески М в граммах рассчитывают по формуле:

где:

V — вместимость колбы, куб. см;

Р — предполагаемое содержание общего сахара в объекте исследования, %;

С — оптимальная для данного метода концентрация сахаров в водной вытяжке на 100 куб. см (принимают равной 0,16 г).

Растворение навески и осаждение несахаров проводят следующим образом. Образец измельченного исследуемого БАД взвешивают с погрешностью не более 0,01 г из такого расчета, чтобы в 100 куб. см полученного раствора содержалось 0,3 — 0,4 г редуцирующих веществ. Массу навески М в граммах вычисляют по формуле:

где:

С — оптимальное содержание редуцирующих веществ в 100 куб. см раствора навески, г;

V — вместимость мерной колбы, куб. см;

Р — предполагаемая массовая доля редуцирующих веществ в исследуемом изделии, %.

Навеску растворяют в стакане в дистиллированной воде, нагретой до 60 — 70 °С. Если БАД растворяется без остатка, то полученный в стакане раствор охлаждают и переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и хорошо перемешивают. Если БАД в своем составе имеет вещества, нерастворимые в воде (мешающие несахара — белки, жиры, пектины, крахмал и т.д.), то навеску в стакане переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, смывая нерастворимые частицы в колбу дистиллированной водой примерно до половины объема колбы. Органические кислоты, содержащиеся в навеске, нейтрализуют раствором углекислого натрия до pH 7,0, применяя для контроля универсальную индикаторную или лакмусовую бумагу. Колбу помещают в водяную баню, нагретую до 60 °С, при этой температуре, временами взбалтывая, выдерживают в течение 15 мин. Охладив раствор до комнатной температуры, осаждают мешающие несахара, прибавляя к раствору в колбе 10 куб. см 1 М раствора сульфата цинка, если масса навески была менее 5 г, и 15 куб. см, если масса навески была более 5 г, и такой объем 1 М раствора гидроксида натрия, который установлен отдельным опытом при титровании соответствующего объема раствора сульфата цинка с фенолфталеином.

Содержимое колбы взбалтывают, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу, которую предварительно ополаскивают 1 — 2 раза небольшой порцией фильтрата.

Допускается осаждение несахаров другими осадителями: растворами ацетата свинца и фосфата (или сульфата) натрия и растворами гексацианоферрата (II) калия и ацетата цинка. При осаждении несахаров ацетатом свинца к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют мерным цилиндром 7 куб. см раствора ацетата свинца, хорошо перемешивают и оставляют стоять 5 мин. Появление прозрачного слоя жидкости над осадком указывает на полноту осаждения, в противном случае вносят дополнительно по каплям раствор ацетата свинца до появления прозрачного слоя жидкости. Затем в эту же колбу для удаления избытка ацетата свинца вносят 18 — 20 куб. см раствора фосфата (или сульфата) натрия.

Содержимое колбы взбалтывают, осадку дают отстояться. Для осаждения избытка ацетата свинца фосфатом натрия достаточно 10 мин. При осаждении сульфатом натрия при мутном растворе жидкость отстаивается 24 ч. После отстаивания проверяют полноту осаждения, приливая по стенке горлышка колбы несколько капель раствора фосфата или сульфата натрия. При помутнении жидкости прибавляют дополнительно один из указанных выше растворов (1 — 2 куб. см), затем содержимое колбы взбалтывают, дают отстояться и снова проверяют полноту осаждения. При отсутствии помутнения в месте соприкосновения жидкостей содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют в сухую колбу.

При осаждении несахаров раствором гексацианоферрата (II) калия к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют пипеткой 2 куб. см раствора гексацианоферрата (II) калия, взбалтывают, добавляют 2 куб. см раствора ацетата цинка, снова взбалтывают и дают отстояться 5 мин. Если раствор над осадком остается мутным, добавляют большее количество указанных растворов в равных объемах. Содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу. Во всех случаях фильтрат должен быть прозрачным.

При анализе окрашенных БАД (сокосодержащих и т.п.) необходимо связать красящие вещества и нейтрализовать органические кислоты раствором 1 М гидроксида натрия или 1 М гидроксида калия и связать дубильные вещества ацетатом свинца. Для этого добавляют к пробе по капле раствор карбоната натрия или 1 М раствор гидроксида натрия до слабокислой или нейтральной реакции и 30%-ный раствор ацетата свинца. После тщательного перемешивания и отстаивания добавляют по каплям раствор сульфата натрия до прекращения образования осадка, для связывания избытка ацетата свинца. Доводят водой до метки, отстаивают и фильтруют.

Проведение анализа

Определение восстанавливающих сахаров

В коническую колбу вместимостью 100 — 150 куб. см вносят 10 куб. см раствора пробы, 6 куб. см дистиллированной воды и затем 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин., кипятят 1 мин., охлаждают и измеряют оптическую плотность при лямбда = 440 нм. Раствор сравнения — дистиллированная вода. Кювету берут размером, аналогичным взятому для построения градуировочного графика. Если оптическая плотность раствора не попадает в интервал 0,3 — 0,6, необходимо взять меньшую аликвоту пробы или поменять разведение, сохраняя постоянный объем жидкости в реакционной колбе равным 41 куб. см. Результаты вычисляют, пользуясь градуировочным графиком и нижеприведенной формулой.

Определение общего сахара

Для определения общего сахара проводят гидролиз сахарозы. В реакционную коническую колбу вместимостью 100 — 150 куб. см отмеривают пипеткой 10 куб. см приготовленной вытяжки объекта и 4 куб. см 1 М раствора хлороводородной кислоты. Колбу ставят на электроплитку, жидкость доводят до кипения и кипятят 1 мин., охлаждают до комнатной температуры. Затем в колбу вносят 2 куб. см 2 М раствора гидроксида натрия (или калия) для нейтрализации кислоты и затем 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое колбы доводят до кипения и кипятят 1 мин. После охлаждения заполняют полученным раствором кювету и определяют оптическую плотность так же, как и при снятии градуировочного графика. Так как при значении оптической плотности в интервале 0,3 — 0,6 получаются более точные результаты, то при других значениях оптической плотности анализ повторяют, соответственно изменив объем вводимой водной вытяжки объекта исследования, добавив в воду так, чтобы общий объем оставался равным 10 куб. см.

Обработка результатов

Расчет содержания сахара

Содержание сахара (в %), выраженное в глюкозе, вычисляют по формуле:

где:

М — количество глюкозы, найденное по градуировочному графику ;

V — объем исследуемого раствора, приготовленного из навески, куб.

— объем раствора, взятый для реакции с гексацианоферратом калия, куб. см;

m — масса навески объекта исследования, мг.

Для определения содержания общего сахара, выраженного в сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений () и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных (r) определений не должны превышать:

но не более 0,5% абсолютного содержания сахара в БАД, где — среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:

но не более 1,0% абсолютного значения содержания сахара в продукте, где — среднее значение результатов измерений, проведенных в двух разных лабораториях.

4.2. Титрометрический метод

Метод основан на титровании избытка гексацианоферрата калия стандартным раствором глюкозы в присутствии метиленового голубого до полного обесцвечивания.

Подготовку к анализу проводят так же, как и в колориметрическом методе.

Проведение анализа

Определение восстанавливающих сахаров

В коническую колбу вместимостью 100 — 150 куб. см вносят 10 куб. см раствора пробы, 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин., кипятят ровно 3 мин. и вводят 2 капли метиленового голубого, дотитровывают без прекращения кипячения раствором глюкозы до исчезновения синей окраски. Содержание сахаров определяют по формуле, представленной выше.

Холостой опыт проводят в тех же условиях, отбирая вместо 10 куб. см раствора пробы 10 куб. см стандартного раствора глюкозы.

Количество стандартного раствора глюкозы , пошедшее на титрование 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия, суммируется как 10 куб. см глюкозы, взятых на анализ, и объем глюкозы, который пошел на дотитровывание.

Определение общего сахара

Проводят предварительный гидролиз сахарозы. Затем вносят 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и далее проводят кипячение и титрование как и для определения восстанавливающих сахаров.

Расчет общего сахара

Содержание общего сахара () в %, выраженное в глюкозе, вычисляют по формуле:

где:

— количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на титрование 25 куб. см щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия в холостом опыте, куб. см;

— количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на дотитровывание, куб. см;

1,6 — количество глюкозы в 1 куб. см раствора, мг;

— вместимость мерной колбы, используемой для приготовления водной вытяжки, куб. см;

М — масса навески объекта исследования, мг.

Для получения содержания общего сахара, выраженного в сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений () и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Метрологические характеристики фотометрического и титрометрического методов

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных (r) определений не должны превышать:

но не более 0,5% абсолютного содержания сахара в БАД, где — среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:

но не более 1,0% абсолютного содержания сахара в БАД, где среднее значение результатов измерений, проведенных в двух разных лабораториях.

5. Определение содержания нерастворимых и растворимых пищевых волокон (ферментативный метод)

Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам пищеварительного тракта человека из БАД на растительной основе. Метод позволяет определять растворимые (в этиловом спирте) и нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим действием.

Специфическая аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г второго класса точности по ГОСТ 24104-80.

Шкаф сушильный лабораторный.

Спектрофотометр СФ-26 или другой с аналогичными характеристиками.

Водяная баня любого типа, обеспечивающая температуру нагрева 37 +/- 0,2 °С, 40 +/- 0,2 °С, 60 +/- 0,2 °С, 100 °С, или термостат.

Прибор для определения pH среды с диапазоном измерений 0 — 14 с погрешностью измерения +/- 0,1 ед. pH.

Воронки стеклянные с пористым фильтром N 40, N 100 по ГОСТ 25336-82.

Спирт этиловый по ГОСТ 5962-67 или ГОСТ 18300-72 и раствор с массовой долей этилового спирта 700 г/куб. дм.

Панкреатин, фармзавод Лейрас, А/О Хухтамяки, медицинский препарат, активность которого гарантирована в пределах установленных сроков хранения.

Глюкоамилаза очищенная по ТУ 64-13-18-88.

Гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ по ТУ 6-09-10-656-77.

Протеаза N Р-3910, Sigma Chemical Co. (хранится только в холодильнике), или другой протеолитический ферментный препарат аналогичной активности, например пепсин А из слизистой оболочки желудка свиньи, активность которого устанавливают следующим образом. Сначала готовят 2%-ный раствор гемоглобина. Для этого 300 мг гемоглобина растворяют в 12,9 куб. см дистиллированной воды (до полного растворения), приливают 2,1 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 0,3 М.

Определение активности проводят следующим образом: 68,5 мг пепсина растворяют в 10 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 0,03 М; 0,2 куб. см полученного раствора пепсина приливают к 1 куб. см субстрата гемоглобина, предварительно нагретого на водяной бане в течение 5 мин. при температуре 37 °С. Инкубируют смесь при той же температуре в течение 10 мин. (по секундомеру). Реакцию останавливают путем приливания 5 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 100 г/куб. дм. Смесь выдерживают на водяной бане еще 5 мин. Фильтруют через плотный бумажный фильтр (фильтраты должны быть абсолютно прозрачными). Одновременно с опытными готовят контрольную пробу. Для этого к 1 куб. см субстрата гемоглобина приливают 0,2 куб. см раствора соляной кислоты концентрации 0,03 М и 5 куб. см 10% раствора трихлоруксусной кислоты, затем инкубируют смесь и фильтруют по предложенной выше схеме. Содержание пепсина определяют спектрофотометрически: оптическую плотность опытных и контрольных фильтратов измеряют против дистиллированной воды при длине волны 280 нм в кюветах 1 см на СФ-26 или другом с подобными характеристиками.

Построение калибровочного графика: готовят ряд растворителей рабочего стандарта пепсина с концентрацией фермента 50, 100, 150, 200, 250 мкг/куб. см. Для этого пользуются следующими данными, приведенными в табл. 9.

Таблица 9

КОЛИЧЕСТВО ФЕРМЕНТОВ

Во всех растворах, приготовленных по таблице, определяют содержание пепсина, как описано выше, и строят график, откладывая на оси ординат величины оптической плотности, а на оси абсцисс — концентрацию пепсина в мкг. По калибровочному графику определяют количество активного пепсина в исследуемом препарате. Результаты измерений выражают в протеиназных единицах (по гемоглобину), За протеиназную единицу принимают действие такого количества фермента, которое в данных условиях опыта и измерений за 1 мин. приводит к увеличению оптической плотности фильтрата на единицу. Например, по предложенному калибровочному графику 250 мкг пепсина увеличивают оптическую плотность фильтрата на 0,5 за 10 мин., следовательно, 5000 мкг пепсина приводит к увеличению оптической плотности на единицу за 1 мин. ().

Подготовка к испытанию

Приготовление фосфатного буферного раствора панкреатина

Готовят 0,05 М фосфатный буфер, pH 6,0 (0,875 г дигидрофосфата и 6,05 г натрия гидрофосфата растворяют в примерно 700 куб. см дистиллированной воды в колбе на 1 куб. дм, затем доводят до метки дистиллированной водой).

Готовят раствор панкреатина с концентрацией панкреатина в 0,05 М фосфатном буфере 5 мг/куб. см.

Приготовление 0,5%-ного водного раствора глюкоамилазы

Растворяют 500 мг глюкоамилазы в 100 куб. см дистиллированной воды.

Подготовка образцов к испытанию

Исследуемый сухой материал измельчают на лабораторной мельнице, просеивают через сито, собирая фракцию с размером частиц не более 1 мм; влажный материал гомогенизируют в гомогенизаторе или микроизмельчителе тканей.

При содержании жира в образцах более 5% проводят обезжиривание. Для этого навеску образца, предназначенную для определения пищевых волокон, заливают трехкратным объемом петролейного эфира (к массе образца), перемешивают в течение 15 мин. периодически и затем отстаивают не менее 1 мин. Прозрачный раствор петролейного эфира декантируют и повторяют экстракцию с тем же количеством эфира 2 раза. Обезжиренный образец высушивают на воздухе.

Ориентировочное содержание крахмала в образце устанавливают по справочным таблицам или другим любым приемлемым методом.

Проведение испытания

0,5 г тонкоизмельченного образца, взвешенного с точностью до 0,0001 г, помещают в химический стакан и суспендируют в 30 куб. см дистиллированной воды при 40 °С в течение 1,5 ч.

Полученную суспензию после настаивания нагревают на кипящей водяной бане для клейстеризации крахмала 30 мин. при условии, что температура суспензии достигает 90 °

После охлаждения смеси до комнатной температуры устанавливают pH 1,5 +/- 0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5 М, добавляют 100 мг пепсина (активность 1 мкг эквивалентна ) и ставят на инкубацию при температуре 40 °С в течение 1 — 1,5 ч при периодическом помешивании. При недостаточной активности пепсина необходимо скорректировать его количество по вышеописанной методике при проведении ферментолиза.

Смесь охлаждают до комнатной температуры, затем устанавливают pH 6,8 +/- 0,1 раствором гидроксида натрия концентрацией 3 М и приливают 10 куб. см 0,05 молярного буферного раствора панкреатина. Смесь инкубируют в течение 1 — 1,5 ч при помешивании при температуре 40 °С. Охлаждают полученную смесь до комнатной температуры, приливают 1,0 куб. см водного раствора глюкоамилазы концентрацией 50 мг/куб. см (рекомендуется использовать 100 единиц активности глюкоамилазы на расщепление 1 г крахмала), устанавливают pH 4,8 +/- 0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5 М и инкубируют при температуре 40 °С в течение 12 ч.

Полноту гидролиза крахмала определяют йодной пробой. Для этого несколько капель смеси помещают на стекло, добавляют каплю йода в водном растворе йодида калия. О присутствии крахмала в препарате пищевых волокон судят по наличию окрашенных в синий цвет крахмальных зерен. В случае положительной реакции на крахмал проводят обработку смеси дополнительным количеством глюкоамилазы (приливают к смеси 5 куб. см водного раствора глюкоамилазы концентрацией 5 мг/куб. см и инкубируют 1 ч при аналогичных условиях: pH 4,8 +/- 0,1, температура 60 °С).

Полученную смесь фильтруют через предварительно доведенный до постоянной массы фильтр N 100 или предварительно высушенный и взвешенный обеззоленный фильтр. Нерастворимые пищевые волокна, оставшиеся на фильтре, промывают последовательно 25 куб. см 70%-ного раствора этилового спирта (в 2 приема) и 25 куб. см ацетона (в 2 приема). Фильтрат должен быть прозрачным.

Фильтр помещают в сушильный шкаф при температуре 105 +/- 1 °С и высушивают до постоянной массы. Фильтрат делят на 2 равные части. В одной части фильтрата осаждают растворимые пищевые волокна 4-кратным количеством 96%-ного этилового спирта, взятого к объему фильтрата. Смесь оставляют для осаждения на 10 — 12 ч, затем фильтруют через доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр N 40 (при необходимости используют слабый вакуум) до получения прозрачного фильтрата. Остаток на фильтре промывают последовательно 25 куб. см 70%-ного раствора этилового спирта и 25 куб. см ацетона, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 105 +/- 1 °С до постоянной массы.

В полученных препаратах нерастворимых пищевых волокон определяют содержание непереваренного белка по методу Кьельдаля и золы по ГОСТу 10847-74. Для корректировки данных по содержанию пищевых волокон от возможного осаждения остатка ферментов на растворимые и нерастворимые пищевые волокна параллельно проводят холостой опыт по вышеизложенной схеме, но без навески образца. Холостой опыт важно проводить при использовании новых партий ферментов.

Обработка результатов

Содержание пищевых волокон в БАД определяют по следующим формулам.

Для нерастворимых пищевых волокон:

Для растворимых пищевых волокон:

где:

— содержание нерастворимых пищевых волокон, %;

— содержание растворимых пищевых волокон, %;

М — навеска образ , г;

— масса остатка нерастворимых или растворимых пищевых волокон после высушивания соответственно, г;

— масса остатка в холостом опыте после высушивания, г;

В — содержание белка в препарате пищевых волокон, г;

С — содержание золы в препарате пищевых волокон г.

Общее одержание пищевых волокон (X) вычисляют суммированием величин и .

За окончательный результат определения массовой доли нерастворимых или растворимых пищевых волокон принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Вычисление проводят до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 10.

Таблица 10

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Глава 2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТОВ

I. Методы определения витаминов

1. Одновременное определение витаминов А, Е и каротиноидов в БАД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Метод определения витаминов А, Е и каротиноидов, включая бета-каротин, альфа-каротин, ликопин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, при совместном присутствии в биологически активных добавках (витаминное драже, таблетки, порошки и кристаллические витаминные препараты, их растворы или суспензии в жирах) основан на экстракции микронутриентов органическим растворителем после щелочного омыления субстрата (1) или непосредственного растворения, упаривании полученного экстракта и переводе сухого остатка в другой растворитель, введении экстракта на ВЭЖХ колонку для хроматографического разделения и последующего определения с помощью флуоресцентного и спектрофотометрического детекторов (2). Определение массовой концентрации витаминов и каротиноидов основано на измерении площади (или высоты) пика при соответствующей каждому соединению длине волны детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и каротиноидов в биологически активных добавках с вероятностью Р = 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне измерений.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Спектрофотометр, например, «СФ-46» с диапазоном измерения от 190 нм до 700 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1% по ТУ 3-3.1841-84; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ (типа «Джаско 870-UV», Япония) с проточной кюветой объемом 8 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более 2% с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра (от 190 до 600 нм).

Спектрофлуориметрический детектор для ВЭЖХ (типа «Джаско» 821-FP) с проточной кварцевой кюветой объемом 16 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения интенсивности флуоресценции не более 2%, с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра возбуждения и эмиссии (от 220 до 650 нм).

Насос для ВЭЖХ (типа «Джаско» 880-PU), позволяющий осуществлять расход элюента 0,5 — 1,0 куб. см/мин. с возможностью работы при давлении не менее 300 кг/кв. см, погрешностью поддержания скорости подачи растворителя 0,6 куб. см/мин. не более 2,5%.

Микрошприц (типа «Гамильтон», США) вместимостью 100 куб. мм для ввода проб в жидкостный хроматограф.

Регистрирующее устройство: интегратор (типа «Шимадзу C-R6A», Япония) или самописец, позволяющий проводить измерение с погрешностью не более 0,5%.

Дозатор автоматический типа ПЛ-01-200.

Колбы мерные 2-100-2, 2-50-2 по ГОСТ 1770-74Е.

Цилиндры вместимостью 100 куб. см по ГОСТ 1770-74Е.

Пробирки П-4-10-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427-75.

Вспомогательные устройства и материалы

Встряхиватель типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

Центрифуга ОПн-8-У4.2 по ТУ 5.375-4261-76.

Баллон с газообразным азотом квалификации ос.ч. по ГОСТ 9293-74.

Реактивы

Метанол (СН3ОН) для жидкостной хроматографии ос.ч. по ТУ 6-09-2192-85.

Ацетонитрил (CH3CN) для жидкостной хроматографии ос.ч. по ТУ 6-09-14-2167-84.

Метилен хлористый (CH2Cl2), ос.ч. по ТУ 6-09-14-2149-83.

Гексан (C6H6), х.ч. для хроматографии по ТУ 6-00-4521.

Спирт этиловый (C2H5OH) ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.

Полностью транс-ретинол (C20H30O) кристаллический, номер по каталогу 124769 фирмы «Мерк» (Германия).

Ретинола ацетат (C22H32O2) по Госфармакопея, X изд., ст. 578.

Ретинола пальмитат (C26H60O2) по ФС 42-2229-84.

DL-альфа-токоферол (C29H50O2), номер по каталогу Т3251 фирмы «Сигма».

альфа-токоферола ацетат (C31H52O2) по ФС 42-2495-87.

Каротиноиды: лютеин (С40Н56O2), ликопин (C40H56), альфа-каротин (C40H56), бета-каротин (C40H56), соответствующие номера Х6250, L9879, С0251, С9750 по каталогу фирмы «Сигма» (США), зексантин (С40Н56О2), бета-криптоксантин (С40Н56О) фирмы «Рош» (Швейцария).

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч.д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения, вспомогательного оборудования и реактивов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

Условия выполнения измерений

Для предотвращения разрушения витаминов и каротиноидов анализ БАД и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта — аскорбиновой кислоты, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление растворов

1. Приготовление раствора гидроокиси калия с массовой долей 50%

50 г гидроокиси калия растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды.

2. Подвижная фаза для хроматографии

В мерную колбу на 500 куб. см помещают 250 куб. см ацетонитрила, 25 куб. см дихлорметана и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения в темноте при 2 — 8 °С — 1 год.

Количественное определение витаминов А, Е и бета-каротина

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, для чего проводят определение градуировочного коэффициента.

Для определения градуировочного коэффициента готовят несколько (не менее 4) калибровочных растворов витамина А (полностью транс-ретинол кристаллический; ретинола ацетат по Госфармакопея, X изд., ст. 578; ретинола пальмитат по ФС 42-2229-84) с концентрацией от 0,3 до 3 мкг/куб. см, витамина Е с концентрацией от 2 до 20 мкг/куб. см (DL-альфа-токоферол; альфа-токоферола ацетат по ФС 42-2495-87), бета-каротина с концентрацией от 0,2 до 1,5 мкг/куб. см.

Приготовление градуировочных растворов витамина А

Для приготовления градуировочных растворов из ретинола 0,01 г витамина А количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см этанола. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов ретинола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора витамина А в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб. см) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления калибровочных растворов из ацетата ретинола (пальмитата ретинола) 0,01 г витамина А помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, прибавляют 30 куб. см этанола, 3 куб. см 50% раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63 — 68 °С. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 куб. см воды в делительную воронку и извлекают 150 куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 куб. см и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 1, 2, 3, 4, 5 куб. см раствора в мерные колбы вместимостью 100 куб. см, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в этаноле и доводят объемы до метки тем же растворителем.

Приготовление градуировочных растворов витамина Е

Для приготовления градуировочных растворов из альфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 2 куб. см дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения токоферола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора витамина Е в этаноле (1, 3, 5, 7, 10 куб. см) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления градуировочных растворов из ацетата альфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 0,2 г аскорбиновой кислоты, 30 куб. см этанола, 3 куб. см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63 — 68 °С. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 куб. см воды в делительную воронку и извлекают 150 куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 куб. см и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 2, 4, 6, 8, 10 куб. см раствора в мерные колбы вместимостью 100 куб. см, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в 1 куб. см дихлорметана и доводят объемы до метки этанолом.

Приготовление градуировочных растворов каротиноидов

Для приготовления градуировочных растворов бета-каротина 5 мг кристаллического бета-каротина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 1 мл дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов, после чего объем в колбе доводят до метки этанолом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 куб. см аликвоты раствора бета-каротина в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб. см) добавляют растворитель до метки.

Градуировочные растворы других каротиноидов (альфа-каротина, ликопина, бета-криптоксантина, лютеина, зеаксантина) готовят аналогично раствору бета-каротина.

Полученные растворы хранят в холодильнике при 2 — 8 °С не более 6 месяцев.

Массовую концентрацию витаминов и каротиноидов в градуировочных растворах (С, мкг/куб. см) уточняют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность (D) слоя градуировочного раствора толщиной 1 см по отношению к растворителю при длине волны, указанной в таблице, и рассчитывают по формуле:

где:

— коэффициент светопоглощения, куб. см x x ;

1 — толщина слоя раствора, см;

— коэффициент пересчета.

Таблица 11

УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ

Градуировка прибора

Градуировка хроматографической системы проводится с целью убедиться, что область определяемых концентраций лежит в пределах линейного участка градуировочного графика, построенного по площадям (высотам) пиков. Она проводится в следующих случаях:

— на этапе освоения методики;

— при смене колонки и/или предколонки;

— при замене стандартного образца;

— в других случаях, когда есть основания полагать, что изменилась эффективность хроматографической системы или чувствительность детектора.

Градуировку хроматографа проводят строя градуировочный график по серии градуировочных растворов. Аналитический сигнал (площадь, кв. мм, или высота пика, мм) фиксируют на интеграторе или самописце, соблюдая условия и продолжительность хроматографического разделения и детектирования (табл. 12).

Таблица 12

УСЛОВИЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ВИТАМИНОВ А, Е И КАРОТИНОИДОВ

Ориентировочные времена удерживания и последовательность выхода витаминов из хроматографической колонки: ретинол — 4,0 — 4,5 мин., альфа-токоферол — 10,5 — 11,0 мин. (флуориметрическое детектирование), бета-каротин > альфа-каротин > ликопин > бета-криптоксантин > лютеин > зеаксантин (спектрофотометрическое детектирование).

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» — «концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/куб. см». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времен удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций микронутриентов. Коэффициент градуировочного графика () определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов , вычисляемых по формуле:

где:

— массовая концентрация микронутриентов в градуировочном растворе, мкг/куб. см;

— площадь (высота) аналитического сигнала.

Описание хроматографической системы

Подготовку к работе хроматографической системы, состоящей из последовательно соединенных насоса высокого давления, спектрофотометрического и флуориметрического детекторов и интеграторов, проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:

— аналитическая хроматографическая колонка (типа картридж «Элсикарт» фирмы «Элсико», Россия) из нержавеющей стали длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращеннофазным сорбентом, например Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим, аналогичным по свойствам, с эффективностью по бета-каротину не ниже 5000 теоретических тарелок;

— предколонка из нержавеющей стали длиной 50 мм, внутренним диаметром 4 мм, с сорбентом типа «Нуклеосил» 100 С18, 7 мкм или аналогичным по свойствам;

— петлевой кран-дозатор (инжектор ввода пробы типа «Реодайн 7125», США) с рабочим объемом петли 50 куб. мм;

— объемная скорость подачи подвижной фазы — 0,6 куб. см/мин.

Подготовка пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Взвешивают не менее 10 таблеток (драже, порошкообразное содержимое капсул) и определяют вес одной штуки, затем материал тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,05 — 0,20 г), помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 15 куб. см воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60 °С до 70 °С при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 30 куб. см этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 3 куб. см 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин. на водяной бане с обратным холодильником при температуре кипения смеси. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в делительную воронку и экстрагируют неомыляемые вещества 150 куб. см гексана (3 раза по 50 куб. см) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 куб. см до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу объемом (200 куб. см) и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Аликвоту (2 куб. см) полученного раствора переносят в мерную пробирку на 10 куб. см, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в точно измеренном объеме (1 куб. см) подвижной фазы.

Измерение концентрации витаминов и каротиноидов в экстракте пробы

Полученный раствор анализируют дважды с помощью хроматографической системы.

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральные отношения с временами удерживания и спектральными отношениями растворов соответствующих стандартов (табл. 13).

Таблица 13

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ВИТАМИНОВ И КАРОТИНОИДОВ

Концентрацию витаминов и бета-каротина в растворе пробы ( ,мкг/куб. см) определяют по формуле:

где:

— площадь (высота) пика витамина или каротиноида в растворе пробы;

— коэффициент градуировочного графика.

За окончательный результат определения концентрации микронутриентов в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Представление результатов

Содержание микронутриентов (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки, рассчитывают по формуле:

где — концентрация витамина или каротиноида в анализируемом растворе (мкг/куб. см); коэффициент 0,001 учитывает пересчет содержания витаминов и бета-каротина в мг.

Минимально детектируемое количество ретинола и альфа-токоферола — 0,1 мкг/мл, каротиноидов — 0,05 мкг/мл.

Погрешность измерения вычисляется по формуле:

где дельта — характеристика погрешности измерений (п. 2), %.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации витаминов А, Е и бета-каротина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок.

Производят измерение концентрации витаминов и бета-каротина в

экстракте пробы в соответствии с п. 5.7 (, мкг/куб. см), а затем с введенной в него добавкой (, мкг/куб. см), который также анализируют (С’, мкг/куб. см). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация микронутриентов в экстракте увеличилась на 50 — 150%. Для добавки используют градуировочные растворы микронутриентов.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

где:

— норматив оперативного контроля погрешности, составляющий 15%;

— расчетное значение величины добавки, мкг/куб. см.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

2. Определение витамина В-6 (пиридоксина) в БАД

Сущность метода

В биологически активных добавках витамин В-6 содержится в основном в виде пиридоксина гидрохлорида, действующим началом которого выступает пиридоксин (витамин В-6). Пиридоксин определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со спектрофлуориметрическим детектированием. Массовую концентрацию пиридоксина определяют по площади (высоте) пика при соответствующих пиридоксину длинах волн флуориметрического детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне измерений.

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ с спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220 — 650 нм) и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по пиридоксину не ниже 8000 теоретических тарелок. (США) Р7949.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения пиридоксина под действием света подготовку проб и приготовление стандартных растворов пиридоксина проводят в посуде темного стекла либо обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1 М.

К дистиллированной воде добавляют 4 куб. см концентрированной соляной кислоты (ро = 1,19 г/куб. см), объем доводят до 500 куб. см.

Раствор фосфорной кислоты с массовой долей 30%.

41,3 г 85%-ной фосфорной кислоты (ро = 1,698 г/куб. см) растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 100 куб. см.

Приготовление 0,03 М калий фосфатного буфера, pH 3,0.

4,08 г дигидроортофосфата калия растворяют в 500 куб. см дистиллированной воды, доводят pH потенциометрически с помощью раствора фосфорной кислоты с массовой долей 30% до значения 3,0 и объем доводят до 1000 куб. см.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе.

40 г винной кислоты растворяют в 800 куб. см дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 куб. см.

Подвижная фаза для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см добавляют 100 — 150 куб. см 0,03 М калий фосфатного буфера, 20 куб. см ацетонитрила, 326 мг гептилсульфоната натрия и доводят объем до метки фосфатным буфером. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение пиридоксина (витамина В-6)

Количественное определение пиридоксина проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) с концентрациями пиридоксина в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/куб. см.

Приготовление градуировочных растворов пиридоксина

Приготовление стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида с концентрацией пиридоксина 500 мкг/куб. см

Точную навеску 61 мг пиридоксина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равному 7000 М х см в 0,1 М растворе едкого натра при длине волны 308 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.

Градуировочные растворы пиридоксина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 куб. см аликвоты 1 куб. см приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 куб. см и получают раствор с концентрацией 5 мкг/куб. см. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают аликвоты раствора пиридоксина с концентрацией 5 мкг/куб. см (0,2; 0,6; 1,0; 4,0 куб. см) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1. Аналитический сигнал (площадь в кв. мм или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 290 нм, эмиссии 395 нм. Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0 — 15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» — «концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/куб. см». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций пиридоксина. Коэффициент градуировочного графика () определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов, вычисляемых по формуле:

где:

— массовая концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/куб. см;

— площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2 — 1,5 г), помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см 0,1 М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3 — 5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 мин., периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3 — 5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помещают на УЗ-баню на 5 мин., доводят экстрагирующей смесью объем до 50 куб. см и фильтруют через бумажный фильтр.

При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентрации пиридоксина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрацией пиридоксина в растворах для построения градуировочного графика (0,03 — 0,05 мкг/куб. см).

Полученные из экстрактов растворы анализируют дважды с помощью хроматографической системы, вводя на колонку с помощью крана-дозатора (петля 0,1 куб. см).

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральное отношение с временами удерживания и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 14).

Таблица 14

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ПИРИДОКСИНА

Концентрацию пиридоксина в растворе пробы (, мкг/куб. см) определяют по формуле:

где:

— площадь (высота) пика пиридоксина в растворе пробы;

— коэффициент градуировочного графика.

За окончательный результат определения концентрации пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Обработка результатов

Содержание пиридоксина в 1 таблетке (драже) (мг):

где:

— площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

— коэффициент градуировочного графика;

V — первоначальный объем гидролизата, куб. см;

— конечное разведение гидролизата;

m — навеска таблеток, взятая на анализ;

M — масса таблетки;

1000 — коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание пиридоксина в 1 капсуле (мг):

где:

— площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

— коэффициент градуировочного графика;

V — первоначальный объем гидролизата, куб. см;

— конечное разведение гидролизата;

n — количество капсул, взятых на анализ;

1000 — коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в гидролизат.

Производят измерение концентрации пиридоксина в гидролизате

пробы (, мкг/куб. см), а затем с введенной в него добавкой (, мкг/куб. см), который также анализируют (С’, мкг/куб. см).

Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация пиридоксина в гидролизате увеличилась на 50 — 150%. Для добавки используют калибровочные растворы пиридоксина.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

где:

— норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20%);

— расчетное значение величины добавки, мкг/куб. см.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Таблица 15

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА

3. Одновременное определение витаминов В-1 и В-2 в БАД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Витамин В-1 (тиамин) под действием красной кровяной соли превращается в тиохром, который флуоресцирует в щелочной среде. В данном варианте методики происходит постколоночная дериватизация, то есть после отделения тиамина от пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме окисляющий агент смешивается с выходящим из колонки элюатом и образующийся тиохром детектируется флуориметрическим методом [1] при соответствующих длинах волн. Массовую концентрацию рибофлавина определяют по площади (высоте) пика при соответствующих ему длинах волн, так как это соединение способно флуоресцировать в нативном состоянии в растворе.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +/- 15% во всем диапазоне измерений.

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220 — 650 нм), двухходовым смесителем, в котором происходит реакция образования тиохрома из витамина В-1, и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по тиамину и рибофлавину не ниже 8000 теоретических тарелок.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения рибофлавина и тиамина под действием света подготовку проб и приготовление их стандартных растворов, а также растворов гексацианоферрата (III) калия проводят в посуде темного стекла либо обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1 М

К дистиллированной воде добавляют 4 куб. см концентрированной соляной кислоты (ро = 1,19 г/куб. см), объем доводят до 500 куб. см.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе

40 г винной кислоты растворяют в 800 куб. см дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 куб. см.

3,75 М раствор гидроксида натрия: к 75 г гидроксида натрия добавить 500 куб. см дистиллированной воды.

0,04 М раствор гексацианоферрата (III) калия: 1,0 г гексацианоферрата (III) калия растворить в воде в мерной колбе вместимостью 100 куб. см и довести дистиллированной водой до метки.

1,6 x М щелочной раствор гексацианоферрата (III) калия.

2,0 куб. см раствора с содержанием гексацианоферрата (III) калия 10 г/1000 мл смешать в мерной колбе вместимостью 50 куб. см с 3,75 М раствором гидроксида натрия и довести до метки этим же раствором.

Подвижная фаза для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см добавляют примерно 50 куб. см дистиллированной воды, 60 куб. см метанола, 100 мг гептилсульфоната натрия, 10 куб. см ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение витаминов В-1 и В-2

Количественное определение витаминов проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) тиамина с концентрациями в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/куб. см, рибофлавина с концентрациями от 0,02 до 0,100 мкг/мл.

Приготовление градуировочных растворов тиамина

Приготовление стандартного раствора тиамина гидрохлорида с концентрацией тиамина 1000 мкг/куб. см.

Точную навеску 62,5 мг тиамина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равному 14200 х х в 0,1 М растворе едкого натра при длине волны 247 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы тиамина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 куб. см аликвоты 1 куб. см приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 куб. см и получают раствор с концентрацией 10 мкг/куб. см. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/куб. см (0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 куб. см) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Приготовление градуировочных растворов рибофлавина

Приготовление стандартного раствора рибофлавина с концентрацией рибофлавина 100 мкг/куб. см.

Точную навеску 10,0 мг рибофлавина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют примерно 70 куб. см воды и нагревают в течение 20 мин. до полного растворения, после охлаждения доводят объем водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равному 12500 x в 0,1 М фосфатном буфере (pH = 7,0) при длине волны 255 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы рибофлавина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 куб. см аликвоты 1 куб. см приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 50 куб. см и получают раствор с концентрацией 2 мкг/куб. см. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают аликвоты раствора рибофлавина с концентрацией 10 мкг/куб. см (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 куб. см) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1 — 5.2. Аналитический сигнал (площадь в кв. мм или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 375 нм, эмиссии 435 нм для тиамина и при длине волны возбуждения 450 нм, эмиссии 521 нм для рибофлавина. Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0 — 15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» — «концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/куб. см». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витаминов. Коэффициент градуировочного графика () определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов , вычисляемых по формуле:

где:

— массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/куб. см;

— площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом. Подготовка проб аналогична таковой при определении пиридоксина, поэтому можно использовать один и тот же гидролизат.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2 — 1,5 г), помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см 0,1 М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин. При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3 — 5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 минут, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3 — 5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помещают на УЗ-баню на 5 мин., доводят экстрагирующей смесью объем до 50 куб. см и фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентраций тиамина и рибофлавина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрациями витаминов в растворах для построения градуировочного графика.

Аликвоту фильтрата 0,1 куб. см вводили в аналитическую хроматографическую колонку. Витамин В-1 определяли после окисления его в тиохром путем послеколоночной дериватизации 0,06%-ным раствором калия гексацианоферрата (III) в 3 N гидроокиси калия со скоростью подачи реагента 0,1 куб. см в течение 5 мин. после ввода пробы. Длина волны возбуждения для тиохрома составляла 375 нм, длина волны флуоресценции — 435 нм. Время удерживания витамина В-1 — 4,0 — 4,5 мин. После 6-й минуты длины волн автоматически переключались для определения витамина В-2. Длина волны возбуждения для рибофлавина (витамина В-2) составляла 450 нм, длина волны флуоресценции — 521 нм. Время удерживания витамина В-2 составляло 10,0 — 10,3 мин. Идентификацию пиков проводили сопоставляя времена удерживания с временами удерживания растворов соответствующих стандартов.

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральное отношение с временами удерживания и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 16).

Таблица 16

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ ТИАМИНА И РИБОФЛАВИНА

Концентрацию витаминов в растворе пробы (, мкг/куб. см) определяют по формуле:

где:

— площадь (высота) пика витаминов в растворе пробы;

— коэффициент градуировочного графика.

За окончательный результат определения концентрации пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Обработка результатов

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 таблетке (драже) (мг):

где:

— площадь (высота) пика витамина в пробе;

— коэффициент градуировочного графика;

V — первоначальный объем гидролизата, куб. см;

— конечное разведение гидролизата;

m — навеска таблеток, взятая на анализ;

М — масса таблетки;

1000 — коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 капсуле (мг):

где:

— площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

— коэффициент градуировочного графика;

V — первоначальный объем гидролизата, куб. см;

— конечное разведение гидролизата;

n — количество капсул, взятых на анализ;

1000 — коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в гидролизат.

Производят измерение концентрации тиамина или рибофлавина в гидролизате пробы (, мкг/куб. см), а затем с введенной в него добавкой (, мкг/куб. см), который также анализируют (С’, мкг/куб. см). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация данного витамина в гидролизате увеличилась на 50 — 150%. Для добавки используют калибровочные растворы.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

где:

— норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20%);

— расчетное значение величины добавки, мкг/куб. см.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Таблица 17

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА

4. Флуориметрический метод определения рибофлавина (витамин В-2) титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком

Принцип метода основан на способности рибофлавинсвязывающего апобелка при связывании с рибофлавином полностью тушить его флуоресценцию.

Реактивы и их приготовление

0,1 н. соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 куб. см концентрированной (ро = 1,19 г/куб. см) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 куб. см.

Стандартный раствор рибофлавина (С17Н20N4О6) концентрацией 100 мкг/куб. см.

5 мг рибофлавина растворяют при нагревании на водяной бане при 70 °С в 45 куб. см 0,1 н соляной кислоты (раствор 1). После охлаждения объем доводят до 50 куб. см. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции (Прилож. 3). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 мес.

Рабочий стандартный раствор (концентрация рибофлавина 2 мкг/куб. см).

Перед определением к 1 куб. см стандартного раствора добавляют дистиллированную воду в мерной колбе до объема 50 куб. см.

4 М фосфат калия однозамещенный (K2HPO4).

54,4 г К2НРO4 растворяют в дистиллированной воде, объем доводят до 100 куб. см.

Рибофлавинсвязывающий апобелок (РбСБ) со связывающей способностью 5 — 15 мкг рибофлавина на 1 мг белка.

Можно использовать коммерческий препарат (Sigma, США, R 8628) или выделить его из белка куриного яйца по методу, изложенному в Прилож. 3.

Средства измерений

Спектрофлуориметр F-2000 (Hitachi, Япония) или аналогичный по оптическим характеристикам.

Условия измерения

Интенсивность флуоресценции измеряют в кварцевой кювете объемом 3 куб. см с длиной оптического пути 1 см при длине волны возбуждающего света = 465 нм, испускаемого = 525 нм.

Приготовление кислотного гидролизата

3 таблетки (драже) или содержимое 3 капсул растирают и тщательно перемешивают в ступке. При расчете массы навески исходят из того, чтобы в 1 куб. см гидролизата содержалось не более 5 мкг рибофлавина. К навеске (100 — 500 мг в зависимости от содержания витамина) добавляют 100 куб. см 0,1 н. НСl и помещают на кипящую водяную баню на 40 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до 100 куб. см и при необходимости фильтруют.

В случае необходимости разводят гидролизат до концентрации рибофлавина около 0,5 мкг/куб. см или уменьшают количество гидролизата, взятого на анализ, с таким расчетом, чтобы интенсивность флуоресценции опытной пробы (о — к) была сопоставима с интенсивностью флуоресценции добавленного в пробу стандарта (с — о).

Ход определения

К 0,1 куб. см кислотного гидролизата добавляют равный объем 4 М К2НРO4 и дистиллированную воду до 3 куб. см, измеряют флуоресценцию (о), добавляют 0,03 куб. см стандартного раствора рибофлавина концентрацией 2 мкг/куб. см. После перемешивания повторяют измерение (с). Затем добавляют по 0,03 куб. см раствора РбСБ, перемешивают, измеряют флуоресценцию после каждой добавки белка. Добавление белка продолжают до тех пор, пока флуоресценция после двух добавок перестает снижаться (к). Разница интенсивности флуоресценции (о — к) пропорциональна количеству рибофлавина в гидролизате. Необходимое количество РбСБ подбирают эмпирически.

Обработка результатов

Содержание рибофлавина в 1 таблетке (мг):

где:

0,06 — количество рибофлавина, внесенное в кювету, мкг;

V — исходный объем гидролизата, куб. см;

М — масса таблетки БАД, г;

— объем гидролизата, внесенного в пробу, куб. см;

m — навеска измельченных таблеток, взятая на анализ, г;

1000 — перевод мкг в мг.

Таблица 18

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА

5. Метод определения аскорбиновой кислоты (витамин С)

Определение витамина С в биологически активных добавках к пище основано на определении непосредственно аскорбиновой кислоты (АК) без учета окисленной формы витамина С — дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК).

Для целей рутинного анализа наиболее легко и доступно определение методом визуального титрования с использованием количественного окисления АК раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако этот метод применим только для объектов исследования, дающих светлоокрашенные экстракты. В других случаях используют метод потенциометрического титрования, спектрофотометрические и флуорометрический методы анализа, которые применимы для любых объектов исследования.

Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрофотометр с диапазоном измерения от 220 до 1100 нм или фотоэлектроколориметр с диапазоном измерения от 364 до 2980 нм с диапазоном измерения коэффициента пропускания от 100 до 1%.

Флуориметр типа «Квант» с набором светофильтров или спектрофлюориметр.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Секундомер 2-го класса или часы 2-го класса.

рН-метр-милливольтметр лабораторный для измерения pH и окислительно-восстановительных потенциалов с диапазонами от минус 1 до плюс 14 мВ и погрешностью не более +/- 0,05 при измерении pH и диапазонами от минус 100 до плюс 1400 мВ и погрешностью не более +/- 5 мВ при измерении окислительно-восстановительных потенциалов. При измерении окислительно-восстановительных потенциалов используют электроды: измерительный — платиновый, вспомогательный — хлорсеребряный.

Термостат с поддержанием заданного режима от 0 до 60 °С с погрешностью +/- 0,8 °С.

Термометр жидкостный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С с ценой деления шкалы 1 °С.

Мешалка магнитная с плавным регулированием частоты вращения.

Воронки стеклянные лабораторные типа В по ГОСТ 25336.

Колбы мерные лабораторные стеклянные номинальной вместимостью 50, 100, 500, 1000 куб. см по ГОСТ 1770.

Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 50, 100, 250, 750 куб. см по ГОСТ 25336.

Микробюретка по ГОСТ 20292 с ценой деления не более 0,01 куб. см.

Палочки стеклянные.

Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 20292 номинальной вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см ценой деления шкалы 0,1 куб. см.

Стаканы типа В исполнения 1 номинальной вместимостью 50, 100, 400, 1000 куб. см по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250 куб. см по ГОСТ 1770.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Бумага масштабно-координатная (миллиметровая) по ГОСТ 334.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Кислота азотная по ГОСТ 4461 плотностью 1,41 г/куб. см, раствор с объемной долей 25%.

Кислота аскорбиновая по ГФ XI изд., растворы массовых концентраций 1,0 и 0,1 г/куб. дм.

Кислота борная, ч.

Кислота серная ос.ч. или ч.д.а. (предпочтительней по Савалю).

Кислота соляная плотностью 1,19 г/куб. см, х.ч., раствор с массовой долей 2%.

Кислота трихлоруксусная, х.ч., раствор с массовой долей 3%.

Кислота фосфорная (мета), ч. по ГОСТ 841, растворы с массовой долей 3 и 6%.

Кислота уксусная ледяная, ч.д.а. или х.ч. по ГОСТ 61, раствор с массовой долей 3%.

Кислота хлорная, раствор молярной концентрации 0,1 моль/куб. дм. Готовят перед обработкой электродов.

Кислота щавелевая, раствор с массовой долей 2%.

Ксилол.

Натрий 2,6-дихлорфенолиндофенолят. х.ч., Serva.

Натрий уксуснокислый, 3-водный, ч.д.а. по ГОСТ 199.

О-Фенилендиамин, раствор 0,2 г/куб. дм.

Формальдегид, 36 — 40%-ный раствор.

Уголь активированный.

L-цистеин солянокислый или L-цистеин, 50 мг в 1 куб. см 2%-ного раствора соляной кислоты.

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или трилон Б (динатриевая соль этилендиамина-N,N’,N’-тетрауксусной кислоты, 2-водная, ч.д.а.).

Эфир уксусной кислоты бутиловый (бутилацетат), х.ч.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов по ГОСТ 4212.

Методы отбора проб

Подготовка средней пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Выделение витамина необходимо осуществлять возможно быстрее, без использования повышенной температуры, не на ярком свету и при минимальном контакте образца с кислородом воздуха.

Дражированная форма

Из средней пробы драже отбирают 10 — 15 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Таблетированная форма

Из средней пробы таблеток отбирают 3 — 7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Капсулированная форма

Из средней пробы капсул с порошкообразным содержимым отбирают 3 — 7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки за вычетом массы оболочки, затем содержимое капсул тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Из средней пробы «жировых» капсул отбирают 3 — 7 шт., взвешивают их, затем осторожно вскрывают, содержимое капсул тщательно перемешивают. Оболочки капсул отмывают органическим растворителем (ацетоном, гексаном и др.), высушивают и взвешивают. Затем высчитывают массу содержимого одной капсулы.

Кристаллические витаминные препараты (субстанции и премиксы)

Пробу витаминных препаратов отбирают в количестве 5 — 10 г и тщательно перемешивают.

Порошкообразная форма

Среднюю пробу порошкообразных веществ (сухие напитки, сухие молочные смеси и каши для детского питания и т.д.) отбирают в количестве 25 — 50 г. Перед взятием пробы порошок тщательно перемешивают.

Примечание. При исследовании равномерности перемешивания сыпучих продуктов, расфасованных в порционные упаковки, целесообразно при проведении анализа использовать порционную упаковку исследуемого образца целиком.

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты в количестве 50 — 100 куб. см осторожно, избегая аэрации, перемешивают путем многократного переворачивания склянки, содержащей пробу.

Витаминизированные кондитерские изделия (конфеты, вафли, батончики, бисквиты и др.)

Пробу штучных изделий берут в количестве не менее 100 — 200 г (в зависимости от содержания витамина), взвешивают, определяют вес единицы изделия, а затем подвергают размельчению и растиранию в ступке.

Подготовка аналитической пробы

Из измельченной и перемешанной пробы берут навеску не менее 0,5 — 1 г, взвешенную с погрешностью +/- 0,0001 г. При расчете массы необходимой навески можно пользоваться следующей формулой:

где:

m — навеска исследуемого образца, г;

— общий объем экстракта, мл;

— объем экстракта, взятого на титрование, мл;

— заявленное содержание АК в исследуемом образце, мг/100 г.

Навески жидких проб (витаминизированные соки, напитки и т.п.) отбирают пипеткой. Навески проб густой консистенции (сиропы, концентраты и пр.), плохо стекающие из пипетки, берут весовым путем подобно твердым продуктам. Затем в этих пробах определяют по общим правилам плотность для пересчета содержания витамина на единицу объема.

5.1. Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты

Сущность метода

Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты основано на экстрагировании аскорбиновой кислоты или ее солей раствором кислоты (соляной, щавелевой, трихлоруксусной, метафосфорной или смесью уксусной и метафосфорной) с последующим визуальным титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски.

Подготовка к выполнению измерения (испытанию)

Выбор экстрагирующего раствора

Таблица 19

ЭКСТРАГИРУЮЩИЕ АГЕНТЫ

При выборе экстрагирующего агента также следует учитывать влияние мешающих определению компонентов исследуемой матрицы (табл. 20).

Таблица 20

КОМПОНЕНТЫ, МЕШАЮЩИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЮ АК

Приготовление экстрагирующего раствора

Приготовление водного раствора соляной кислоты массовой концентрации 20 г/куб. дм (2%)

47,5 куб. см 36%-ной соляной кислоты доводят до метки в 1000 куб. см мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/куб. дм (3%)

30 г кристаллической трихлоруксусной кислоты доводят до метки в 1000 куб. см мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/куб. дм

Взвешивают 60,00 г растертой в ступке метафосфорной кислоты на весах 4-го класса точности, растворяют без нагревания в 100 — 200 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Раствор хранят при (6 +/- 2) °С не более 7 сут.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 30 г/куб. дм

Необходимый для измерения объем водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/куб. дм смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:1. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/куб. дм

Взвешивают 1,8 г трилона Б на весах 2 класса точности и растворяют в 100 — 300 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см, доливая дистиллированную воду до метки.

Приготовление смеси водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/куб. дм и раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/куб. дм или раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/куб. дм (раствор осадителя)

Отмеряют цилиндром 300 куб. см водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/куб. дм (или водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/куб. дм) и 300 куб. см раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/куб. дм в коническую колбу объемом 750 куб. см и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление смеси уксусной и метафосфорной кислот

К раствору 15 г метафосфорной кислоты в 200 куб. см дистиллированной воды добавляют 40 куб. см ледяной уксусной кислоты и доводят дистиллированной водой до 500 куб. см. Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение 7 дней.

Приготовление стандартного раствора АК

Растворяют 0,1000 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты, отвечающей требованиям ГФ XI, в мерной колбе емкостью 100 куб. см в выбранном экстрагирующем растворе и доводят тем же раствором до метки, 10 куб. см полученного раствора АК помещают в мерную колбу на 100 куб. см и доводят до метки раствором, используемым в качестве экстрагирующего. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (раствор красителя) и определение его титра

Взвешивают 0,100 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия на весах 2 класса точности, растворяют, тщательно перемешивая, в 250 куб. см свежекипяченой дистиллированной воды температурой (90 +/- 5) °С, содержащей около 50 мг бикарбоната натрия. После охлаждения раствора до (20 +/- 5) °С доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 куб. см, затем фильтруют через складчатый фильтр в склянку из темного стекла. Раствор хранят при (6 +/- 2) °С не более 1 месяца.

Определение титра

К 1 мл стандартного раствора АК добавляют 9 куб. см выбранного экстрагирующего раствора и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 15 — 20 с (). Таким же образом титруют 10 куб. см экстрагирующего раствора (). Поправку к титру раствора (Т) в мг АК, эквивалентных 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, вычисляют по формуле:

где К — количество АК в 1 мл стандартного раствора, мг.

Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 4,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 куб. см дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 куб. см), потенциометрически доводят pH до 4,0.

Приготовление раствора ацетатного буфера с рН 5,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 куб. см дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 50 куб. см), потенциометрически доводят pH до 5,0.

Приготовление 1,0 М раствора соляной кислоты

17,2 мл 36% соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе емкостью на 200 куб. см и доводят до метки дистиллированной водой.

Приготовление 1,0 М раствора ацетата натрия

82,0 г безводного ацетата натрия растворяют в мерной колбе емкостью 1000 куб. см дистиллированной водой и доводят до метки.

Приготовление солянокислого буфера с pH 5,2

К 40 куб. см 1,0 М раствора соляной кислоты приливают 200 куб. см 1,0 М раствора ацетата натрия и доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе емкостью 1000 куб. см.

Проведение испытания

Экстрагирование

Для приготовления экстракта рассчитанную массу навески взвешивают с погрешностью +/- 0,0001 г. Затем гомогенизируют ее с небольшим количеством выбранного экстрагирующего агента. После чего полученный гомогенат количественно переносят в мерную колбу или мерный цилиндр объемом доводят до метки экстрагирующим агентом, тщательно перемешивают, настаивают 5 — 10 мин. и фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Для жидких пищевых добавок необходимое количество материала отмеривают пипеткой и доводят до метки экстрагирующим агентом в соответствующей мерной колбе.

Визуальное титрование

Для определения АК 1 — 10 мл экстракта с общим содержанием АК около 0,1 мг вносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 или 100 куб. см, доводят объем экстрагентом до 10 куб. см и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 15 — 20 с. Аналогично титруют равный объем экстрагирующего агента (контроль на реактивы).

Обработка результатов измерения

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки, вычисляют по формуле:

где:

Т — титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, мг/куб. см ;

— объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший на титрование исследуемого раствора, куб. см;

— объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший на контрольное испытание, куб. см;

остальные обозначения см. выше.

Для пищевых добавок, содержащих редуцирующие примеси, вместо контроля на реактивы проводят контрольное испытание на присутствие этих примесей. Для этого в колбу помещают такой же объем экстракта, как для определения АК, прибавляют равный ему объем ацетатного буферного раствора с pH 4,0, 36 — 40%-ный раствор формальдегида в объеме, равном половине объема буферного раствора, перемешивают и выдерживают в течение 10 мин., закрыв предварительно колбу пробкой. Затем содержимое титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений и не менее чем с двумя различными навесками, различающимися не более чем на 10%. Чувствительность визуального титрования составляет 5 мкг/куб. см.

5.2. Определение витамина С в образцах, дающих окрашенные экстракты

Флуориметрический метод определения

Этот метод рассмотрен в «Руководстве по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов», 1998.

Метод индофенол-ксилольной экстракции

Этот метод рассмотрен в сборнике научных трудов «Теоретические и клинические аспекты науки о питании», т. VIII, 1987, с. 178 — 180.

Колориметрический анализ АК в водной среде

Приготовление экстракта и реактивов см. в п. 5.2.

Проведение анализа. Готовят растворы в следующей последовательности (табл. 21).

Таблица 21

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДОБАВЛЕНИЯ РЕАГЕНТОВ В КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОМ МЕТОДЕ

При экстракции 2% НСl на анализ берут по 5 куб. см ацетатного буфера.

При большой концентрации АК или интенсивной окраске экстракта берут меньше 5 куб. см экстракта, добавляя в растворы N 3 и 3* количество экстрагирующего агента, равное 5 куб. см, минус объем пробы. Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 1 — 3 при лямбда = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 100 г исследуемого образца, рассчитывают по формуле:

где:

К — количество АК в 0,5 куб. см стандартного раствора, взятого на определение, мг;

— поглощение фенолята в контрольном растворе (N 1) против поглощения фенолята в растворе стандарта (N 2);

— поглощение фенолята в контрольном растворе N 1 (кювета сравнения — раствор N 1*);

— поглощение фенолята в растворе экстракта N 3 (кювета сравнения — раствор N 3*);

остальные обозначения приведены выше.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений.

5.3. Спектрофотометрическое определение витамина С в напитках

Проведение анализа

После дегазации и, если необходимо, фильтрования исследуемых напитков готовят три раствора, добавляя реагенты в следующей последовательности (табл. 22).

Таблица 22

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДОБАВЛЕНИЯ РЕАГЕНТОВ ПРИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ВИТАМИНА С

Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 2 — 3 при лямбда = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 л напитка, рассчитывают по формуле:

где:

К — количество АК в 0,5 куб. см стандартного раствора, взятого на определение, мг;

— величина поглощения исследуемого раствора N 3 против поглощения фенолята в контроле на рективы;

— общий объем исследуемого напитка, обычно его принимают равным 1000 куб. см;

— величина поглощения стандартного раствора N 2 против поглощения фенолята в контроле на рективы;

— объем исследуемого напитка, взятый для спектрофотометрирования, в данном случае — 0,5 куб. см.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое двух определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 3% от среднего арифметического.

Чувствительность — 3 мкг АК в пробе.

Для одной партии буфера и одного и того же раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия величину (К/), характеризующую качество реактива Тильманса, можно определять один раз в течение одной-двух недель, считая ее постоянной.

5.4. Потенциометрическое титрование

Этот метод описан в «Руководстве по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов», 1998.

Приложение 1

НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИТАМИНОВ

Аскорбиновая кислота

Белые кристаллы. Устойчива в твердом состоянии. Водные растворы имеют pH 3. Водные растворы устойчивы только в отсутствии кислорода, на воздухе устойчивы при pH 5 — 6, очень неустойчивы при щелочных pH. Окисление катализируют Cu, Fe. Хорошо растворима в воде — 33,3 г в 100 куб. см при комнатной температуре.

Тиаминхлорид гидрохлорид

Белые кристаллы. Гигроскопичен. Устойчив в твердом состоянии на воздухе. Водные растворы при pH > 5 не устойчивы к нагреванию, при pH > 7,0 не устойчивы при комнатной температуре. Хорошо растворим в воде — 100 г в 100 куб. см при комнатной температуре.

Рибофлавин

Желтые кристаллы. Сухое твердое вещество устойчиво к рассеянному свету. Чрезвычайно фотолабилен в растворах, особенно щелочных. Нейтральные и кислые водные растворы устойчивы в темноте, за 1 мес. разлагается 3% при 27 °С и pH 6,0. Быстро разлагается в щелочных растворах. Малорастворим в воде — 0,01 г в 100 куб. см при 25 °С и 0,23 г в 100 куб. см при 100 °С. Растворимость в кислых растворах: в 3%-ной соляной кислоте при 15 °С — 0,026%.

Пиридоксингидрохлорид

Белые кристаллы. Устойчив в твердом состоянии на свету. Нейтральные и щелочные растворы фотолабильны. Хорошо растворим в воде — 22 г в 100 куб. см при комнатной температуре.

альфа-токоферол

Светло-желтые масла. Хорошо растворим в этаноле. Медленно окисляется на воздухе, быстро — в присутствии щелочи или при нагревании. Устойчив к действию кислот (до 100 °С). Постепенно темнеет на свету, чувствителен к УФ-свету.

альфа-токоферилацетат

Желтые кристаллы. Эфиры (ацетат и др.) гораздо более устойчивы к свету и кислороду.

Ретинол

Желтые кристаллы. Легко окисляется на воздухе. Разрушается под действием УФ-света. Устойчив в щелочной среде, неустойчив — в кислой. Хорошо растворим в этаноле.

бета-каротин

Темно-фиолетовые кристаллы. Окисляется на воздухе, фотолабилен. Растворим в этаноле.

Приложение 2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РАСТВОРОВ ВИТАМИНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ СТАНДАРТОВ

Таблица 23

КОЭФФИЦИЕНТЫ МОЛЯРНОЙ ЭКСТИНКЦИИ ВИТАМИНОВ ДЛЯ УТОЧНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ

Таблица 24

КОЭФФИЦИЕНТЫ ЭКСТИНКЦИИ 1%-НЫХ РАСТВОРОВ ВИТАМИНОВ ДЛЯ УТОЧНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ

Таблица 25

УТОЧНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ ВИТАМИНОВ

Концентрацию стандартного раствора витамина (мкг/куб. см) рассчитывают по формуле:

где:

D — поглощение раствора;

Е — коэффициент молярной экстинкции;

М — молекулярная масса;

V — объем раствора в кювете (3 куб. см), куб. см;

— объем стандартного раствора, взятого на анализ, куб. см.

Приложение 3

ВЫДЕЛЕНИЕ РИБОФЛАВИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО АПОБЕЛКА ИЗ БЕЛКА КУРИНЫХ ЯИЦ

Получение препарата рибофлавинсвязывающего апобелка (РбСБ) проводят при комнатной температуре по компилятивной методике Tillotson J.A., Bashor M.M., White Н.В. с небольшими изменениями.

Реактивы и их приготовление

5%-ный водный раствор фенола (C6H5OH).

5 г фенола растворяют при постоянном перемешивании в дистиллированной воде, доводят объем до 100 куб. см. Фенол относится к 2 классу опасности.

0,1 н. соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 куб. см концентрированной (ро = 1,19 г/куб. см) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 куб. см.

500 мМ трис-HCl буфер (pH 7,5).

60,5 г трис(гидроксиметил)аминометана (C4H11NO3) растворяют в 500 куб. см дистиллированной воды, доводят pH до 7,5 потенциометрически с помощью 1 н. соляной кислоты (примерно 400 куб. см). Объем буфера доводят дистиллированной водой до 1000 куб. см.

50 мМ трис-HCl буфер (pH 7,5).

Готовят разведением в 10 раз, добавляя к 100 куб. см 500 мМ трис-HCl буфер (pH 7,5) дистиллированную воду до 1000 куб. см.

0,4 М хлорид натрия (NaCl), приготовленный на 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5).

4,37 г NaCl растворяют в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5), доводят объем до 200 куб. см.

6 мМ соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,5 куб. см концентрированной (ро = 1,19 г/куб. см) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 900 куб. см.

250 мМ Na-ацетатный буфер (pH 3,2).

17 г ацетата натрия (СН3СООNа) растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды, доводят потенциометрически pH до 3,2 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/куб. см), доводят объем дистиллированной водой до объема 500 куб. см.

25 мМ Na-ацетатный буфер (pH 3,2).

К 100 куб. см 250 мМ Na-ацетатного буфера (pH 3,2) добавляют дистиллированную воду, доводят объем до 1000 куб. см.

25 мМ Na-ацетатный буфер (pH 5,8).

340 мг уксуснокислого натрия (CH3COONa) растворяют в 40 куб. см дистиллированной воды, доводят потенциометрически pH до 5,8 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/куб. см). Доливают дистиллированную воду до объема 100 куб. см.

Выделение

Белки 2 — 10 свежих куриных яиц гомогенизируют вручную в гомогенизаторе Поттера (стекло-тефлон) до получения массы однородной вязкости. Добавляют сухой NаСl до концентрации 20% (вес/объем) при постоянном перемешивании механической мешалкой. К полученной суспензии приливают равный объем 5%-ного водного раствора фенола и центрифугируют 10 мин. при 1500 g. С помощью ваты снимают верхнюю пленку. Супернатант желтого цвета диализируют 5 ч против 100 объемов дистиллированной воды (5 — 8 смен) и в течение ночи против 20 объемов 50 мМ трис-НСl (pH 7,5), затем центрифугируют.

Надосадочный раствор наносят на колонку (1,2 х 7 см) DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Швеция), предварительно уравновешенную 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7,5). После нанесения РбСБ виден в виде желтой зоны в верхней части колонки. Колонку промывают буфером нанесения до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не становится ниже 0,010. Флавопротеин элюируют 0,4 М NaCl, приготовленным на 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5). При элюции с колонки собирают визуально видимые ярко окрашенные фракции, содержащие флавопротеин. Фракции флавопротеина в замороженном состоянии при -20 °С могут храниться до 6 мес. Полное отделение рибофлавина от флавопротеина можно проводить двумя способами: диализом против 6 мМ НСl до полного обесцвечивания диализата и хроматографией на колонке КМ-целлюлозы. Для этого элюированные с DEAE-Sephadex A-50 фракции флавопротеина диализируют против 20 объемов 25 мМ Na-ацетатного буфера (pH 3,2) с трехкратной заменой диализирующего буфера в течение 16 ч. Затем наносят на колонку (1 х 10 см) КМ-целлюлозы (Reanal, Венгрия), предварительно уравновешенную 25 мМ Na-ацетатным буфером (pH 3,2). После нанесения РбСБ также виден на колонке в виде желтой зоны, так как не весь рибофлавин диссоциирован от РбСБ. Для удаления рибофлавина колонку промывают буфером нанесения до полного исчезновения желтой окраски на колонке и уменьшения экстинкции в элюируемом растворе до величины меньше 0,010 при лямбда = 455 нм. Апопротеин элюируют 25 мМ Na-ацетатным буфером (pH 5,8), измеряя поглощение элюата при 280 нм. Фракции с экстинкцией, превышающей 0,1, собирают. Фракции апопротеина, полученные с помощью диализа или хроматографии, диализируют против 100 объемов дистиллированной воды в течение ночи, хранят при -20 °С в течение 12 мес. Из белков двух яиц получают 30 — 40 мг апобелка. В лиофилизованном состоянии его активность сохраняется в течение нескольких лет. По данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия полученный обоими способами препарат апобелка содержит не менее 80% пептида с кажущейся молекулярной массой около 36000.

II. Методы определения минеральных веществ

Метод включает подготовку проб и непосредственно проведение количественного определения.

Методы подготовки проб

1.1. Способ сухой минерализации

1.1.1. Способ основан на полном разложении органических веществ путем сжигания пробы в электропечи при контролируемом температурном режиме и предназначен для БАД, кроме содержащих 60% жира и более.

1.1.2. Подготовка к минерализации

Фарфоровые чашки или тигли после обычной мойки дополнительно обрабатывают раствором уксусной кислоты на кипящей водяной бане в течение 1 ч или промывают горячим раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Кварцевые чаши и тигли моют раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной и ополаскивают дистиллированной водой.

В чашу (чашку, тигель) в зависимости от определяемого элемента берут навеску продукта из подготовленной к испытаниям пробы, взвешенную с погрешностью 0,01 г при массе навески до 10 г и с погрешностью 0,1 г при массе навески 10 г и более. Масса навески пробы указана в табл. 1 (более подробно см. ГОСТ 26929-94).

1.1.3. Минерализация проб сырья и пищевых продуктов

1.1.3.1. Навеску средней пробы замачивают в 96% этиловом спирте из расчета 5 куб. см спирта на 1 г сухого вещества. Чашки (тигли) с навеской покрываются часовыми стеклами или чашками Петри, выдерживают при комнатной температуре в течение 12 — 48 ч.

1.1.3.2. Чашки переносят на электроплитку, осторожно высушивают и, постепенно увеличивая нагрев, выдерживают на плитке до начала обугливания.

1.1.3.3. БАД с высоким содержанием сахаров перед обугливанием обрабатывают 20%-ным раствором серной кислоты из расчета 5 куб. см кислоты на 1 г сухого вещества. Далее — по п. 1.1.3.2.

1.1.3.4. Чашки с высушенными пробами помещают в холодную электропечь. Минерализацию проб проводят постепенно, повышая температуру электропечи на 50 °С через каждые 30 мин. и доводя ее до 450 °С, — продолжают минерализацию при этих условиях до получения серой золы.

Чашу с золой вынимают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и серую золу смачивают водой и 0,5 — 1 куб. см раствора азотной кислоты (1:1). Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь, постепенно доводя температуру до 300 °С, и выдерживают 0,5 ч. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой, снова доозоляют.

1.1.4. Полученную золу растворяют при нагревании в азотной кислоте (1:1) из расчета 1 — 5 куб. см кислоты на навеску в зависимости от зольности продукта. Раствор выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1%-ной азотной или соляной кислоте до объема 15 — 20 куб. см.

1.1.5. При неполном растворении золы, полученной по п. 1.1.4, азотнокислый раствор с осадком упаривают досуха и перерастворяют в минимальном объеме (5 — 10 куб. см) соляной кислоты (1:1), снова упаривают до влажных солей. Полученные соли растворяют в 1% соляной кислоте до объема 15 — 20 куб. см.

1.1.6. Если растворы золы, полученные по п. 1.1.4 или 1.1.5, содержат нерастворимый осадок, объем растворителя можно довести до 25 — 30 куб. см, пробу подогреть до растворения. Если и в этом случае полного растворения не наблюдается, раствор отфильтровывают через промытый растворителем фильтр и осадок отбрасывают.

1.2. Способ мокрой минерализации

1.2.1. Способ основан на полном разрушении органических веществ пробы при нагревании с серной и азотной концентрированными кислотами с добавлением перекиси водорода и предназначен для всех видов БАД, кроме содержащих сливочное масло и животные жиры.

1.2.2. Подготовка к минерализации

1.2.2.1. Стеклянную посуду после обычной мойки дополнительно промывают раствором азотной кислоты, ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой.

1.2.2.2. Навеску жидких и пюреобразных БАД по п. 1.2.2 взвешивают в стакане, переносят в колбу Кьельдаля или плоскодонную колбу, стараясь не попасть на стенки колбы.

1.2.2.3. Навеску БАД по п. 1.2.2 берут на обеззоленный фильтр, заворачивают в него и стеклянной палочкой помещают на дно колбы Кьельдаля или плоскодонной колбы.

1.2.2.4. Навеску сухих БАД (желатиноподобных) помещают в колбу Кьельдаля, добавляют 15 куб. см воды, перемешивают. Желатин затем оставляют на 1 ч для набухания.

1.2.3. Минерализация проб сырья и продуктов

1.2.3.1. Кислотная минерализация проб сырья и продуктов, кроме растительного масла, маргарина, пищевых жиров

В колбу с пробой БАД, подготовленной к минерализации по п. 1.2.2, вносят азотную кислоту из расчета 10 куб. см на каждые 5 г продукта и выдерживают не менее 15 мин. Затем в колбу вносят 2 — 3 стеклянных шарика для равномерности кипения, закрывают грушевидной пробкой и начинают нагревать на электроплитке слабо, затем сильнее, упаривая содержимое колбы до объема 3 — 5 куб. см.

Колбу охлаждают, вносят 10 куб. см азотной кислоты, содержимое упаривают до объема 5 куб. см, после чего охлаждают. Эту процедуру повторяют 2 — 4 раза.

В колбу вносят 10 куб. см азотной кислоты, 2 куб. см серной кислоты, 2 куб. см перекиси водорода из расчета на каждые 5 г образца. Минерализацию БАД на молочной основе проводят без добавления серной кислоты. Содержимое колбы упаривают до объема 5 куб. см, не допуская образования коричневой окраски жидкости. При появлении коричневой окраски нагревание прекращают.

Колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 куб. см азотной кислоты и 2 куб. см перекиси водорода и снова нагревают до появления белых паров серного ангидрида. Если при этом раствор не обесцветился, эту процедуру повторяют. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным.

Для удаления остатков кислот в охлажденную колбу добавляют 10 куб. см воды и кипятят 10 мин. с момента выделения белых паров, затем охлаждают. Добавление воды и нагревание повторяют еще 2 раза.

Если при этом образуется осадок, в колбу вносят 20 куб. см дистиллированной воды, 2 куб. см серной кислоты, 5 куб. см соляной кислоты и кипятят до растворения осадка, постоянно дополняя испаряющуюся воду. Полученный минерализат после охлаждения используют для анализа полностью или количественно переносят водой в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, доводят до метки водой и перемешивают.

1.2.3.2. Кислотная минерализация проб с высоким содержанием жира

Исследуемую пробу в колбе Кьельдаля, подготовленную к минерализации по п. 1.2.2, нагревают на электроплитке 7 — 8 ч до образования вязкой массы, охлаждают, добавляют 25 куб. см азотной кислоты и вновь осторожно нагревают, избегая бурного вспенивания. После прекращения вспенивания колбу с содержимым охлаждают, добавляют еще 25 куб. см азотной кислоты и 12 куб. см хлорной кислоты и нагревают до получения бесцветной жидкости. Если во время сжигания жидкость темнеет, то к ней добавляют периодически по 5 куб. см азотной кислоты и продолжают нагревание до завершения минерализации. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным. Затем продолжают процедуру по п. 1.2.3.1.

1.3. Способ кислотной экстракции (неполной минерализации)

1.3.1. Способ основан на экстракции элементов из пробы продукта кипячением с разбавленной соляной или азотной кислотой и предназначен для жиросодержащих БАД.

1.3.2. Экстракция и подготовка экстрактов к анализу

1.3.2.1. Экстракция проб БАД

В термостойкую колбу с навеской образца, отобранного по п. 1.2.2, вносят цилиндром 40 куб. см раствора соляной кислоты (1:1) и такой же объем раствора азотной кислоты (1:2).

В колбу добавляют несколько стеклянных шариков, вставляют в нее холодильник, помещают на электроплитку, покрытую асбестом, и кипятят в течение 1,5 ч с момента закипания. Затем содержимое колбы медленно охлаждают до комнатной температуры, не вынимая холодильника.

В колбу с экстракционной смесью жиросодержащих БАД с кислотой помещают в холодную водяную баню для затвердевания жира. Затвердевший жир прокалывают стеклянной палочкой, фильтруют через фильтр, смоченный кислотой, затем промывают фильтр 5 — 7 куб. см дистиллированной воды. Оставшийся в колбе жир расплавляют на водяной бане, добавляют 10 куб. см раствора кислоты, встряхивают, охлаждают, после охлаждения жир прокалывают и промывную жидкость сливают в тот же сосуд через тот же фильтр, затем фильтр промывают 5 — 7 куб. см дистиллированной воды.

Экстракционную смесь масла с кислотой переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают 10 куб. см кислоты, которую сливают в ту же воронку. После разделения слоев нижний водный слой сливают через фильтр, смоченный кислотой, в кварцевую или фарфоровую чашку, затем фильтр промывают 5 — 7 куб. см дистиллированной воды.

Чашу с экстракционной смесью осторожно выпаривают и обугливают на электроплитке. Затем помещают в электропечь и озоляют до исчезновения обугленных частиц.

1. Атомно-абсорбционный метод определения содержания натрия, калия, кальция, магния, железа, марганца, меди, цинка, свинца, кадмия, кобальта, никеля, хрома

Сущность метода

Метод основан на распылении раствора минерализата испытуемой пробы в воздушно-ацетиленовом пламени. Металлы, находящиеся в растворе минерализата, попадая в пламя, переходят в атомное состояние. Величина адсорбции света с длиной волны, соответствующей резонансной линии, пропорциональна значению концентрации металла в испытуемой пробе.

Контрольный (холостой) опыт

При проведении деструкции проб любым способом обязательно проведение контрольного (холостого) опыта для учета уровня загрязнений, которые могут возникнуть на любой стадии подготовки проб. В каждой подготавливаемой серии проб контрольный тигель (чашка, стакан и пр.) обязательно проводят через все стадии подготовки вместе с тиглями, содержащими навески БАД, при одинаковом времени нахождения на электроплитке, в муфеле, при использовании тех же реактивов в том же количестве, той же мерной посуды и т.д. Полученный в холостом опыте раствор анализируют в той же серии измерений, что и растворы проб. Если пробы БАД обычно анализируют в двух повторностях, то контрольный опыт также целесообразно проводить в двух повторностях.

Подготовка к испытанию

Приготовление растворов

Определение содержания элементов в испытуемых растворах проводят методом градуировочного графика, который строится по значениям сигналов абсорбции растворов сравнения.

Головные стандартные растворы (эталоны) готовят из чистых металлов (более 99,9%) или чистых (х.ч., ос.ч.) устойчивых соединений элементов при использовании растворителей, обеспечивающих устойчивость растворов при хранении (допускается использование коммерческих растворов). Концентрация металла в головном растворе должна быть равна 1 г/куб. дм (1000 мкг/куб. см) (табл. 26). Срок их хранения обычно не превышает 2 — 3 лет, если растворы хранятся в герметичной посуде из стекла твердых сортов, полиэтилена высокой плотности, полистирола, кварца, т.е. материалов, наименее склонных к ионному обмену и абсорбции. Разбавленные растворы с концентрацией порядка 100 мкг/куб. см обычно могут храниться до 1 мес., с концентрацией 10 мкг/куб. см — 2 — 3 дня. Необходимо избегать применения резиновых пробок, которые могут быть источником загрязнения для ряда микроэлементов, а также избегать хранения растворов в местах, куда попадает прямой солнечный свет. Для приготовления головных стандартных растворов не рекомендуется использовать кристаллогидраты, которые могут не отвечать предполагаемому составу, и нестойкие реактивы, например перманганат калия.

Стандартные растворы сравнения (рабочие эталоны) готовят путем разбавления головных стандартных растворов до концентрации, которая должна соответствовать рабочему диапазону концентраций и быть близка к концентрации элемента в анализируемом растворе. Разбавление производят тем же бланковым раствором, который применяется для приготовления анализируемых растворов проб.

Обычно для построения градуировочного графика в области рабочих концентраций достаточно 3 — 5 растворов сравнения, при работе в линейной области — 2 раствора. При большой и особенно знакопеременной кривизне градуировочного графика необходимо увеличивать число стандартных растворов сравнения или ограничивать область рабочих концентраций более узким диапазоном (табл. 27).

Приготовление растворов и проб к испытанию

Раствор золы может анализироваться непосредственно или после дополнительной подготовки, которая необходима в следующих случаях:

а) концентрация элемента в растворе значительно превышает верхний предел интервала рабочих концентраций. Производят разбавление исходного раствора бланковым раствором до необходимого уровня концентрации;

б) концентрация элемента в исходном растворе ниже предела его обнаружения. Если необходима количественная, а не односторонняя («не более»…) оценка, производят концентрирование элемента методом экстракции. Экстракцию применяют также при определении микроэлементов на приборах, которые не имеют автоматической коррекции неселективного поглощения.

Для проведения экстракции рассматриваемых элементов могут быть применены разнообразные экстракционные системы, в частности система диэтилдитиокарбамат натрия (или аммония) — n-бутилацетат (или метилизобутилкетон). Эти системы при регулировании pH позволяют провести экстракцию железа, цинка, меди, марганца, кадмия, свинца, кобальта, никеля и хрома.

Подготовка спектрофотометра к работе и условия измерения

Юстировку прибора проводят в соответствии с технической инструкцией завода (фирмы) — изготовителя. Рекомендуемые условия измерений, а также значения предела определения по данным авторов методики приведены в табл. 27.

Альтернативные длины волн резонансных линий натрия и калия, указанные в табл. 27, могут использоваться для определения в разных областях концентраций, если позволяют технические характеристики лампы и прибора. Для свинца и хрома измерение на указанных альтернативных линиях может отличаться не только чувствительностью, но и отношением сигнал/шум, скоростью дрейфа сигнала. Поэтому выбор резонансной линии в этих случаях проводится для каждого прибора после предварительных сравнительных испытаний.

Указанные в табл. 27 номинальные значения ширины щели монохроматора отвечают отсутствию перекрывания резонансной полосы поглощения с соседними линиями спектра. Тем не менее настройку монохроматора по максимуму излучения источника рекомендуется проводить при минимально возможной щели. Измерения абсорбции таких элементов, как железо, свинец, кадмий, кобальт, никель и хром, при концентрациях, близких к пределу обнаружения, могут проводиться при максимальной щели монохроматора, если для данного прибора это дает улучшение отношения сигнал/шум.

Таблица 26

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ СПОСОБЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГОЛОВНЫХ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ, КОНЦЕНТРАЦИЯ МЕТАЛЛА — 1000 МКГ/КУБ. СМ

Таблица 27

УСЛОВИЯ АТОМНО-АБСОРБЦИОННЫХ ИЗМЕРЕНИЙ В ВОЗДУШНО-АЦЕТИЛЕНОВОМ ПЛАМЕНИ

Три вида воздушно-ацетиленового пламени, указанные в табл. 27, устанавливают приближенно и, как правило, визуально. Восстановительное пламя соответствует соотношению потоков воздух/ацетилен (примерно 4:1), при котором появляется слабое белесое свечение в нижней части факела. Окислительное пламя требует вдвое меньшего расхода ацетилена при том же воздушном потоке. Стехиометрическим пламенем считается промежуточный вариант. При определении микроэлементов, особенно кобальта, никеля и хрома, условия измерения могут быть дополнительно улучшены при юстировке соотношения газов и высоты горелки до получения максимального сигнала поглощения (с учетом смещения нулевой линии).

Предел определения соответствовал тройному стандартному отклонению шума измеряемого сигнала прибора у авторов методики.

Особенности определения отдельных элементов

Натрий и калий

Может измеряться как абсорбция, так и эмиссия этих элементов.

В отличие от атомно-абсорбционного измерения эмиссия натрия при длине волны дублетной линии 589 нм может давать завышенные результаты вследствие наложения излучения кальция. Поэтому при атомно-эмиссионных измерениях натрия подготовка проб должна включать отделение кальция посредством осаждения его оксалатом аммония.

При концентрациях калия менее 100 мкг/куб. см необходимо согласовывать примерное соотношение калия и натрия в пробах и смешанных растворах сравнения. Это соотношение может устанавливаться как на основе ожидаемых результатов, так и путем предварительных приближенных определений. При концентрациях калия более 100 мкг/куб. см влиянием натрия можно пренебречь.

Кальций

Бланковый раствор, растворы проб и растворы сравнения должны содержать 0,5% стронция (в расчете на металл) в виде хлорида.

Железо и цинк

Растворы проб для анализа во многих случаях требуют разбавления, которое уменьшает межэлементные и матричные влияния. Превышение границ диапазона рабочих концентраций, указанных в табл. 26, может дать смещенные результаты.

Проведение измерений и обработка результатов

Измерения проводят в соответствии с технической инструкцией, прилагаемой к прибору, с учетом следующих особенностей. Потенциальная возможность появления дрейфа или измерения чувствительности вследствие частичного засорения системы распылителя в процессе работы требует более или менее частого контроля, т.е. проведения повторных градуировок. Частота переградуировок определяется скоростью дрейфа и требованиями точности. При отсутствии дрейфа или для кратковременной серии измерений достаточно проведения двух градуировок — в начале и в конце измерений. В других случаях целесообразно проводить измерения по следующей схеме: 1-я градуировка — 1-я серия замеров абсорбции 5 — 10 анализируемых растворов; 2-я градуировка — 2-я серия замеров абсорбции тех же растворов в обратном порядке; 3-я градуировка. Результаты, полученные в двух сериях, усредняют.

Обработка результатов

Пересчет концентрации элемента в растворе (С, мкг/куб. см) на содержание его в БАД (X, мг/кг) проводят по формуле:

где:

— уровень загрязнения в контрольном опыте, мкг/куб. см;

К — коэффициент разбавления или концентрирования исходного раствора пробы, равный отношению объема анализировавшегося раствора к объему аликвоты, взятой для разбавления или концентрирования;

Y — объем исходного раствора пробы, куб. см;

— объем раствора в контрольном опыте, куб. см;

Р — навеска пробы, г.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории (r), и недопустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), а также внутрилабораторное среднеквадратичное отклонение () и межлабораторное среднеквадратичное отклонение () приведены в табл. 28, где X — средний уровень концентрации элемента в продукте, мг/кг; а, b — безразмерные эмпирические коэффициенты.

Таблица 28

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ УНИФИЦИРОВАННЫХ АТОМНО-АБСОРБЦИОННЫХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА БАД

2. Молибдено-ванадиевый метод определения фосфора

Метод предназначен для определения массовой доли фосфора в БАД, основан на образовании желтого фосфорно-молибдено-ванадиевого комплекса. Метод заключается в сухой минерализации пробы, растворении золы, проведении цветной реакции с молибдено-ванадиевым реактивом и измерении интенсивности желтого окрашивания раствора.

1. Аппаратура, реактивы и материалы

Калий фосфорнокислый однозамещенный, х.ч., по ГОСТ 4198.

Аммоний ванадиевокислый, мета, х.ч., по ГОСТ 9336.

Аммоний молибденовокислый, ч.д.а., по ГОСТ 3765.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление раствора соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/куб. дм

В мерную колбу вместимостью 1 куб. дм вносят 67,4 куб. см концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

2.2. Приготовление основного стандартного раствора фосфора с массовой концентрацией 1 г/куб. дм

Раствор готовят по ГОСТ 4212.

Раствор готовят из калия фосфорнокислого однозамещенного, предварительно высушенного до постоянной массы в сушильном шкафу при 104 °С или в эксикаторе над концентрированной серной кислотой. Навеску 4,3930 г КН2РО4, взвешенную с погрешностью не более 0,001 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 куб. дм, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и перемешивают.

2.3. Приготовление раствора аммония ванадиевокислого с массовой концентрацией 2,5 г/куб. дм (раствор А)

2,5 г аммония ванадиевокислого растворяют в мерной посуде вместимостью 1 куб. дм в 500 куб. см кипящей дистиллированной воды. После охлаждения раствора до комнатной температуры в него вносят 20 куб. см концентрированной азотной кислоты. Объем раствора доводят до 1 куб. дм дистиллированной водой, перемешивают.

2.4. Приготовление раствора аммония молибденовокислого с массовой концентрацией 100 г/куб. дм (раствор Б)

100 г аммония молибденовокислого растворяют в мерной посуде вместимостью 1 куб. дм в 500 куб. см дистиллированной воды, подогретой до 50 °С. Раствор охлаждают до комнатной температуры, затем осторожно при перемешивании стеклянной палочкой вносят 100 куб. см концентрированной серной кислоты. Перемешивание продолжают до достижения раствором комнатной температуры, доводят его объем до 1 куб. дм дистиллированной водой, перемешивают.

2.5. Приготовление молибдено-ванадиевого реактива

Реактив готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б. Составной реактив годен в течение месяца.

2.6. Минерализация

Минерализацию проводят сухим способом по ГОСТ 26929-86.

Рекомендуемые величины массы навески указаны в табл. 29.

Таблица 29

МАССА НАВЕСКИ БАД ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ МАССОВОЙ ДОЛИ ФОСФОРА

2.7. Измерения проводят на спектрофотометре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм при длине волны 436 нм или на фотоэлектроколориметре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 20 мм со светофильтром лямбда = 440,5 нм.

2.8. Приготовление растворов сравнения

2.8.1. В мерную колбу вместимостью 50 куб. см вносят 5 куб. см основного стандартного раствора фосфора с массовой концентрацией 1 г/куб. дм, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. Раствор готовят в день построения градуировочного графика.

2.8.2. При проведении измерений на спектрофотометре в мерные колбы вместимостью 50 куб. см вносят 1, 2, 3, 4, 5, 6 куб. см рабочего стандартного раствора фосфора, приготовленного по п. 2.8.1, соответственно 100, 200, 300, 400, 500 и 600 мкг фосфора, добавляют воду до объема 10 куб. см. В каждую колбу вносят 10 куб. см разбавленной (1:9) серной кислоты, 10 куб. см составного молибдено-ванадиевого реактива, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

2.8.3. При проведении измерений на фотоэлектроколориметре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 20 мм в мерные колбы вместимостью 50 куб. см вносят 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 куб. см рабочего стандартного раствора фосфора, приготовленного по п. 2.8.1, соответственно 50, 100, 150, 200, 250 и 300 мкг фосфора и далее по п. 2.8.2.

2.8.4. Растворы выдерживают 30 мин. при температуре 20 — 30 °С и измеряют оптическую плотность против контрольного раствора.

2.8.5. Построение аналитического градуировочного графика

Градуировочный график строят, откладывая на оси абсцисс введенные в растворы сравнения массы фосфора в мкг, на оси ординат — соответствующие им значения оптической плотности.

3. Проведение испытания

3.1. Золу, полученную по п. 2.6, растворяют в 5 куб. см раствора соляной кислоты (1 + 1) при нагревании на кипящей водяной бане и раствор упаривают до влажных солей, к осадку в тигле добавляют 20 куб. см раствора соляной кислоты (25 г/куб. дм) и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 — 10 мин. После охлаждения содержимое тигля количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят до метки раствором соляной кислоты 25 г/куб. дм. Раствор перемешивают.

3.2. В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают аликвотный объем от 1 до 4 куб. см раствора, приготовленного по п. 3.1, добавляют воду до объема 10 куб. см, 10 куб. см разбавленной (1:9) серной кислоты, 10 куб. см составного молибдено-ванадиевого реактива, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

Оптическую плотность раствора измеряют по п. 2.8.4.

3.3. По полученному значению оптической плотности с помощью градуировочного графика находят массу фосфора, содержащуюся в аликвотном объеме минерализата.

4. Обработка результатов

4.1. Массовую долю фосфора в мг/100 г вычисляют по формуле:

где:

m — масса фосфора, найденная по градуировочному графику, мкг;

V — общий объем минерализата, куб. см;

— аликвотный объем минерализата, взятый для испытания, куб. см;

10 — коэффициент пересчета в мг/100 г;

М — навеска образца, г.

4.2. Результаты определений рассчитывают до третьей значащей цифры.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

4.3. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 30.

Таблица 30

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

3. Комплексонометрический метод определения кальция и магния

Метод предназначен для определения массовой доли кальция и магния в БАД, основан на образовании в щелочной среде малодиссоциированных комплексных соединений катионов кальция и магния с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б). При pH 12 — 13,5 образуются комплексные соединения кальция, при pH 10,0 — кальция и магния. Метод заключается в сухой минерализации пробы при 450 °С, растворении золы, титровании раствора золы раствором трилона Б в присутствии индикатора кислотного хромового темно-синего.

1. Специфические реактивы

Индикатор хромовый темно-синий кислотный по ТУ 6-09-3870, 5 г/куб. дм в растворе этилового спирта (1:5).

Индикатор метилрот по ГОСТ 5853, 1 г/куб. дм в растворе этилового спирта (5:3).

Гидроксиламин солянокислый по ГОСТ 5459, х.ч., раствор 100 г/куб. дм.

Калия или натрия гидроокись по ГОСТ 24363 и ГОСТ 4328, соответственно, х.ч., раствор 200 г/куб. дм.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., раствор 25 г/куб. дм и разбавленная (1:1).

Натрий сернистый по ГОСТ 2053, ч.д.а., раствор 20 г/куб. дм.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280, х.ч., раствор 100 г/куб. дм.

Соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты двуводная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х.ч., или стандарт-титр.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление растворов для проведения испытания

2.1.1. Приготовление основного раствора кальция с молярной концентрацией 0,01 моль/куб. дм. Кальций углекислый высушивают до постоянной массы при 100 — 105 °С. Навеску соли 1,009 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, приливают 20 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят объем раствора до 1000 куб. см водой, тщательно перемешивают.

2.1.2. Приготовление буферного раствора с pH 10,0

20 г хлористого аммония растворяют в небольшом количестве воды, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, приливают 80 куб. см аммиака 250 г/куб. дм, доводят объем раствора до 1000 куб. см.

2.1.3. Приготовление раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,01 моль/куб. дм

Раствор трилона Б готовят из стандарт-титра. При отсутствии стандарт-титра навеску 3,72 г трилона Б, взвешенную с погрешностью не более 0,01 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в воде, доводят объем раствора до 1000 куб. см бидистиллированной водой, перемешивают. Мутный раствор фильтруют. Срок хранения 6 мес.

2.1.4. Определение точной концентрации раствора трилона Б

Пипеткой отбирают 10 куб. см основного раствора кальция в коническую колбу вместимостью 100 куб. см. Вносят 5 — 10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего и 6 куб. см раствора гидроокиси натрия с массовой концентрацией 200 г/куб. дм. Быстро титруют из бюретки раствором трилона Б до перехода окраски из малиново-фиолетовой в синюю, не исчезающую в течение 1 мин. Молярную концентрацию раствора трилона Б рассчитывают по формуле:

где:

С — молярная концентрация раствора трилона Б, моль/куб. дм;

0,01 — молярная концентрация стандартного раствора кальция, моль/куб. дм;

10 — объем стандартного раствора кальция, взятый для титрования, куб. см;

V — объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование, куб. см.

2.2. Минерализация

2.2.1. Минерализацию сухим способом проводят по ГОСТ 26929-86.

2.2.2. В табл. 31 указаны рекомендуемые величины массы навесок для некоторых продуктов.

Таблица 31

МАССА НАВЕСКИ БАД ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ МАССОВОЙ ДОЛИ КАЛЬЦИЯ И МАГНИЯ

3. Проведение испытаний

3.1. К золе, полученной по п. 2.2, добавляют 20 куб. см раствора соляной кислоты с массовой концентрацией 250 г/куб. дм и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 — 10 мин. до полного растворения золы, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, доводят объем до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

3.2. Перед проведением анализа необходимо приготовить микробюретку для титрования.

3.3. Определение массовой доли кальция

3.3.1. В коническую колбу вместимостью 100 куб. см помещают аликвотный объем раствора золы, равный 10 куб. см, добавляют 3 куб. см раствора гидроксиламина и 3 куб. см раствора натрия лимоннокислого. Вносят 5 — 10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего. Приливают 6 куб. см раствора гидроокиси с массовой концентрацией 200 г/куб. дм и тотчас быстро титруют раствором трилона Б до перехода окраски из малиново-фиолетовой в синюю, сравнивая с оттитрованной контрольной пробой.

3.3.2. В конце титрования замечают объем трилона Б, пошедшего на титрование, и прибавляют еще каплю трилона. Если окраска раствора не меняется, титрование считают законченным.

3.3.3. Во время титрования можно ориентироваться на синий ореол, образующийся в месте падения капли трилона. Титрование считают законченным, если синий ореол больше не образуется.

3.3.4. Окраску раствора необходимо смотреть на фоне белого экрана. Окраска оттитрованного раствора устойчива длительное время.

3.3.5. Перед определением кальция оттитровывают контрольную пробу, которую готовят по п. 3.3.1, но вместо раствора золы приливают 4 куб. см соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/куб. дм.

3.3.6. В том случае, если на титрование аликвоты раствора золы уходит больше 3 куб. см трилона либо конец титрования затягивается, испытуемый раствор следует разбавить.

3.3.7. Если на титрование уходит меньше 0,5 куб. см трилона Б, необходимо увеличить массу навески анализируемой БАД либо аликвотный объем, взятый для анализа. Можно уменьшить концентрацию трилона, разбавив его в 2 раза.

3.4. Определение массовой доли магния

3.4.1. Другие 10 куб. см раствора золы, в которых определяют сумму кальция и магния, помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 1 — 2 капли метилрота и нейтрализуют из бюретки гидроокисью натрия с массовой концентрацией 50 г/куб. дм. Добавляют 0,5 куб. см раствора сернистого натрия, разбавляют водой до 100 куб. см, добавляют 5 куб. см буферного раствора. pH полученного раствора равен 10,0. Вносят 5 — 10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего и медленно титруют трилоном Б до устойчивой голубой окраски, сравнивая с оттитрованной контрольной пробой. При титровании раствор интенсивно перемешивают. Замечают объем, пошедший на титрование, прибавляют еще несколько капель трилона Б. Если окраска не меняется, титрование считают законченным.

3.4.2. Перед определением магния оттитровывают контрольную пробу, которую готовят по п. 3.4.1, но вместо раствора золы приливают 4 куб. см соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/куб. дм.

3.4.3. Объем трилона Б, пошедший на титрование магния, определяют по разности объемов трилона, пошедшего на титрование, суммы кальция и магния и одного кальция.

Примечание. Метод неприменим для определения массовой доли магния в БАД, в которых массовая доля кальция в 20 раз и более превышает массовую долю магния.

4. Обработка результатов

4.1. Массовую долю кальция () в % вычисляют по формуле:

где:

С — молярная концентрация раствора трилона Б, моль/куб. дм;

— объем исходного раствора золы, куб. см;

— объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование контрольной пробы, куб. см;

— объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование кальция, куб. см;

— объем исследуемого раствора, взятый для титрования, куб. см;

m — навеска БАД, г;

100 — коэффициент пересчета в 100 г образца;

40,08 — атомная масса кальция, г.

4.2. Массовую долю магния () в % вычисляют по формуле:

где:

— объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование контрольной пробы, куб. см;

— объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование суммы кальция и магния, куб. см;

24,305 — атомная масса магния, г;

остальные обозначения те же, что и в формуле (1).

4.3. Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. Минимальная массовая доля кальция, определяемая данным методом в аликвотном объеме минерализата, составляет 10 мкг. Минимальная массовая доля магния, определяемая данным методом в аликвотном объеме минерализата, составляет 6 мкг.

4.4. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднеарифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднеарифметическому значению (RR) в зависимости от содержания Са и Mg в продукте приведены в табл. 32.

Таблица 32

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

4. Определение свинца и кадмия методом инверсионной вольтамперометрии

Метод основан на использовании инверсионной вольтамперометрии.

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Полярограф марки ПЛС-1 или аналогичный по техническим характеристикам.

Азот газообразный по ГОСТу 9293-74, о.ч., или «0», или другой инертный газ с массовой долей кислорода не более 0,001%.

Кадмий, ч.д.а.

Дитизон по ГОСТ 10165-79, ч.д.а., растворы в хлороформе 0,01; 0,30 г/куб. дм.

Кислота азотная, о.ч., по ГОСТ 11135-78 или кислота азотная, х.ч., по ГОСТ 4461-77, плотностью 1,40 г/куб. см и разбавленная бидистиллированной водой (1 + 1) и (1 + 2).

Кислота соляная, о.ч., по ГОСТ 14261-77 или кислота соляная по ГОСТ 3118-77, плотностью 1,19 г/куб. см, разбавленные бидистиллированной водой растворы НСl концентрации 2,0 и 0,1 моль/куб. дм.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., гранулированная и раствор NaOH, 0,02 моль/куб. дм.

Пирогаллол А по ГОСТ 6408-75, ч.д.а., раствор 250 г/куб. дм.

Ртуть по ГОСТ 4658-73, РО или PI.

Свинец азотнокислый, х.ч., по ГОСТ 4236-77.

Подготовка к испытанию

Подготовка проб

Подготовку проб и минерализацию БАД путем сухого озоления проводят по ГОСТу 26926-86.

Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную стеклянную посуду промывают хромовой смесью, водой, азотной кислотой плотностью 1,4 г/куб. см, несколько раз дистиллированной и дважды бидистиллированной водой и высушивают. Затем промывают раствором дитизона 0,01 г/куб. дм. Даже при незначительном изменении окраски проводят несколько раз обработку дитизоном: заполняют посуду раствором дитизона 0,30 г/куб. дм и выдерживают каждый раз по 30 мин., после чего промывают хлороформом и повторяют обработку, используя раствор дитизона 0,01 г/куб. дм. Промывают хлороформом и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу.

Очистка инертного газа от кислорода

При наличии примеси кислорода более 0,001% газ пропускают через поглотительную смесь, состоящую из растворов пирогаллола и гидроокиси натрия в соотношении 1:5.

Приготовление основного раствора кадмия

Основной раствор кадмия готовят следующим образом: 1,000 г металлического кадмия помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и растворяют при нагревании на электроплитке в 25 куб. см разбавленной (1:1) азотной кислоты. Раствор выпаривают на электроплитке со слабым нагревом до объема 3 куб. см, приливают 15 куб. см соляной кислоты плотностью 19 г/куб. см и вновь выпаривают до того же объема. Выпаривание повторяют еще раза два, добавляя каждый раз по 5 куб. см соляной кислоты. После охлаждения добавляют 50 куб. см соляной кислоты плотностью 1,19 г/куб. см, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см и доводят бидистиллированной водой до метки. Раствор хранят не более 1 года. Концентрация кадмия в основном растворе равна 1 мг/куб. см. Стандартные растворы необходимой концентрации готовят последовательным разбавлением в 10, 100 и 1000 раз основного раствора кадмия соляной кислотой 0,1 моль/куб. дм.

Приготовление основного раствора свинца

Основной раствор свинца готовят следующим образом: свинец азотнокислый перекристаллизовывают и высушивают при 104 +/- 1 °С до постоянной массы. 1,599 г высушенной соли растворяют в небольшом объеме бидистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см. В колбу добавляют 5 куб. см азотной кислоты плотностью 1,4 г/куб. см и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой. Раствор хранят не более 1 года. Концентрация свинца в основном растворе равна 1 мг/куб. см. Стандартные растворы необходимой концентрации готовят последовательным разбавлением в 10, 100 и 1000 раз основного раствора свинца соляной кислотой с концентрацией 0,1 моль/куб. дм.

Приготовление контрольного раствора

Проверяют каждую новую партию реактивов.

Готовят, используя все реактивы и растворы, аналогично приготовлению испытуемого раствора. Если контрольный раствор содержит измеримое количество кадмия или свинца, его готовят ежедневно при каждой серии измерений.

Подготовка капилляра электрода

В стакан электролизера помещают около 20 куб. см раствора соляной кислоты 2 моль/куб. дм и проводят сначала накопление в течение 60 с, затем растворение при максимальной скорости развертки (10,5 х 10 мВ/с). Процедуру электрохимической очистки повторяют еще 2 раза. Ячейку многократно промывают бидистиллированной водой.

Приготовление испытуемого раствора

Золу, полученную по ГОСТ 26929-86, растворяют в тигле при нагревании на электроплитке в 5 куб. см разбавленной (1:1) соляной кислоты, раствор выпаривают на электроплитке до объема около 1 куб. см и затем досуха на водяной бане. Осадок растворяют в 15 куб. см раствора соляной кислоты 0,1 моль/куб. дм и количественно переносят в стакан электролизера, смывая тигель 5 куб. см той же кислоты.

Проведение испытания

Стакан с пробой помещают в гнездо полярографического датчика, опускают в испытуемый раствор подводящую инертный газ или азот трубку и барбатируют раствор в течение 10 — 15 мин., затем конец поднимают, закрепляют над поверхностью раствора и несколько ослабляют ток газа. Записывают первую полярограмму. При этом измерение проводят инверсионной вольтамперометрией в 3-электродном режиме. Накопление проводят при начальном напряжении 1100 мВ, время накопления от 60 до 300 °С в зависимости от концентрации металлов. Полярограмму записывают при напряжении от минус 1100 мВ до 200 мВ, развертка анодная. Детализацию условий измерений осуществляют в соответствии с инструкцией к прибору и спецификой измеряемой пробы. Затем в стакан с используемым раствором вносят добавку — необходимый стандартный раствор в таком количестве, чтобы высота пика кадмия или свинца примерно удвоилась по сравнению с первоначальной. При этом объем добавляемого стандартного раствора должен быть не более 0,5 куб. см. Снова пропускают через раствор азот, как указано выше, в течение 5 мин. Затем проводят в тех же режимах запись второй полярограммы.

Обработка результатов

Массовую долю кадмия или свинца (X) в мг/кг или массовую концентрацию (мг/куб. дм) вычисляют по высоте пиков, измеренных на полярограммах с помощью линейки с точностью до 1 мм.

Расчет проводят по формуле:

для массовой доли:

для массовой концентрации:

где:

— масса свинца, добавленного перед вторым полярографированием, мкг;

— высота пика свинца, полученного при первом полярографировании, мм;

— высота пика свинца, полученного при втором полярографировании, мм;

— объем испытуемого раствора, приготовленного из озоленной навески, куб. см;

— объем испытуемого раствора после внесения добавки, куб. см;

М — масса навески БАД, взятая для озоления, г;

V — объем БАД, взятый для озоления, куб. см;

— масса свинца в контрольном растворе, мкг.

Вычисление производят до четвертого десятичного знака.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельные определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 33.

Таблица 33

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

III. Методы определения микроэлементов

1. Определение йода титрометрическим методом

Принцип метода

Метод основан на взаимодействии йодата калия с йодидом калия в кислой среде (1) и титровании выделившегося йода тиосульфатом натрия (2).

(1) IO3- + 5I- + 6Н + (3I2 + 3H2O (из соли) (из KI) (из H2SO4)

(2) 2Na2S2O3 + I2 (2NaI + Na2S4O6 (тиосульфат (йодат (тетратионат натрия) натрия) натрия)

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

1. Калий йодистый (KI) по ГОСТ 4232-74.

2. Кислота серная (H2SO4) по ГОСТ 4204-77.

3. Натрий серноватистокислый пятиводный (тиосульфат натрия, Na2S2O3(5H2O) по ГОСТ 27068-86 или фиксанал 0,1 г-экв.

4. Крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76.

5. Натрия хлорид, ЧДА, ГОСТ 4233-77.

Приготовление реактивов

0,005 М тиосульфат натрия (Na2S2O3(5H2O)). 1,24 г Na2S2O3(5H2O) развести в 1000 куб. см дистиллированной свежепрокипяченной воды. Т.к. кристаллический тиосульфат при хранении набирает влагу, что требует введения поправки на его титр, то в случае возникновения сомнений рекомендуется использовать фиксанал Na2S2O3(5H2O) 0,1 г-эквивалент, который растворяют в дистиллированной воде, доводя конечный объем до 1000 куб. см, и полученный раствор разводят в 20 раз (50 куб. см раствора + 950 куб. см воды) до конечной концентрации 0,005 М.

Полученный раствор хранят в прохладном темном месте. Его объем достаточен для анализа 100 — 200 проб в зависимости от содержания в них йода. При соблюдении условий хранения раствор стабилен не менее одного месяца.

2 Н серная кислота (H2SO4). 6 куб. см концентрированной H2SO4 медленно доливают в 90 куб. см воды, затем доводят раствор водой до конечного объема 100 куб. см. Полученное количество достаточно для анализа 100 проб. Раствор сохраняет свои свойства неопределенно долгое время.

Примечание. Во всех случаях кислоту надо наливать в воду, а не наоборот, во избежание чрезмерного повышения температуры смеси и разбрызгивания кислоты. Во время добавления кислоты раствор следует непрерывно перемешивать.

10%-ный йодид калия (KI) свежеприготовленный. 10 г KI растворяют в 100 куб. см воды. Хранят в прохладном темном месте. Его количества достаточно для анализа 20 проб.

Насыщенный раствор хлорида натрия (NaCl). В колбу объемом 250 куб. см с 80 куб. см воды постепенно добавляют при перемешивании и/или нагревании NaCl до тех пор, пока не прекратится его растворение. Хранят под пробкой. Раствор сохраняет свои свойства по крайней мере в течение года.

Индикаторный раствор крахмала. В колбу объемом 250 куб. см вносят 1 г растворимого крахмала, добавляют 10 куб. см воды и нагревают до растворения крахмала. В полученную горячую смесь добавляют 90 куб. см насыщенного раствора NaCl и перемешивают. Полученного объема достаточно для анализа 50 проб. Готовый раствор хранят в прохладном темном месте. Раствор остается стабильным на протяжении месяца.

Примечание. В день проведения анализа раствор необходимо прогреть (но не кипятить) для ресуспендирования возможного осадка.

Проведение анализа

Этап 1. Навеску исследуемой пробы массой 10 г растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды в конической колбе объемом 250 куб. см. Если полученный раствор мутный, его необходимо профильтровать.

Этап 2. К полученному раствору добавляют 1 куб. см 2 н. H2SO4, перемешивают, добавляют 5 куб. см 10%-ного раствора KI, перемешивают, закрывают колбу пробкой и помещают на 10 мин. в темное место.

Этап 3. К исследуемому раствору, приобретшему темно-желтую окраску, добавляют из бюретки при перемешивании 0,005 М Na2S2O3 до перехода окраски в светло-желтую. Добавляют в исследуемый раствор примерно 2 куб. см индикаторного раствора крахмала, от чего смесь должна приобрести темно-синюю окраску, и продолжают титрование до тех пор, пока последняя не исчезнет.

Отмечают объем раствора тиосульфата, пошедший на титрование.

Требования к безопасности:

— до начала титрования реакционную смесь следует хранить в темном месте ввиду возможности побочного процесса под воздействием света, который вызывает окисление ионов йодида до йода;

— при использовании не вполне остывшего раствора крахмала точность определений понижается;

— если индикаторный раствор добавлен слишком рано, происходит образование прочного, очень медленно реагирующего комплекса йода с крахмалом, что приводит к завышению результатов анализа;

— реакция должна проходить при умеренной комнатной температуре (ниже 30 °С), поскольку йод характеризуется повышенной летучестью, а индикаторный раствор при нагревании теряет чувствительность.

Обработка результатов

Количество йода, мг/кг, исследуемой соли вычисляют по формуле:

где:

V — объем 0,005 М Na2S2O3, пошедший на титрование, куб. см;

10 — навеска соли, взятой на анализ, г;

100 — пересчет на 100 г соли;

0,1057 — количество йода из йодата калия исследуемого образца соли, соответствующее 1 куб. см пошедшего на титрование этого образца 0,005 М Na2S2O3.

Примечание. Из уравнений реакций (1) и (2), лежащих в основе данного метода определения йода в соли, обогащенной КIO3, следует, что из общего количества йода, оттитровываемого тиосульфатом натрия в исследуемой пробе, на долю йода, происходящего из КIO3, приходится 1/6 часть, т.е. не 0,6345, а 0,1057 мг.

2. Определение селена спектрофлуориметрическим методом

Принцип метода

Метод основан на флуориметрическом определении комплекса селенистой кислоты с 2,3-диаминонафталином — пиазоселенола, получаемого при мокром сжигании образца смесью азотной и хлорной кислот, с последующим восстановлением соляной кислотой шестивалентного селена до четырехвалентного и образованием комплекса с 2,3-диаминонафталином.

Подготовка к испытанию

Рабочие растворы

0,1 М раствор соляной кислоты: 1 куб. см 36% HCl разбавляют до 100 куб. см водой.

0,6 М раствор соляной кислоты: 51 куб. см 36% HCl разбавляют до 100 куб. см водой.

Раствор аммиака: 25% раствор аммиака разбавляют водой (1:1).

Раствор тетранатриевой соли этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА): 1,25 г ЭДТА растворяют в 100 куб. см воды.

Раствор 2,3-диаминонафталина (ДАН) готовят в день определения: 0,1 г ДАН растворяют в 100 куб. см 0,1 М соляной кислоты при слабом нагревании. Раствор трижды экстрагируют гексаном, фильтруют через складчатый фильтр и хранят под слоем гексана в темноте при температуре 0 — 4 °С до момента флуориметрического определения. Не допускается облучение прямым светом и использование смазки для шлифов.

Основной стандартный раствор, содержащий 1 мкМ селена/куб. см: 0,01729 г Na2SeO3 растворяют в небольшом количестве 0,1 М соляной кислоты в мерной колбе на 100 куб. см, доводят объем до метки соляной кислотой этой же концентрации. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.

Рабочий стандартный раствор, содержащий 1 нМ селена/куб. см: пипеткой вносят 5 куб. см основного стандартного раствора в мерную колбу на 500 куб. см и доводят объем до метки 0,1 М соляной кислотой. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.

Мокрое сжигание. Взвешивают и переносят в пробирки для сжигания от 50 до 100 мг БАД и соответствующий образец сравнения. Для построения калибровочного графика в 7 пробирок вносят: 0 (контроль): 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного рабочего раствора, что соответствует 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 нМ селена в пробе. Во все пробирки добавляют 1,5 мл смеси, содержащей азотную и хлорную (42%-ные) кислоты в соотношении 1:0,7, и оставляют при комнатной температуре на 12 — 18 час., затем пробирки помещают в блок для сжигания и минерализуют при 120 °С — 1 час, 150 °С — 1 час, 180 — 185 °С — 1,5 часа. При наличии обугливания сжигание повторяют с новой навеской, увеличив количество хлорной кислоты до 1,0 — 1,4 куб. см.

Удаление следов азотной кислоты

Блок сжигания охлаждают до 150 °С, добавляют к пробам 1 — 2 капли перекиси водорода и выдерживают при указанной температуре в течение 10 мин. Затем пробы сразу же вынимают из блока сжигания.

Восстановление селената

К пробам добавляют по 1 куб. см 6 М соляной кислоты и выдерживают при 110 °С в течение 10 мин. Затем сразу же вынимают из блока сжигания и добавляют 1 куб. см дистиллированной воды.

Конденсация селенистой кислоты с ДАН

В каждую пробирку добавляют по 0,5 куб. см раствора ЭДТА и по 1 куб. см раствора аммиака, быстро доводят pH до 1 — 2 по универсальному индикатору, добавляя при необходимости по каплям раствор аммиака или 0,1 М соляную кислоту. К полученным растворам приливают по 1 куб. см раствора ДАН и выдерживают 30 мин. при 50 — 55 °С, закрыв предварительно пробирки от прямого света. По окончании реакции пробы охлаждают до комн. температуры и каждую интенсивно встряхивают с 2,5 куб. см гексана в течение 50 — 60 сек.

Спектрофлуориметрический анализ

Определение интенсивности флуоресценции осуществляют при длине волны возбуждающего света 376 нм и эмиссионного света 519 нм. Дополнительный контроль за полнотой сжигания осуществляют по спектрам флуоресценции в диапазоне 450 — 600 нм. Полученный спектр должен иметь один максимум 519 нм.

Обработка результатов

Содержание селена, мкг/кг или мкг/л (X), вычисляют по формуле:

где:

С — количество селена, нМ, в пробе, определенное по калибровочному графику;

79 — атомная масса селена;

а — навеска образца, г или куб. см.

За окончательный результат принимается среднее арифметическое двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное стандартное отклонение в интервале 1 — 600 мкг/кг — не более 10%.

3. Определение токсичных элементов

Анализируют согласно методам главы 2, раздела II и согласно нормативным документам «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов», межгосударственному стандарту ГОСТ 26929-94, ГОСТ 26927-86 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов», межгосударственному стандарту ГОСТ 30178-96 «Методические указания по обнаружению и определению общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции N 5178-90», ГОСТ 26930-86 «Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка».

Глава 3. МИНОРНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ БАД (МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ БАД)

1. Определение антоцианинов

Антоцианины являются водорастворимыми пигментами, обусловливающими красную, синюю и фиолетовую окраску фруктов. Они относятся к классу флавоноидов и представляют собой гликозиды катиона флавония (рис. 1) <*>.

<*> Рисунки не приводятся.

1.1. Методика определения качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов с помощью ВЭЖХ

Образцы БАД с антоцианинсодержащими компонентами (экстракты черники, красного винограда и т.д.) экстрагируют дистиллированной водой; образцы соковых концентратов или сиропов разбавляют дистиллированной водой таким образом, чтобы суммарная концентрация антоцианинов составляла 0,05 — 0,2 мг в куб. см. Пробы фильтруют через мембранный фильтр Zetapor с диаметром пор 0,2 мкм. Разделение проводят на хроматографической колонке PLRP-S (полистирол-дивинилбензол) (PolymerLabs, Великобритания), 100 ангстрем, 5 мкм, 250 х 4,6 ID мм, элюент: 4 об. % ортофосфорная кислота, ацетонитрил, 90:10 об. %, скорость подачи элюента 1,0 куб. см/мин. Детектирование фотометрическое, лямбда = 520 нм.

Идентификацию пиков проводят путем сравнения с хроматограммами ягод с известным составом антоцианиновых пигментов и с литературными данными. Относительное содержание индивидуальных пигментов определяют как отношение площади хроматографического пика и суммы площадей пиков всех идентифицированных антоцианинов. Факторы удерживания антоцианинов приведены в табл. 34.

Таблица 34

ФАКТОРЫ УДЕРЖИВАНИЯ АНТОЦИАНИНОВЫХ ПИГМЕНТОВ

На рис. 2 приведена хроматограмма антоцианинов сока черники, для которой характерен самый богатый профиль пигментов.

Систематизированные литературные и экспериментальные данные по составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества соков, сокосодержащей продукции и БАД.

Таблица 35

1.2. Суммарное содержание антоцианиновых пигментов

Суммарное содержание антоцианиновых пигментов определяли методом pH-дифференциальной спектрофотометрии. Известно, что поглощение антоцианиновых пигментов сильно зависит от pH раствора: в сильнокислой среде окраска большинства антоцианинов ярко-красная, при увеличении pH она постепенно переходит в темно-синюю. Это связано с изменением структуры входящего в состав пигмента агликона. Различие в адсорбции при лямбда = 510 нм и pH 1 и 4,5 пропорционально содержанию антоцианина. Так как различие в величинах молярной адсорбции индивидуальных антоцианинов незначительно, суммарную концентрацию пигментов можно определять относительно одного из них, например цианидин-3-глюкозида (эпсилон = 26900):

где:

A — поглощение;

эпсилон и MW — коэффициент молярного поглощения и молекулярная масса антоцианина, используемого в качестве стандарта (для цианидин-3-глюкозида 26900 и 449,2 соответственно);

AF — разведение;

AV — объем, мл;

Al — длина кюветы, см;

m — масса образца, мг.

Метрологическая характеристика метода

Предел обнаружения метода 0,001%. Стандартное отклонение сходимости (Sr) не превышает 0,1 — 0,15. Среднее значение открываемости — 92 — 95%.

Систематизированные литературные и экспериментальные данные по составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества соков, сокосодержащей продукции и БАД.

2. Определение органических кислот с помощью ВЭЖХ

Принцип метода

Органические кислоты определяют в условиях обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Разделение органических кислот происходит в хроматографической колонке, наполненной октадецилсиликагелем. Концентрации определяют с помощью спектрофотометрического детектора при лямбда = 210 нм по методу внешнего стандарта.

Приборы и реагенты

Хроматографическая система: насос высокого давления Altex 110A (США), инжектор Rheodyne 7125 (США), колонка Kromasil C18, 5 мкм, 250 x 4,6 ID мм (MetaChem, США), спектрофотометрический детектор Spectroflow 757 (Kratos, США), система для обработки хроматографических данных МультиХром,1,5х (Амперсенд, Россия).

Подвижная фаза: 0,2 М фосфатный буфер, pH 2,6. Объемная скорость: 1,0 куб. см/мин. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мю м) или бумажный фильтр («синяя лента»).

Реагенты: калия дигидрофосфат (КН2РО4), фосфорная кислота (Н3РО4, 85%), ацетонитрил (CH3CN), дистиллированная вода.

Приготовление проб и стандартов

Стандартные растворы кислот готовят путем растворения точных навесок соответствующих кислот (purum, >= 99%, Fluka или Sigma) в мерных колбах. Градуировочные графики строят в координатах S (площадь пика) — С (концентрация кислоты), г/куб. дм, в интервале концентраций: 0,1 — 30 г/куб. дм для яблочной кислоты, 0,1 — 40 г/куб. дм для лимонной кислоты, 0,1 — 1 г/куб. дм для аскорбиновой кислоты, 0,05 — 0,5 г/куб. дм для изолимонной кислоты, 0,01 — 0,1 г/куб. дм для фумаровой кислоты. Растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр («синяя лента»).

Пробы готовят растворением сухих или разбавлением жидких концентратов БАД в 10 — 25 раз дистиллированной водой. Приготовленные растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр («синяя лента»).

ВЭЖХ определение органических кислот

Перед проведением анализа хроматографическую колонку кондиционируют подвижной фазой ацетонитрил — вода (70:30 об. %), затем систему промывают фосфатным буфером до установления ровной базовой линии. Стандартные растворы (5 — 20 мкл) вводят в хроматограф попеременно через каждые 2 — 3 пробы (10 мкл). Порядок элюирования органических кислот в условиях ОФ ВЭЖХ следующий:

Винная < хинная < янтарная < гидроксилимонная < яблочная < изолимонная < шикимовая < аскорбиновая < фумаровая < лимонная.

Коэффициенты емкости основных органических кислот, определяемых в БАД на основе фруктов и ягод, представлены в табл. 36.

Таблица 36

Концентрации органических кислот в пробах рассчитываются по площадям или высотам хроматографических пиков.

Примеры хроматограмм органических кислот апельсина и клюквы приведены на рис. 3 и 4.

3. Определение 5-оксиметилфурфурола в БАД на основе меда и углеводных сиропов

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации 5-оксиметилфурфурола в соках, напитках и меде основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод включает следующие этапы:

— разбавление аликвоты или навески жидкого БАД дистиллированной водой; растворение навески меда или медосодержащего БАД в дистиллированной воде;

— фильтрование полученного раствора;

— обнаружение и количественное определение ОМФ с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн 200 — 350 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с пределом допустимой погрешности +/- 0,0005 г по ГОСТ 2404-80.

Дистиллятор.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0 — 100 °С и ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 «синяя лента» по ТУ 2642-001-42624157-98.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207, х.ч., раствор концентрацией 150 г/куб. дм (раствор Карреза I).

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч.д.а., раствор концентрацией 300 г/куб. дм (раствор Карреза II).

Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор 0,45 мкм.

Бензол для хроматографии, х.ч. по ТУ 6-09-779-76.

Метанол — яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Кислота уксусная > 99,8%, ос.ч., ГОСТ 18270-72.

Баллон с сжатым азотом, ос.ч. по ГОСТ 9293-74.

5-оксиметилфурфурол (ОМФ) кристаллический, перекристаллизованный из метанола при температуре 64 — 65 °С и атмосферном давлении.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление стандартного раствора 5-оксиметилфурфурола

Приготовление основного стандартного раствора 5-ОМФ

0,05 г кристаллического 5-оксиметилфурфурола количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 25 куб. см ацетонитрила, доводят бензолом до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор в смеси бензол — ацетонитрил (9:1) с массовой долей 5-оксиметилфурфурола 0,2 мкг/куб. см.

Приготовление рабочего стандартного раствора 5-ОМФ

Аликвоту в 1 куб. см основного стандартного раствора ОМФ переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворитель отдувают досуха в токе азота, доводят метанолом до метки и тщательно перемешивают. Получают рабочий стандартный раствор ОМФ концентрацией 0,002 мкг/куб. см, который используют при градуировке хроматографа.

Основной и рабочий стандартные растворы 5-оксиметилфурфурола хранят в стеклянной посуде (пикнометре, мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0 °С). Сроки годности основного раствора 1 год, рабочего — 1 неделя.

Установление массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем стандартном растворе

Установление точной массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем стандартном растворе производят с помощью УФ-спектрофотометрии согласно данным о коэффициенте молярной экстинкции 5-оксиметилфурфурола в максимуме поглощения в УФ-спектре. Снимают УФ-спектр рабочего стандартного раствора в метаноле и измеряют его оптическую плотность. Рассчитывают концентрацию ОМФ в рабочем стандартном растворе по формуле:

где:

С — концентрация исследуемого раствора, мкг/куб. см или нг/мкл;

D — оптическая плотность раствора;

М — молекулярная масса 5-оксиметилфурфурола (126);

Е — коэффициент молярной экстинкции для метанольного раствора (16830);

L — толщина слоя раствора в см.

Значение относительной погрешности при определении массовой доли 5-оксиметилфурфурола в растворе с помощью УФ-спектрофотометрии не превышает 5% для доверительной вероятности 0,95.

Приготовление подвижной фазы

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 150 куб. см метанола, примерно 500 куб. см бидистиллированной воды и 10 куб. см уксусной кислоты, перемешивают и выдерживают до комнатной температуры, затем доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Подготовка образца

10 куб. см сокосодержащего БАД или концентрата фруктового сока помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см или 250 куб. см, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Полученные растворы фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» или нейлоновый фильтр.

5 — 10 г меда, медосодержащего пищевого продукта или БАД помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см или 250 куб. см, добавляют около 50 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до растворения, последовательно добавляют по 5 куб. см растворов Карреза I и Карреза II, каждый раз перемешивая смесь, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» или нейлоновый фильтр. Аликвоту полученных фильтратов вводят в хроматограф.

Выполнение измерений и вычисление результатов анализа

Условия хроматографического анализа

Подвижная фаза метанол — вода — уксусная кислота (15:84:1), скорость потока 1,0 мл/мин., обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 284 нм, чувствительность устанавливают 0,01 единицы адсорбции на всю шкалу, вводимый объем образца 5 — 15 мкл.

Вычисление результатов анализа

Массовую концентрацию 5-оксиметилфурфурола рассчитывают по формуле:

где:

М — массовая концентрация 5-оксиметилфурфурола, мг/куб. дм или мг/кг (ррm);

m — массовая доля внешнего стандарта ОМФ, введенного для калибровки хроматографа, нг;

— высота пика исследуемого компонента, соответствующая определенной массовой концентрации компонента в исследуемом образце, мм;

— средняя высота пика внешнего стандарта ОМФ, введенного для калибровки хроматографа, мм;

— общий объем анализируемой пробы, мкл;

— объем аликвоты, введенной в хроматограф, мкл;

Р — навеска или объем пробы, куб. см или г.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Основные характеристики метода

Предел обнаружения метода составляет 1,0 мг/кг.

Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000 мг/кг.

При соблюдении всех регламентируемых методикой условий проведения измерений относительная характеристика погрешности (стандартное отклонение сходимости) результата анализа при концентрации ОМФ в жидких БАД 2,0 мг/л не превышает 0,124 (3,43%) и при концентрации ОМФ в меде и медосодержащих БАД 5,0 мг/кг — 0,072 (5,34%).

Среднее значение открываемости ОМФ при концентрациях от 2,0 до 25 мг/кг составляет 87 — 95%.

4. Определение состава моно- и дисахаридов с помощью ВЭЖХ

Принципиальная схема метода

Метод заключается в пробоподготовке путем разбавления дистиллированной водой образцов жидких БАД или экстракции сухих БАД дистиллированной водой до концентрации сахаров примерно 2 — 10 мг/мл, фильтрования полученного раствора, разделении и количественном определении сахаров с помощью ВЖХ.

Приготовление стандартных растворов

Аналитические образцы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы сушат до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 «Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги».

Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы с концентрациями от 3 до 10 мг/куб. см в зависимости от чувствительности рефрактометрического детектора. Для этого навески сахаров массой 1 +/- 0,001 г или 0,3 +/- 0,001 г помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.

Готовят стандартный раствор смеси фруктозы, глюкозы и сахарозы с массовыми долями каждого компонента 10 мг/куб. см или 3 мг/куб. см. Для этого навески сахаров массой 1 +/- 0,001 г или 0,3 +/- 0,001 г помещают в одну мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.

Приготовление исследуемого образца

Анализируемый образец БАД растирают в ступке. Навеску массой 5 +/- 0,01 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 150 куб. см подогретой до 75 — 80 °С дистиллированной воды и встряхивают на аппарате для встряхивания 20 — 30 мин. Добавляют 15 куб. см 30%-ного раствора ацетата цинка, встряхивают, охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр «синяя лента». Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.

20 куб. см сокосодержащего БАД или 10 г углеводсодержащего сиропа помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят бидистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или через складчатый бумажный фильтр обеззоленный марки ФОМ. Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.

Анализ с помощью ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ с использованием амино-фазы

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил — вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0 — 1,5 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор, 10 — 15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 100 мкг фруктозы, глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании амино-фазы: фруктоза — 6 +/- 2, сорбит — 6,5 +/- 2, глюкоза — 7,5 +/- 1, сахароза — 10 +/- 1.

Анализ ВЭЖХ с использованием колонки и предколонки с катионитом в форме

Условия ВЭЖХ: катионообменная колонка и предколонка «Rezex RCU-USP Sugar Alcohols» в форме , температура колонки 80 — 90 °С, подвижная фаза бидистиллированная, деионизированная и фильтрованная вода, скорость подвижной фазы 0,4 — 0,8 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор, 10 — 15 мкл; чувствительность хроматографа устанавливается таким образом, чтобы 30 мкг фруктозы, глюкозы и сорбита соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании колонки и предколонки с катионитом в форме : сахароза — 10 +/- 1, глюкоза — 12 +/- 0,5, фруктоза — 14,5 +/- 0,2, сорбит — 22 +/- 0,5.

Предел обнаружения метода 0,02 — 0,05%. Стандартное отклонение сходимости (Sr) при концентрации сахаров 10% не превышает 0,05 — 0,07. Среднее значение открываемости от внесенного количества сахаров — 97 — 99%.

Перед работой хроматограф калибруют, для чего в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002, 0,005 и 0,01 куб. см стандартной смеси углеводов, что соответствует количествам 20, 50 и 100 мкг фруктозы, глюкозы и сахарозы (детектор RIDK 102) или 6, 15 и 30 мкг (детектор MERK L 7490). Для каждого количества углеводов определяют площадь пика на хроматограмме. Аналогичным образом проводят калибровку стандартного раствора сорбита.

Количественное определение углеводов

Идентификацию и количественное определение углеводов осуществляют методом внешних стандартов.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см (10 мкл) фильтрата. Определяют площадь пика углевода, соответствующего по времени удерживания одному из стандартов. Расчет концентрации фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы проводят по формуле:

где:

С — концентрация углевода в образце, %;

— объем, до которого доведена навеска при разбавлении водой, куб. см (100 куб. см);

— объем фильтрата, внесенный в хроматограф, 0,01 куб. см;

m — масса стандарта, введенного в хроматограф, мкг;

М — навеска образца, взятая для анализа, г.

Если пик углевода в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления фильтрата водой, т.е. после увеличения объема .

5. Определение массовой концентрации кофеина, теобромина, теофиллина

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации кофеина, теобромина, теофиллина в пищевых продуктах, БАД и безалкогольных напитках основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод анализа кофеина и теофиллина в БАД включает следующие этапы:

— экстракцию пуриновых алкалоидов из БАД в дистиллированной воде при нагревании;

— фильтрование полученного раствора;

— обнаружение и количественное определение с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Метод анализа теобромина, теофиллина и кофеина в пищевых продуктах и БАД на основе какао включает следующие этапы:

— экстракцию в дистиллированной воде, pH 7,3 — 7,8, при нагревании;

— переэкстракцию в хлороформ;

— переэкстракцию в фосфатный буфер, pH 3,0;

— фильтрование полученного раствора;

— обнаружение и количественное определение пуриновых алкалоидов с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.

Дистиллятор.

pH-метр, модель «pH 150М».

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0 — 100 °С и ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Бумага фильтровальная «красная лента» и «синяя лента» по ТУ 6-09-1678-95.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 6552, раствор массовой концентрацией 2,72 г/куб. дм, доведенный до pH 3,2 добавлением 2 — 2,5 куб. см ортофосфорной кислоты.

Кислота уксусная, ГОСТ 61-75, ч.д.а.

Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.

Кофеин, теобромин, теофиллин по действующей нормативно-технической документации.

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой концентрации 0,4 г/куб. дм.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочих растворов кофеина, теобромина, теофиллина (400 мг/куб. см)

Навески массой по 100,0 +/- 0,1 мг помещают в мерные колбы вместимостью 250 куб. см, до половины заполненные дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят дистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление стандартных растворов кофеина, теобромина, теофиллина (0,004 мг/куб. см)

Отмеряют пипеткой по 2,0 куб. см каждого рабочего раствора кофеина, теобромина, теофиллина концентрациями 400 мг/куб. см, переносят в мерные колбы вместимостью 250 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

Приготовление подвижной фазы для анализа кофеина

50 куб. см ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют 10 куб. см уксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу «красная лента».

Приготовление подвижной фазы для анализа смеси алкалоидов

2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в дистиллированной воде, перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят до pH 3,2 (2 — 2,5 куб. см). 850 куб. см полученного буферного раствора смешивают с 150 куб. см ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу «красная лента».

Подготовка образцов

Образцы тонизирующих напитков («Кола», тоники) подвергают по необходимости дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25 °С и отфильтровывают через бумажный фильтр. Аликвоту напитков (2 — 5 куб. см) помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Навеску пищевого продукта (2 — 5 +/- 0,01 г) (например, чай, кофе), БАД на основе натуральных растительных компонентов гуараны, орехов колы, листьев матэ и др. (5 — 10 капсул или таблеток, растертых в ступке) помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют до половины объема подогретой до 70 — 80 °С дистиллированной воды, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 15 — 20 мин., охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр с размером пор 0,5 мкм.

Навеску кондитерского изделия (10 — 20 +/- 0,01 г), содержащего какао-порошок (карамели, шоколад, ореховые пасты, глазурь и др.), измельченную на терке или в ступке, помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и добавляют 100 куб. см дистиллированной воды, подщелоченной 5 — 10 каплями раствора гидроокиси натрия (pH 7,5 — 8,0). Смесь подогревают до температуры 45 — 50 °С, перемешивают на аппарате для встряхивания 20 — 30 мин., фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» и отбирают 80 куб. см фильтрата. Если фильтрация затруднена, смесь центрифугируют при 2000 об./мин. и также отбирают 80 куб. см. К фильтрату добавляют 1,5 — 2 г хлористого натрия, перемешивают до растворения соли и переносят в делительную воронку. Пуриновые алкалоиды из водного раствора экстрагируют 50 куб. см хлороформа. Хлороформный раствор отделяют и встряхивают с 50 куб. см раствора калия фосфорнокислого однозамещенного, pH 3,2, после чего водный экстракт фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Остатки хлороформа из фильтрата удаляют в токе азота. Аликвоту полученного экстракта вводят в хроматограф. При анализе используют метод внешнего стандарта.

Проведение анализа ВЭЖХ и расчет концентрации пуриновых оснований

Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа кофеина: подвижная фаза ацетонитрил — вода дистиллированная — уксусная кислота (15:84:1). Скорость потока 0,7 куб. см/мин. Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01 е.о.п. Вводимый объем образца 10,0 куб. мм.

Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа смеси алкалоидов: подвижная фаза раствор калия фосфорнокислого однозамещенного, pH 3,2, — ацетонитрил (85:15), скорость потока 0,8 куб. см/мин., УФ-детектирование, длина волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01 е.о.п. Вводимый объем образца 10,0 куб. мм.

Примерные времена удерживания пуриновых алкалоидов: теобромин — 4,9 +/-0,1, теофиллин — 7,7 +/- 0,1, кофеин — 12,0 +/- 0,1.

Расчет концентраций пуриновых оснований

Массовую концентрацию теобромина, теофиллина или кофеина рассчитывают по формуле:

где:

— площадь пика исследуемого компонента;

— площадь пика соответствующего стандарта;

— объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;

— объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;

— масса стандарта пуринового алкалоида, введенная в хроматограф, нг;

— навеска образца, взятая для анализа и соответствующая объему фильтрата после экстракции подщелоченной водой, г (8 г).

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 13%.

Характеристика погрешности измерений

При соблюдении всех регламентируемых методикой условий проведения измерений относительная характеристика погрешности (стандартное отклонение сходимости) результата анализа при концентрации кофеина в БАД 2,0 мг/таблетку или капсулу не превышает 0,154 (3,43%), при концентрации теобромина в пищевом продукте 5 мг/100 г — 0,066 (4,89%).

Предел обнаружения метода определения пуриновых алкалоидов (теобромина, теофиллина, кофеина) в пищевых продуктах составляет 1,0 — 2,0 мг/кг. Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000 мг/кг.

Среднее значение открываемости пуриновых алкалоидов в БАД при концентрациях от 2,0 до 20 мг/таблетку составляет 87 — 95%, в пищевых продуктах при концентрациях от 5,0 до 25 мг/100 г — 82 — 90%.

6. Определение массовой концентрации хинина

Приготовление стандартных растворов

Приготовление градуировочного раствора хинина (800 мг/куб. см)

Навеску хинина массой 200,0 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, до половины заполненную бидистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят бидистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление градуировочного раствора хинина (0,008 мг/куб. см).

Отмеряют пипеткой 2,0 куб. см градуировочного раствора хинина концентрации 800 мг/куб. см, переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят до метки бидистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного (KH2PO4) помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, перемешивают до полного растворения. Полученный раствор ортофосфорной кислотой (Н3РО4) доводят до pH 3,0 и фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0,5 мкм. 760 куб. см полученного буферного раствора смешивают с 240 куб. см ацетонитрила (C2H3N). Срок годности полученного раствора не более недели.

Подготовка образца

Образцы напитков подвергают дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25 °С и отфильтровывают через бумажный фильтр.

Проведение анализа

Условия хроматографического анализа

Подвижная фаза 24% ацетонитрила, 76% 0,02 М раствора КН2РО4, доведенного ортофосфорной кислотой до pH 3,0. Скорость потока 2,0 мл/мин. УФ-детектирование, длина волны 254 нм.

Массовую концентрацию хинина рассчитывают сравнением площадей пиков образца и стандарта хинина по аналогии с формулой в разделе 5.

7. Определение содержания коэнзима Q10

Метод основан на определении высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Оборудование и реактивы

Жидкостной хроматограф с УФ-детектором.

Стандартный раствор Коэнзим Q10 концентрацией 100 мкг/мл готовят в смеси этанол — эфир (1:1).

Подготовка проб

Коэнзим Q10 — убихинон, нерастворим в воде, но хорошо растворим в спирте и эфире.

Из образца (обычно это капсулы) его выделяют растворением в смеси: 96%-ный этанол — эфир (1:1). Капсулы прокалывают в нескольких местах иглой, заливают смесью растворителей и оставляют при комнатной температуре в темном месте в плотно укупоренной склянке на сутки. Через сутки пробы хроматографируют.

Проведение испытания

Условия ВЭЖХ: колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4 — 6 мм. Сорбент — Сепарон SGX С18, размер частиц 7 мкм. Перед работой новую колонку промывают 40 мл изопропанола, затем 80 мл деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза: 96% этанол, очищенный перегонкой. Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 290 нм, шкала чувствительности 0,05 AUFS, скорость потока 10 мл/мин., время удерживания коэнзима Q 8,2 мин.

Обработка результатов: стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Расчет содержания Коэнзима Q производят методом абсолютной калибровки. Ошибка метода +/- 5%.

8. Определение L-карнитина (гамма-триметил-р-гидроксибутиробетаин)

L-карнитин — гигроскопические кристаллы, хорошо растворимые в воде, в этаноле. Малорастворим в ацетоне, изопропаноле, нерастворим в эфире.

Метод определения массовой концентрации L-карнитина в БАД и пищевых продуктах основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод анализа включает следующие этапы:

— экстракцию L-карнитина из БАД и пищевых продуктов подщелоченной дистиллированной водой при нагревании;

— осаждение высокомолекулярных составляющих экстракта ацетатом цинка;

— фильтрование полученного раствора;

— обнаружение и количественное определение с помощью ион-парной ВЭЖХ с УФ-детектором и использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.

Дистиллятор.

pH-метр, модель «pH 150М».

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0 — 100 °С и ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Бумага фильтровальная «красная лента» и «синяя лента» по ТУ 6-09-1678-95.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.

Додецилсульфат, натриевая соль, SERVA, раствор 0,005 М в дистиллированной воде.

L-карнитин по действующей нормативно-технической документации.

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой концентрации 0,4 г/куб. дм.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.

Цинк уксуснокислый 2-водный, ч.д.а., ГОСТ 5823-78, раствор 30%-ный в дистиллированной воде.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочего раствора L-карнитина (400 мг/куб. см)

Навеску L-карнитина массой 100,0 +/- 0,1 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, до половины заполненную дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят дистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление стандартного раствора L-карнитина (0,004 мг/куб. см)

Отмеряют пипеткой 2,0 куб. см рабочего раствора L-карнитина концентрацией 400 мг/куб. см, переносят в мерную колбу вместимостью 200 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

1,44 г додецилсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, растворяют в дистиллированной воде, перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят до pH 2,5 (2,5 — 3,06 куб. см). 850 куб. см полученного буферного раствора смешивают с 350 куб. см ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу «красная лента».

Подготовка проб

Выделение L-карнитина осуществляли следующим образом: навеску (2 г) измельченного БАД или продукта помещали в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляли 125 куб. см горячей (60 — 65 °С) дистиллированной воды, подщелоченной раствором NaOH массовой концентрации 0,4 г/куб. дм (pH 8,0 — 8,5), встряхивали на аппарате для встряхивания 30 минут, охлаждали до комнатной температуры, добавляли 30 куб. см 30%-ного раствора ацетата цинка, доводили дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр «красная лента» или через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Проведение испытания

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза раствор 0,005 М додецилсульфоната натрия — ацетонитрил (65:35). Скорость потока 1,0 куб. см/мин. Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 210 нм, шкала чувствительности 0,01 е.о.п. Вводимый объем образца 10,0 куб. мм. Время удерживания карнитина — 7,5 +/- 1,0 мин.

Расчет концентраций L-карнитина

Массовую концентрацию L-карнитина рассчитывают по формуле:

где:

— площадь пика исследуемого компонента;

— площадь пика стандарта;

— объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;

— объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;

— масса стандарта, введенная в хроматограф, мг;

— навеска образца, взятая для анализа.

Обработка результатов.
Характеристика погрешности измерений

За результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком. Относительное допустимое расхождение между результатами параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 13%. Ошибка метода +/- 5%.

Среднее значение открываемости L-карнитина в БАД при концентрациях 10 — 20 мг/таблетку или в пищевых продуктах при концентрациях от 100 мг % составляет 85 — 93%.

9. Определение полифенольных соединений

Принцип метода

Суммарное содержание фенольных соединений определяют модифицированным методом Фолина — Чокальтеу. Полифенольные соединения окисляются реактивом Фолина — Чокальтеу, состоящим из смеси фосфорно-вольфрамовой H2PW12O40 и фосфорно-молибденовой H3Pmo12O40 кислот, который, в свою очередь, восстанавливается в смесь окислов вольфрама (W8O23) голубого цвета и молибдена (Mo8O23). Абсорбция раствора при 750 нм пропорциональна содержанию фенольных соединений. В качестве полифенольного стандарта используют галловую кислоту.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн 200 — 350 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный КФК-2 (или аналогичный), ГОСТ 12083.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.

pH-метр лабораторный ЭВ-74 (или аналогичный) по ТУ 25-05-27-57.

Дистиллятор.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Стакан мерный В-1-500ТС вместимостью 500 куб. см по ГОСТ 25336.

Цилиндры 2-1000 и 2-100 по ГОСТ 1770.

Натрия вольфрамат по ГОСТ 18289.

Натрия молибдат по ГОСТ 10931.

Кислота ортофосфорная 85%-ная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная конц. по ГОСТ 3118.

Литий сернокислый (сульфат лития).

Натрий углекислый (карбонат натрия) по ГОСТ 83.

Водорода перекись по ГОСТ 177.

Бром по ГОСТ 4109.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Галловая кислота по действующей нормативно-технической документации.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление реактива Фолина

100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 куб. см дистиллированной воды. Добавляют 50 куб. см 85%-ной фосфорной кислоты (d = 1,71 г/куб. см), 100 куб. см концентрированной соляной кислоты (d = 1,19 г/куб. см) и кипятят на водяной бане в колбе с обратным холодильником под тягой в течение 10 ч. Добавляют 150 г сернокислого лития, несколько капель брома и снова кипятят в течение 15 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм и доводят объем до метки дистиллированной водой. Хранят реактив в темной бутылке со шлифом в холодильнике.

Приготовление раствора карбоната натрия

В мерную колбу вместимостью 1 куб. дм наливают около 500 куб. см дистиллированной воды и растворяют 200 г карбоната натрия при встряхивании. Доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Получают раствор карбоната натрия с концентрацией 20%.

Раствор галловой кислоты

В мерный стакан вместимостью 500 куб. см помещают 50 куб. см этилового спирта, доводят до метки 400 куб. см дистиллированной водой. Погружают в стакан электроды pH-метра и добавляют соляную кислоту до значения pH 3,2 — 3,25. Переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, при встряхивании растворяют 15 мг галловой кислоты и доводят дистиллированной водой до метки. Концентрация галловой кислоты 0,03 мг/куб. см.

Построение градуировочной кривой

1, 2, 5, 10, 20 куб. см раствора галловой кислоты помещают в 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см. В шестую колбу вносят 1 куб. см дистиллированной воды — контрольный раствор.

В каждую мерную колбу добавляют по 1 куб. см реактива Фолина — Чокальтеу, по 10 куб. см раствора карбоната натрия, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Через 20 — 30 мин. измеряют оптическую плотность растворов в кювете 10 мм при длине волны 750 нм против контрольного раствора.

По полученным данным строят градуировочную кривую, откладывая по оси абсцисс массовую концентрацию галловой кислоты, а по оси ординат — оптическую плотность.

Выполнение измерений

БАД на растительной и фруктовой основе (таблетки, капсулы) растирают в ступке, навеску 1 — 2 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, заполненную до половины дистиллированной водой, нагретой до 40 °С, и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 45 — 60 мин., периодически подогревая колбу.

Сокосодержащие БАД (растворы, сиропы) разбавляют в 5 — 10 раз дистиллированной водой.

1 куб. см полученных растворов помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см и далее выполняют действия как в разделе «Построение градуировочной кривой».

Вычисление результатов определения

Значение массовой концентрации фенольных веществ (С) в мг/куб. дм по галловой кислоте определяют по градуировочной кривой. Полученную величину умножают на коэффициент разведения — 100, если экстракт разбавляли в 5 раз, или вычисляют по формуле:

где:

А — коэффициент разбавления;

ОП — оптическая плотность.

Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Характеристика погрешности измерений

Допустимое значение погрешности измерений массовой концентрации фенольных соединений в БАД на растительной основе или сокосодержащих БАД не должно превышать:

для диапазона концентраций в экстракте или растворе 100 — 600 мг/куб. дм — +/- 8 мг/куб. дм;

для диапазона концентраций в экстракте или растворе 600 — 3000 мг/куб. дм — +/- 33 мг/куб. дм.

10. Определение флавоноидов

10.1. Введение

Флавоноиды представляют собой большую группу природных полифенольных соединений с двумя ароматическими кольцами, имеющими основную структуру С6 — С3 — С6. Флавоноиды являются мощными природными антиоксидантами, обладающими широким спектром биологической активности. Особенно богаты флавоноидами высшие растения, относящиеся к семействам розоцветных (различные виды боярышников, черноплодная рябина), бобовых (софора японская, стальник полевой, солодка), гречишных (различные виды горцев — перечный, почечуйный, птичий; гречиха), астровых (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма), яснотковых (пустырник сердечный) и др.

В основе структуры большинства флавоноидов лежат производные флавана (2-фенил-хроман или 2-фенил-бенз-гамма-пиран), приведенного на рис. 7, которые, в свою очередь, разделяются на производные хромана и хромона.

К производным хромана относятся катехины, лейкоантоцианидины и антоцианидины.

Катехины. Основные структуры катехинов (флаван-3-олов) приведены на рис. 8.

Лейкоантоцианидины. Как видно из приведенной структуры на рис. 9, лейкоантоцианидины или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы) представляют собой 4-гидроксипроизводное катехина.

Антоцианидины. Особенность строения антоцианидинов (рис. 10) в том, что кислород в пирановом кольце в кислой среде образует оксониевый катион. Поэтому антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, а в щелочном растворе — как анионы и образуют соли с основаниями. Антоцианидины являются интенсивно окрашенными природными пигментами, их окраска изменяется в зависимости от pH среды. Оксониевые формы (соли катионов) антоцианидинов окрашены в красный цвет с оттенками: желтоватыми (пеларгонидин), фиолетовым (цианидин), синеватым (дельфинидин). Щелочные соли окрашены в синий цвет.

Антоцианидины являются агликонами большого класса природных красителей — антоцианинов (см. раздел 1).

Среди других представителей этой группы следует отметить 2-фенилпроизводные хромана: флаваноны и флаванонолы, структуры которых представлены на рис. 11.

К флаванонам относятся нарингенин — 5,7,4′-тригидроксифлаванон, гесперетин — 5,7,3′-тригидрокси-4′-метоксифлаванон и эриодиктиол — 5,7,3′,4′-тетрагидроксифлаванон. Наиболее распространенными в экстрактах цитрусовых являются 7-О-гликозил-нарингенин — нарингин и 7-О-гликозилгесперетин — геспередин (см. раздел 11.2).

В БАД на основе экстрактов лиственницы и ряда других растений содержатся производные флаванон-3-олов: дигидрокверцетин — 5,7,3′,4′-тетрагидроксифлаванон-3-ол и дигидрокемпферол — 5,7,4′-тригидроксифлаванон-3-ол (см. раздел 11.3).

Из производных хромона, представленных на рис. 12, наиболее распространены в растениях соединения типа флавона и флавонола, имеющих непредельную связь в положении 2, 3. В отличие от их гидрированных аналогов — флаванонов и флаванонолов — это наиболее устойчивые флавоноиды.

Флавоноиды, у которых фенильная группа с С2 смещена к С3, называются изофлавоноидами (рис. 13).

Структуры и наименования основных флавонолов представлены на рис. 14, структуры флавонов — на рис. 15.

10.2. Методы определения флавоноидов

В основе количественного определения флавоноидов лежит спектрофотометрия при длине волны 415 нм продуктов взаимодействия с раствором хлорида алюминия. К флавоноидам относятся производные флавона: флавонолы (рутин — рутинозид кверцетина, гиперозид — галактозид кверцетина, морин, кверцетин, мирицетин, кемпферол, кверцитрин, галангин) и флавоны (хризин, апигенин, лютеолин, изовитексин, изоориентин). Для определения производных флавана: флаванон-3-олов (дигидрокверцетин или таксифолин, дигидрокемферол, силибин), флаванонов (нарингин, (+/-)-нарингенин, гесперетин) используется спектрофотометрия при длине волны 495 нм продуктов их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Принцип колориметрического метода, основанного на взаимодействии с алюминий хлоридом, заключается в том, что реагент образует кислотоустойчивые комплексы с С-4 кето группой и или с С-3, или С-5 гидроксильной группой флавонов и флавонолов, имеющие максимумы поглощения в диапазоне длин волн 415 — 440 нм.

Принцип взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином основан на его реакции с кетонами и альдегидами с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Следовательно, флавоны, флавонолы и изофлавоны с С2 — С3 двойной связью не способны реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином, в то время как гидразоны и флавононы образуют соединения, имеющие максимум поглощения при 495 нм.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный (Shimadzu UV-160A, Япония), позволяющий проводить измерения при длинах волн 190 — 900 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Метанол — яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Спирт этиловый ректификованный, очищенный дистилляцией.

Алюминий хлористый, 6-водный, х.ч., ГОСТ 3759-75, раствор 10%-ный в 95%-ном этаноле.

2,4-динитрофенилгидразин (2,4-Д), раствор: 1 г 2,4-Д растворяют в 2 куб. см 96%-ной серной кислоты и доводят метанолом до объема 100 куб. см, концентрация полученного раствора 10 мг/куб. см.

Натрия гидроокись, х.ч.: 1%-ный раствор в 70%-ном метаноле.

Натрия ацетат, 1 М раствор.

Приготовление стандартных растворов для калибровки спектрофотометра

10 +/- 0,1 мг кверцетина растворяют в 80%-ном этаноле и затем разбавляют в мерных колбах до концентраций 25, 50 и 100 мкг/куб. см.

20 +/- 0,1 мг (+/-)-нарингенина растворяют в метаноле и затем разбавляют до концентрации 500, 1000 и 2000 мкг/куб. см.

Подготовка образца

1,0 г измельченного образца кипятят в 30 куб. см 90%-ного этилового спирта, содержащего 0,5% концентрированной серной кислоты, на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и экстракцию повторяют еще раз. Объединенную смесь охлаждают, фильтруют и доводят объем до 100 куб. см 90%-ным этанолом (раствор А).

Колориметрический метод с алюминий хлоридом (суммарное определение флавонолов)

По 0,5 куб. см каждого разбавленного стандарта кверцетина смешивают с 1,5 куб. см 95%-ного этанола, 0,1 куб. см 10%-ного хлорида алюминия, 0,1 куб. см 1 М ацетата натрия и 2,8 куб. см дистиллированной воды. Смесь инкубируют при комнатной температуре 30 мин. и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 415 нм. Для приготовления раствора сравнения используют разбавленный в дистиллированной воде 10%-ный хлорид алюминия.

Колориметрический метод с 2,4-динитрофенилгидразином (суммарное определение флаванонов)

По 1,0 куб. см каждого разбавленного стандартного раствора (+/-)-нарингенина смешивают с 2,0 куб. см 1%-ного раствора 2,4-Д и 2,0 куб. см метанола. Смесь выдерживают при 50 °С в течение 50 мин. После охлаждения до комнатной температуры к смеси добавляют 5 куб. см 1%-ного раствора едкого натра в 70%-ном метаноле и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-х минут. Затем к 1 куб. см смеси добавляют 5 куб. см метанола и центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 10 мин. Отделяют супернатант и в мерной колбе доводят до объема 25 куб. см. Измеряют оптическую плотность раствора при 495 нм против раствора сравнения — метанола.

Проведение испытаний

Отбирают по 0,5 куб. см гидролизата (раствор А) и проводят колориметрические реакции с хлоридом алюминия и 2,4-Д, как описано выше. Определяют содержание флавоноидов согласно калибровочным графикам.

11. Анализ индикаторных показателей некоторых БАД на растительной основе

11.1. Определение катехинов и галловой кислоты в БАД на основе зеленого чая и в травяных чаях

Катехины — это флаван-3-олы, структура которых представлена на рис. 8.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 15 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552, раствор 0,1%: 1,2 куб. см фосфорной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, добавляют около 950 куб. см дистиллированной воды, перемешивают, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки и перемешивают.

Метанол — яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Спирт этиловый ректификованный, очищенный дистилляцией.

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

(+)-катехин, (+)-эпикатехин, (-)-эпигаллокатехин, (-)-эпигаллокатехин галлат, галловая кислота — SIGMA Chemical Co.

Приготовление стандартного раствора

5 +/- 0,1 мг (+)-катехина, предварительно высушенного при 105 °С в течение 1 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют около 70 куб. см 0,1%-ного раствора фосфорной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного стандартного раствора катехина 0,05 мг/куб. см. 5 куб. см полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного рабочего стандартного раствора катехина 0,005 мг/куб. см. В хроматограф вводят 10 мкл.

Подготовка образца

1 г порошка экстракта листьев, 2 г измельченных листьев, таблеток или содержимого капсул помещают в химический стакан вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см 0,1%-ного раствора фосфорной кислоты и проводят экстракцию в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 250 куб. см или при необходимости центрифугируют при 3000 об./мин. 5 мин., а затем супернатант помещают в мерную колбу на 250 куб. см, доводят до метки 0,1%-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают (раствор А). Раствор анализируют с помощью ВЭЖХ.

Проведение анализа ВЭЖХ

Условия хроматографического анализа: колонка Hypersil ODS, размер колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза: ацетонитрил — 85%-ная фосфорная кислота (15:85), скорость подвижной фазы 1,0 куб. см/мин., объем петли инжектора 20 куб. мм. УФ-детектор, длина волны 280 нм. Времена удерживания: галловая кислота — 2,9 +/- 0,1 мин., эпигаллокатехин — 4,5 +/- 0,1 мин., катехин — 5,8 +/- 0,2 мин., эпикатехин — 6,8 +/- 0,2 мин., эпигаллокатехин галлат — 9,8 +/- 0,2 мин., галлокатехин галлат — 12,0 +/- 0,1 мин., эпикатехин галлат — 13,5 +/- 0,1 мин., катехин галлат — 15,5 +/- 0,1 мин.

Количественный расчет

При количественном анализе используют метод абсолютной калибровки.

Количественный расчет каждого катехина в пересчете на катехин проводят по формуле:

где:

— площадь пика исследуемого компонента;

— площадь пика стандарта катехина;

— объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;

— объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;

— масса стандарта катехина, введенная в хроматограф, мг;

— навеска образца, взятая для анализа, мг;

К — коэффициент пересчета содержания индивидуального катехина относительно катехина — согласно нижеприведенной таблице:

Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям пиков не менее двух параллельных измерений катехина, не должно превышать 0,4%.

11.2. Определение флаванонов в БАД на фруктовой основе

Гесперидин, нарингенин относятся к разряду флаванглюкозидов, широко представленных во фруктах, особенно в кожуре зеленых апельсинов. При отжатии сока под высоким давлением флаваноны переходят в сок.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 15 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Кислота серная, х.ч.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Гесперидин, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 0,02 мг/куб. см.

Нарингенин, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 0,02 мг/куб. см.

Подготовка образца

1 г измельченных таблеток или содержимого капсул помещают в плоскодонную колбу, добавляют 40 куб. см 50% этилового спирта, смесь нагревают на водяной бане при 55 — 60 °С в течение 30 мин. Экстракцию повторяют пятикратно. Спиртовые экстракты охлаждают, фильтруют, доводят объем до 250 куб. см 50%-ным этиловым спиртом.

Проведение анализа

Условия хроматографического разделения: колонка ODS — Hypersil (HP 799160D-552), размеры колонки 100 х 2,1 мм, размер частиц 5 мкм, объем петли инжектора 20 куб. мм. Подвижная фаза: раствор серной кислоты, pH 2,5, — ацетонитрил (85:15), скорость потока 0,5 куб. см/мин., УФ-детектор, длина волны 280 нм. Ориентировочные времена удерживания нагингенина — 4,8 +/- 0,1 мин., гисперидина — 6,0 +/- 0,1 мин.

При количественном анализе используют метод абсолютной калибровки. Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям пиков не менее двух параллельных измерений стандартов гесперидина и нарингенина, не должно превышать 0,4%.

11.3. Определение флаванонолов в БАД из экстрактов лиственницы

К флаванонолам относятся дигидрокверцетин, дигидрокемпферол, эриодиктиол.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 15 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

ГСО дигидрокверцетина ВФС 42-2399-94.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Кислота уксусная ледяная, х.ч., ГОСТ 6709-72, раствор 2%.

Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118.

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Цинк гранулированный, ч.

Приготовление стандартного раствора

0,05 +/- 0,0001 г дигидрокверцетина, предварительно высушенного при 105 °С в течение 1 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, заполненную до половины ацетонитрилом, перемешивают до полного растворения образца, доводят до метки ацетонитрилом и тщательно перемешивают. 1 куб. см полученного раствора концентрацией 0,5 мг/куб. см переносят в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, доводят ацетонитрилом до метки и тщательно перемешивают. Концентрация рабочего стандартного раствора дигидрокверцетина 0,02 мг/куб. см. В хроматограф вводят 10 мкл.

Подготовка образца

1 г измельченных таблеток или содержимого капсул помещают в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см подвижной фазы ацетонитрил — 2%-ная уксусная кислота (30:70), встряхивают 30 мин., доводят подвижной фазой до метки и тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через капроновый фильтр или центрифугируют при 3000 об./мин. 5 мин. Раствор используют для проведения качественной реакции на флаванонолы (дигидрокверцетин) или анализируют с помощью ВЭЖХ.

Проведение качественной реакции

1 г измельченного образца встряхивают с 50 куб. см спирта 96%-ного, раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», к 1 куб. см фильтрата добавляют 0,5 куб. см концентрированной соляной кислоты и 0,05 г цинка гранулированного. О наличии в растворе флаванонолов свидетельствует малиновое окрашивание.

Проведение анализа ВЭЖХ

Условия хроматографического анализа: колонка Hypersil ODS, размер колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, подвижная фаза ацетонитрил — 2%-ная уксусная кислота (30:70), скорость подвижной фазы 1,0 куб. см/мин., объем петли инжектора 20 куб. мм. УФ-детектор, длина волны 287 нм. Времена удерживания флаванонолов: дигидрокверцетин — 5,0 +/- 0,1 мин., дигидрокемпферол — 6,5 +/- 0,1 мин., эриодиктиол — 7,5 +/- 0,1 мин.

При количественном анализе используют метод абсолютной калибровки. Относительное стандартное отклонение, вычисленное по площадям пиков не менее двух параллельных измерений дигидрокверцетина, не должно превышать 0,4%.

11.4. Определение изофлавонов в БАД

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации изофлавонов в соесодержащих продуктах и БАД основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). К изофлавонам относятся даидзеин, генистеин и глицитеин и их гликозиды даидзин, генистин, глицитин, структура которых указана на рис. 13.

Средства измерений, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 15 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Ультразвуковая баня.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Метанол — яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Бумага фильтровальная «красная лента» и «синяя лента» по ТУ 6-09-1678-95.

Фильтры капроновые марки 0,45 мкм RC или целлюлозные.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ.

Вода деионизированная.

Кислота о-фосфорная, ч., ГОСТ 6552.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочих растворов изофлавонов

Навеску изофлавона (генистеин) массой 10,0 +/- 0,1 мг помещают в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, до половины заполненную 70%-ным метанолом, перемешивают до полного растворения вещества, доводят 70%-ным метанолом до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор с массовой концентрацией генистеина 0,4 мг/куб. см.

Подготовка образца

Содержимое капсул или растертых таблеток БАД или 1,0 г измельченного образца помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см, прибавляют около 50 куб. см 70%-ного метанола, экстрагируют с помощью ультразвука в течение 10 минут и встряхивают 20 минут на аппарате для встряхивания. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость фильтруют через целлюлозный или капроновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Объем экстракта доводят 70%-ным метанолом до метки и тщательно перемешивают.

Проведение анализа

Условия ВЭЖХ. Колонка с сорбентом Kromasil 100 С18 или аналогичная, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: градиент 0,1% фосфорной кислоты — ацетонитрил от (90:10) до (65:35) за 40 мин., скорость потока 0,8 куб. см/мин., температура колонки 25 °С. Детектор спектрофотометрический, длина волны УФ 255 нм, шкала 0,01 AUFS. Параметры разделения изофлавонов: даидзин — 9,5 +/- 0,5, глицитин — 10,5 +/-0,5, генистин — 14,5 +/- 0,5, даидзеин 23,5 — +/-0,5 мин., глицитеин — 24,5 +/- 0,5 и генистеин — 31,5 +/- 0,5 мин.

Расчет концентраций изофлавонов

Массовую концентрацию каждого изофлавона относительно стандарта генистеина рассчитывают по формуле:

где:

— площадь пика исследуемого компонента;

— площадь пика стандарта генистеина;

— объем анализируемого раствора пробы, куб. мм;

— объем экстракта, введенного в хроматограф, куб. мм;

— масса стандарта генистеина, введенная в хроматограф, мг;

— навеска образца, взятая для анализа, мг;

К — коэффициент пересчета содержания индивидуального изофлавона относительно генистеина — согласно нижеприведенной таблице:

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 10%.

11.5. Определение гиперозида и рутина в БАД, содержащих боярышник (Crataegus Monoguna)

Приборы и реактивы

Высокоэффективный жидкостной хроматограф с колонкой ODS (Nucleosil) 250 х 4,6 мм, предколонкой ODS 20 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, объем петли инжектора 20 мкл, фотометрический детектор, длина волны 590 нм.

Пластины для ТСХ «Silufol».

Облучатель ультрафиолетовый.

Спектрофотометр.

Реактив Neu: а) смесь аминоэтанол дифенилбората, 1%-ный раствор в метаноле, и полиэтиленгликоль 400R, 5%-ный раствор в метаноле; б) алюминий хлористый, 5%-ный раствор в спирте.

Кислота уксусная ледяная.

Кислота муравьиная безводная.

Этилацетат.

Стандартные растворы

Гиперозид, раствор в метаноле концентрацией 0,5 мг/куб. см.

Гиперозид, раствор в 96%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/куб. см.

Витексин-2-рамнозид, раствор в метаноле концентрацией 0,02 мг/куб. см.

Рутин, раствор 0,05%-ный в метаноле.

Подготовка образца

1) 1,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 куб. см метанола, смесь перемешивают в течение 15 мин. Раствор фильтруют.

2) 0,5 г измельченного продукта кипятят в течение 15 мин. в 5 куб. см 95%-ного этилового спирта, экстракт фильтруют (для качественного анализа).

3) 2 г измельченного продукта нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 ч в 100 куб. см 95%-ного этилового спирта, после охлаждения доводят объем до первоначального, экстракт фильтруют, 50 куб. см фильтрата упаривают до 2 — 3 куб. см, переносят в мерную колбу на 10 куб. см, доводят объем до 10 куб. см 96%-ным этиловым спиртом, перемешивают и дают осесть образовавшемуся аморфному осадку.

4) На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20 — 25 мм, микрошприцем или стеклянным капилляром наносят в виде полосы 80 мкл экстракта и 80 мкл контрольного раствора ГСО гиперозида. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и проводят разделение в системе хлороформ — метиловый спирт (8:2). Когда фронт растворителя дойдет до края пластинки, ее высушивают в течение 2 мин. и вторично хроматографируют в той же системе. Высушивают и просматривают в УФ-свете при 360 нм. Отмечают пятна гиперозида в образце и стандарте. Элюируют вещество со слоя сорбента 10 куб. см смеси диоксан — вода (1:1) (раствор А).

Идентификация тестового соединения

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20 — 25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 20 мкл анализируемого экстракта и 5 мкл контрольного раствора. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в системе ледяная уксусная кислота — муравьиная кислота безводная — метилэтилкетон — этилацетат (10:10:30:50). Дают фронту растворителя подняться на 10 — 15 см, затем пластину высушивают, после испарения растворителя помещают на 2 мин. под струю горячего воздуха и опрыскивают реактивом Neu. В длинноволновом УФ-свете (длина волны 365 нм) гиперозид обнаруживают по полосе с желтой флуоресценцией и Rf 0,5, 2,2-рамнозил витексина — по зеленоватой и Rf 0,25, хлорогеновую кислоту — по белой и Rf 0,4 и изохлорогеновую кислоту — по голубой флуоресценции и Rf 0,7.

В системе хлороформ — метанол (8:2) на уровне гиперозида в УФ-свете 360 нм наблюдают пятно темно-коричневого цвета. При обработке пластинки 5% спиртовым раствором АlСl3 и последующем нагревании при 100 — 105 °С 2 — 3 мин. пятно приобретает ярко-желтую окраску при дневном свете и желто-зеленую флуоресценцию в УФ-свете 360 нм.

Количественное определение тестовых соединений

Содержание гиперозида

Измеряют оптическую плотность исследуемого раствора А при 365 нм, против раствора сравнения — контрольный опыт (экстракт полосы сорбента). Калибровку проводят по раствору стандарта ГСО гиперозида.

Содержание витексин-2-рамнозида и гиперозида

0,5 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 50 куб. см метанола, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема. Остаток растворяют в 25 куб. см метанола, а затем разбавляют подвижной фазой в соотношении 1:5 и анализируют с помощью ВЭЖХ.

Условия хроматографического разделения: колонка ODS (Nucleosil), 250 х 4,6 мм, предколонка ODS, 20 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, объем петли инжектора 20 мкл, УФ-детектор, длина волны 590 нм, подвижная фаза:

А: вода — тетрагидрофуран — этанол — фосфорная кислота (90:10:5:1);

В: вода — тетрагидрофуран — пропанол-2 — фосфорная кислота (20:80:5:1).

Градиент элюирования: А -> В 0:100 за 45 мин., скорость потока 1 куб. см/мин.

Ориентировочные времена удерживания:

витексин-2-рамнозида — 22,59 мин., гиперозида — 31,90 мин.

Записывают хроматограммы стандартного образца и экстракта. Отмечают пик, совпадающий по времени удерживания с соответствующим стандартом, и по площадям пиков рассчитывают содержание в продукте.

11.6. Определение флавонолгликозидов в БАД на основе экстракта Ginkgo biloba

Согласно фармакопее США экстракт листьев Ginkgo biloba должен содержать не менее чем 22,0% и не более чем 27,0% флавоноловых гликозидов (рис. 14). В стандартизованных экстрактах Ginkgo biloba содержание кверцетина, кемпферола и изорамнетина колеблется около 9,5%, 10,5% и 2,0% соответственно. Такое качественное и количественное соотношение флавонолгликозидов уникально для высших растений и может служить специфическим индикаторным показателем качества препаратов гинкго.

В качестве метода анализа используется высокоэффективная обращеннофазная жидкостная хроматография.

Подготовка проб для анализа

Содержимое капсул или растертые таблетки, содержащие около 0,3 г сухого экстракта или 1,0 г порошка листьев гинкго, помещают в круглодонную колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 80 куб. см смеси метанол — вода — соляная кислота (60:20:8). Экстракцию проводят на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 — 1,5 ч. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость фильтруют через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу объемом 100 куб. см. Объем экстракта доводят дистиллированной водой до 100 куб. см.

Приготовление рабочих стандартных растворов

Точные навески 1 мг стандартных образцов кверцетина, кемпферола и изорамнетина переносят в мерные колбы, встряхивают с метанолом до полного растворения, доводят объем растворителя до метки и тщательно перемешивают.

Проведение анализа

Колонка: Kromosil С18, 5 мкм, 250 мм x 4,6 мм ID.

Подвижная фаза: метанол — ортофосфорная кислота, pH 2,6 (53:47), скорость потока 1,2 куб. см/мин.

Детектирование: UV, 370 нм.

Объем вводимой пробы 5 — 20 мкл.

Параметры разделения кверцетина, кемпферола и изорамнетина в табл. 37.

Таблица 37

Таблица 38

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛГЛИКОЗИДОВ

Для определения содержания флавонолгликозидов найденные концентрации кверцетина умножают на коэффициент 2,5, кемпферола — на 2,05, изорамнетина — на 2,4.

11.7. Определение флавоноидов в БАД, содержащих солодку (Radix Glicyrrisae)

Солодка содержит тритерпеноидные сапонины (4 — 24%), главным образом глицирризин, смесь натриевой и кальциевой солей глицирризиновой кислоты; флавоноиды (1%), в основном флаваноны, ликвиритин и ликвиритигенин, халконы — изоликвиритин, изоликвиритигенин и изофлавоноиды (формононетин).

Анализ основан на определении глицерризиновой кислоты и тестовых соединений с помощью ТСХ и ВЭЖХ.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный (Shimadzu UV-160A, Япония), позволяющий проводить измерения при длинах волн 190 — 900 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Пластины «Silufol».

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 15 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спирт этиловый ректификованный.

Метанол — яд, для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85.

Бумага фильтровальная «красная лента» и «синяя лента» по ТУ 6-09-1678-95.

Ликуразид, раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/куб. см.

Глицирризиновая кислота, аммониевая или натриевая соль: раствор в 50%-ном этиловом спирте концентрацией 1 мг/куб. см.

Подготовка образца

1 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, добавляют 50 куб. см 50%-ного этилового спирта, смесь нагревают на водяной бане при 55 — 60 °С в течение 30 мин. Экстракцию повторяют пятикратно. Спиртовые экстракты охлаждают, фильтруют, доводят объем до 250 куб. см 50%-ным этиловым спиртом.

Идентификация тестовых соединений ТСХ

На стартовую линию пластины Silufol, УФ 254 (20 х 20 мм), отстоящую от края пластины на 20 — 25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта и по 5 мкл растворов стандартов: ГСО ликуразида, глицирризиновой кислоты. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси хлороформ — метанол — вода, взятых в объемном соотношении 61:32:7. Дают фронту растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку рассматривают в видимом и УФ-свете при длинах волн 254 и 360 нм: наблюдают желтые (видимый свет) или темно-фиолетовые (УФ-свет) пятна с Rf 0,9 — изоликвиритигенин, Rf 0,5 — изоликвиритин, Rf 0,4 — ликуразид. Только в УФ-свете проявляются синим цветом пятна: глицирризиновой кислоты — Rf 0,1, ликвиритигенин — Rf 0,8, ононин — Rf 0,6, ликвиритин — Rf 0,5. При опрыскивании пластины диазореагентом все вещества, кроме ононина, проявляются в виде желтых или оранжевых пятен.

Количественное определение ВЭЖХ

Условия хроматографического разделения: колонка Zorbax ODS, 5 мкм, 250 х 4,6 мм, предколонка ODS, 5 мкм, 20 х 4,6 мм, объем петли инжектора 20 мкл. Подвижная фаза: градиент метанол — 1,5% уксусная кислота от (20:80) до (40:60) за 60 мин., скорость потока 1 куб. см/мин., температура колонки 45 °С. УФ-детектор, длины волн: 275 нм для обнаружения ликвиритина и 375 нм для обнаружения ликуразида. Время выхода 10 и 25 мин. соответственно.

11.8. Определение флавоновых гликозидов в БАД, содержащих страстоцвет (Passiflora incarnata L)

Приборы и реактивы

Пластины для ТСХ с силикагелем («Silufol», «Sorbfil»).

Реактив Neu: а) смесь 1%-ного раствора дифенилбората аминоэтанола в метаноле и 5%-ного раствора полиэтиленгликоля — 400R (PEG-400R) в метаноле; б) 2%-ный раствор хлорида алюминия в метаноле.

Стандартные растворы в метаноле витексина, изовитексина, сапонарина концентрацией 0,5 — 1,0 мг/куб. см.

Подготовка образца

К 1 г порошка БАД добавляют 10 куб. см метанола, нагревают с обратным холодильником и при перемешивании на водяной бане при 60 °С в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через сульфат натрия и упаривают до 1 куб. см.

К 20 г порошка БАД добавляют 200 куб. см этилового спирта, кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 ч, фильтруют и упаривают досуха. Остаток растворяют при перемешивании в 0,5%-ной серной кислоте в течение 15 мин., раствор фильтруют, фильтрат подщелачивают 20%-ным KOH до pH 9 и экстрагируют хлористым метиленом (3 х 50 куб. см). Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 1 куб. см метанола.

Идентификация тестового соединения

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края на 20 — 25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм по 20 мкл экстракта и эталонного раствора витексина, изовитексина или сапонарина. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в системе растворителей безводная муравьиная кислота — вода — этилацетат — метилэтилкетон (10:20:50:30). Дают фронту растворителя подняться на 12 см, пластинку высушивают и опрыскивают проявляющим реагентом. На хроматограмме в УФ-свете (365 нм) флавоновые гликозиды проявляются в виде зеленых пятен: изовитексин с Rf 0,5, витексин с Rf 0,65, сапонарин с Rf 0,15.

Количественное определение суммы флавоновых гликозидов

Количественное определение суммы флавоновых гликозидов проводят с помощью метода спектрофотометрии согласно разделу 10.

12. Определение содержания гинзенозидов в БАД, содержащих женьшень

В настоящее время корни культивируемого и дикорастущего многолетнего травянистого растения женьшеня (Раnах ginseng С.А. Меу, сем. аралиевых — Araliaceae) и его экстракты используются в качестве добавок при изготовлении ряда пищевых продуктов, а также входят в состав биологически активных добавок к пище. Его биологическая активность связывается, в основном, с соединениями группы тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов). Основными гинзенозидами женьшеня являются: Re, Rg1, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd — остальные присутствуют в минорных концентрациях. Для стандартизации корня женьшеня и его препаратов обычно определяют содержание шести гинзенозидов — Re, Rg1, Rb1, Rc, Rb2, Rd. В настоящее время стандартные образцы существуют только для Re, Rb1 и Rc (рис. 17).

В качестве метода анализа используется высокоэффективная обращеннофазная жидкостная хроматография. Предел обнаружения содержания гинзенозидов Rb1, Rc, Re составляет 0,001 мг/куб. см. Отклик детектора линеен в диапазоне концентраций гинзенозидов от 0,001 до 1,00 мг/куб. см.

Подготовка проб для анализа

Напитки и биологически активные добавки к пище в жидком виде

10 куб. см напитка с женьшенем наносят на патрон Диапак С18, предварительно активированный 10 куб. см метилового спирта и 20 куб. см дистиллированной воды. Патрон промывают 20 куб. см дистиллированной воды. Гинзенозиды смывают 10 куб. см метилового спирта в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор отгоняют досуха на роторном испарителе при температуре не более 50 °С. Сухой остаток в колбе растворяют в 1 куб. см метилового спирта. 200 мкл полученного раствора помещают поверх мембранного фильтра в патрон набора для микрофильтрации образцов на 1,0 куб. см (НПФ «БИОХРОМ», Москва, Россия) и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс «MINIGEN» (фирма «Диа-М», Москва, Россия) или Опн-8 при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

Биологически активные добавки к пище в сухом виде

Определение содержания суммы гинзенозидов Rb1, Re, Rc

0,005 г (точная навеска) препарата помещают поверх мембранного фильтра в патрон набора для микрофильтрации образцов на 1,0 куб. см. Добавляют 400 мкл гексана и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс «MINIGEN» при 3000 об./мин. в течение 3 мин. Промывку гексаном повторяют трижды. Затем патрон для образцов сушат под вакуумом до удаления запаха гексана. Фильтр с образцом количественно переносят в герметически закрывающуюся пробирку вместимостью 5 куб. см и добавляют 2 куб. см дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортекс «MINIGEN» или аналогичной в течение 1 мин. 1 куб. см раствора помещают в микропробирку из полипропилена объемом 1,5 куб. см и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс «MINIGEN» или Опн-8 при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

Мед

10 +/- 0,01 г меда с женьшенем помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см и растворяют в 50 куб. см воды дистиллированной. 40 куб. см полученного раствора наносят на патрон Диапак С18, предварительно активированный 10 куб. см метилового спирта и 20 куб. см дистиллированной воды. Далее проводят те же операции, которые были описаны выше для напитков и биологически активных добавок к пище в жидком виде.

Приготовление рабочих стандартных растворов

Для приготовления раствора РСО гинзенозида Rb1 (Rc или Re) в фирменный флакон с РСО соответствующего гинзенозида (Sigma, кат. N G-0777, G-0902 и G-1027) прибавляют 5 куб. см метилового спирта и перемешивают до растворения. Срок годности раствора РСО при хранении его при температуре не выше 4 °С — 1 мес.

Проведение анализа

Колонка: Кромасил 100 С18 (Kromasil), 7 мкм, 150 х 4 мм ID.

Элюент: ацетонитрил — 0,05% ортофосфорная кислота (30:70), 1,0 куб. см/мин.

Детектирование: UV, 203 нм.

Таблица 39

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИНЗЕНОЗИДОВ Rb1, Rc, Re В КОРНЯХ ЖЕНЬШЕНЯ

13. Определение содержания схизандрина в БАД, содержащих лимонник китайский (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill)

Метод основан на определении схизандрина с помощью метода ВЭЖХ.

Температура плавления схизандрина 133 °С; + 78° (с 1,0; хлороформ); склонен удерживать кристаллизационную воду даже при нагревании в вакууме. В УФ-спектре максимумы длин волн в диапазонах 221 — 224 нм и 249 — 251 нм.

Подготовка проб для анализа

Напитки и биологически активные добавки к пище в жидком виде, содержащие лимонник, его экстракты, настои и настойки

1 куб. см пробы переносят в пробирку для микропроб однократного применения объемом 1,5 куб. см и центрифугируют на микроцентрифуге-вортекс «MINIGEN» (фирма «Диа-М», Москва, Россия) или на центрифуге медицинской лабораторной ОПн-8 при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Если при анализе пик схизандрина не обнаружен, то раствор предварительно центрифугируют и супернатант упаривают досуха на роторном испарителе. Остаток растворяют в 1 — 3 куб. см 30% этилового спирта.

Биологически активные добавки к пище в сухом виде, содержащие лимонник, его экстракты, настои и настойки

Навеску 0,5 г +/- 0,001 биологически активной добавки к пище помещают в коническую колбу вместимостью 25 куб. см и приливают 5 куб. см 30% этилового спирта. Содержимое колбы перемешивают в течение 5 мин. 1 куб. см раствора переносят в пробирку для микропроб однократного применения объемом 1,5 куб. см и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

Мед, содержащий лимонник, его экстракты, настои и настойки

Навеску 10 +/- 0,01 г меда растворяют в 25 куб. см дистиллированной воды при нагревании. Концентрирующий патрон Диапак С16 активируют 10 куб. см спирта и отмывают 10 куб. см воды. 20 куб. см водного раствора образца наносят на патрон концентрирующий Диапак С16 порциями по 10 куб. см, после каждой порции патрон промывают 20 куб. см воды. Вещества элюируют с патрона 10 куб. см спирта и помещают в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе. В колбу приливают 2 куб. см спирта и растворяют сухой остаток. 1 куб. см раствора помещают в пробирку для микропроб однократного применения объемом 1,5 куб. см и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

Приготовление рабочих стандартных растворов

5 +/- 0,1 мг стандартного образца схизандрина переносят в мерную колбу на 10 куб. см, растворяют в небольшом количестве метанола и затем доводят до метки метанолом. Получают раствор РСО с концентрацией 0,5 мг/куб. см. Раствор РСО хранят в темном месте в холодильнике в посуде с пришлифованной пробкой не более 3 мес. В хроматограф вводят 5 — 10 мкл раствора образца.

Проведение анализа

Предколонка: мини-картридж Элсикарт, 8 x 4 мм, Диасорб 130 С16Т.

Колонка: Диасорб 130 С16Т, 11 мкм, 250 х 4 мм ID.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (50:50), 1,0 куб. см/мин.

Детектирование: UV, 216 нм.

Время удерживания схизандрина составляет около 12 мин.

Таблица 40

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СХИЗАНДРИНА В ПЛОДАХ, СЕМЕНАХ И ЛИАНАХ ЛИМОННИКА

14. Определение содержания элеутерозида В (сирингина) в БАД, содержащих элеутерококк колючий

Компонентами элеутерококка являются стероиды (даукостерин), фенилпропаноиды с замещенными фенольными группами (сирингин), лигнаны (элеутерозид D), оксикумарины (7-О-бета-D-глюкозилизофраксидин), алканы (этил-альфа-D-галактозид или элеутерозид С), а также негликозилированные соединения различных классов: фенилпропаноиды со свободными фенольными гидроксилами (хлорогеновая кислота, конифериловый альдегид, этиловый эфир кофейной кислоты, синаповый спирт), лигнаны (сирингарезинол, сезамин), тритерпеноиды (олеаноловая кислота), кумарин (изофраксидин), ситостерины (бета-ситостерин, кампестерин), полисахариды и др.

Сирингин мало и медленно растворим в воде и в 95%-ном спирте.

В качестве метода анализа используют высокоэффективную обращеннофазную жидкостную хроматографию. Предел обнаружения элеутерозида В составляет 0,001 мг/куб. см. Диапазон определяемых концентраций от 0,001 до 1,00 мг/куб. см.

Приборы и реактивы

Облучатель ультрафиолетовый.

Пластины для ТСХ «Сорбфил ПТСХ-П-А» 10 х 15 см.

Пластины Silufol.

ВЭЖХ с УФ-детектором.

Приготовление рабочего раствора сирингина (элеутерозида В)

0,01 +/- 0,0005 г сирингина помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, прибавляют 40 куб. см 60% этилового спирта, перемешивают до растворения и доводят объем раствора до метки. Срок хранения рабочего раствора при температуре 5 — 10 °С составляет 1 мес.

Подготовка образца

К 0,2 г препарата (содержание элеутерококка 15%) добавляют 25 куб. см этилового спирта 30% и перемешивают в течение 30 мин. Центрифугируют при 3000 об./мин. 1,5 куб. см экстракта в пробирке для микропроб однократного применения.

0,05 г измельченного сырья обезжиривают 3-кратной экстракцией хлороформом или гексаном, из остатка экстрагируют элеутерозиды метанолом или 95% этанолом (10 куб. см) при нагревании с обратным холодильником при 50 °С в течение 1 ч, раствор фильтруют и доводят объем до первоначального.

Идентификация тестового соединения с помощью метода ТСХ

На пластину для ТСХ полосой наносят 30 мкл экстракта, высушивают при 100 °С в течение 15 мин. Хроматографирование проводят в системе растворителей: этиловый спирт 96% — хлороформ (7:3). Пластину сушат при 100 °С в течение 5 мин. В УФ-свете (360 нм) наблюдают бледно-голубую полоску с Rf 0,64.

Проводят хроматографирование экстракта (п. 3.2) на пластинах Silufol в системе хлороформ — метанол — вода (61:32:7). Проявление пятен производят опрыскиванием пластины 20% серной кислотой.

Проведение ВЭЖХ

Колонка: Диасорб 130 С16Т, 11 мкм, 250 х 4 мм ID, или аналогичная.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — ледяная уксусная кислота (85:15:0,5), 1 куб. см/мин.

Детектирование: UV, 266 нм.

Время удерживания элеутерозида В около 12 мин.

Таблица 41

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЛЕУТЕРОЗИДА В НАПИТКАХ И БАД В СУХОМ ВИДЕ

15. Определение производных кофейной (3,4-дигидроксикоричной) кислоты в БАД на основе экстрактов эхинацеи пурпурной

Идентификация и количественное определение производных кофейной кислоты в препаратах эхинацеи проводятся с помощью метода ВЭЖХ.

Приготовление пробы

1 г измельченной травы, содержимое капсул или растертых таблеток помещают в колбу объемом 200 куб. см, прибавляют 100 куб. см смеси метанол — вода (7:3) и ведут экстракцию при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 10 — 15 мин. Экстракт охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр.

Приготовление рабочего стандартного образца (РСО)

В качестве внутреннего стандарта используют 3-О-метилпроизводное кофейной кислоты — феруловую кислоту V (3-(4′-гидрокси-3′-метоксифенил)-проп-2-еновая кислота) — вещество, близкое по хроматографической подвижности и спектральным свойствам к анализируемым производным кофейной кислоты. Для приготовления РСО с концентрацией 0,1 мг/куб. см в мерную колбу на 50 куб. см вносят навеску 5 мг феруловой кислоты и добавляют до метки метанола. Смесь взбалтывают до полного растворения. Концентрацию РСО проверяют с помощью УФ-спектрофотометрии (длина волны максимума 234 нм (log E 4,10)).

Проведение анализа

Условия ВЭЖХ. К 1 куб. см экстракта добавляют 1 куб. см стандартного раствора феруловой кислоты с концентрацией 0,1 мг/куб. см (100 мкг). Анализ проб проводят с помощью жидкостного хроматографа с УФ-спектрофотометрическим детектором. Колонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, «Нуклеосил С18» (250 x 4,6 мм) или аналогичная. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,05 М NaH2PO4, pH 2,6 (15:85); скорость потока 1,2 куб. см/мин.; детектирование при лямбда = 330 нм; объем вводимой пробы 5 — 20 мкл.

Содержание цикориевой, кафтаровой и хлорогеновой кислот в образце вычисляют по формуле:

где:

С — концентрация внутреннего стандарта в анализируемой пробе, мг/мл;

— площадь пика цикориевой кислоты;

— площадь пика феруловой кислоты;

V — общий объем экстракта, мл;

М — масса навески, мг;

К — коэффициент, учитывающий различие в УФ-поглощении внутреннего стандарта V и анализируемых кислот I — III.

= 1,212 (для цикориевой кислоты);

= 1,548 (для кафтаровой кислоты);

= 1,744 (для хлорогеновой кислоты).

Таблица 42

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 3,4-ДИГИДРОКСИКОРИЧНОЙ КИСЛОТЫ

16. Определение берберина и иохимбина в БАД

Описание берберина

Светло-желтые кристаллы. Растворимость: растворим в воде; легко растворим в спирте; очень легко растворим в горячем спирте и воде; растворим в бензоле, хлороформе, эфире. Алкалоид встречается в корневищах канадского желтокорня (Hydrastis canadensis), а также в растениях сем. лютиковых (Ranunculaceae), барбарисовых (Berberidaceae), лунносемянниковых (Menispermaceae), рутовых (Rutaceae) и др.

Описание берберина гидрохлорида

Из H2O кристаллизуется в виде игл. Растворимость: практически нерастворим в спирте. UV спектр — 228 нм (Е1%-814), 263 нм (Е1%-794), 345 нм (Е1%-722), 421 нм (Е1%-160) (данные по стандарту на гидрохлорид берберина Национального института здравоохранения Японии Eisei Shikenjo Hokoku 1995; 113: 121 — 126) (рис. 23).

Описание иохимбина C21H26O3N2, М — 354,43

Белый или беловатый кристаллический порошок, без запаха, слабогорького вкуса. Кристаллизуется в иглах из разбавленного спирта. Растворимость: трудно растворим в воде, спирте и хлороформе; растворим в эфире. 234 — 235 °С, от 50 °С до 55 °С (С2Н5ОН); 11 °С (СНСl3); 108 °С (пиридин).

Описание иохимбина гидрохлорида

Кристаллизуется в виде орторомбических листочков или призм.

Растворимость: легко растворим в воде; растворим в спирте. 288 — 290 °С (с разл.). 100 °С (с = 1, Н2O).

Подготовка проб для хроматографического анализа

Методика включает предварительную экстракцию алкалоидов из препаратов БАД смесями растворителей, близкими по составу к подвижной фазе при ВЭЖХ. Полноту экстракции алкалоидов оценивали по методике Британской фармакопеи (British Pharmacopoeia, 1990, vol., Арр. ХЗ G, A112).

Для БАД, содержащих порошок коры иохимбе (корневища желтокорня)

0,5 — 1,0 г измельченного содержимого капсул или растертых таблеток помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 25 куб. см с притертой пробкой, прибавляют 5 — 10 куб. см 0,01 N и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 — 15 мин. Водно-кислотный экстракт фильтруют через слой окиси алюминия.

Для БАД, содержащих экстракт коры иохимбе (корневища желтокорня)

0,5 — 1,0 г измельченного содержимого капсул или растертых таблеток помещают в коническую плоскодонную колбу с притертой пробкой, прибавляют 25 куб. см метанола, подкисленного раствором соляной кислоты и оставляют на 1 ч (рассчитать количество 0,01 N HCl для подкисления метанола до pH 2,9). Метанольный раствор фильтруют через слой окиси алюминия.

Приготовление стандартных растворов (РСО)

Для приготовления РСО с концентрацией 50 нг/мкл в мерную колбу на 100 куб. см вносят точные навески по 0,005 г стандартных образцов иохимбина гидрохлорида (берберина гидрохлорида); добавляют по 50 куб. см воды и метанола для хроматографии (ТУ 6-09-4326-76, «ХЧ»), затем взбалтывают до полного растворения. Чистоту РСО проверяют с помощью ВЭЖХ, ТСХ и УФ-спектрофотометрии. Полученные растворы РСО используют как для идентификации компонентов БАД по параметрам удерживания при ВЭЖХ, так и для количественной оценки их содержания в образцах.

Проведение анализа

ТСХ-скрининг

Для ТСХ-скрининга алкалоидов применяют пластинки с силикагелем с УФ 254 нм индикатором («Силуфол», Чехия).

Подвижные фазы

Берберин: этилацетат — изопропанол — уксусная кислота 20% (4:6:1).

Иохимбин: бензол — этилацетат — изопропанол — аммиак (12:6:4:0,5).

В качестве свидетелей применяют растворы стандартных образцов (РСО).

Зоны веществ на хроматограммах детектируют с помощью реактива Драгендорфа по флуоресценции при 366 нм и по гашению флуоресценции индикатора при 254 нм. После разделения пластинки подсушивают и детектируют в УФ-свете при длине волны 360 нм. Чувствительность метода составляет от 1,5 до 0,5 мкг в пятне каждого алкалоида.

Условия ВЭЖХ

Анализ проб проводят с помощью жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором. Колонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, «Нуклеосил С18» (200 x 4,6 мм) или аналогичная.

Подвижная фаза: метанол — вода — 85% о-фосфорная кислота (35:65:0,2, pH 3,0).

Содержание алкалоидов определяют методом абсолютной калибровки по внешнему стандарту. В качестве стандартных образцов используют химически чистые для хроматографии Yohimbine hydrochloride (Y3125 SIGMA), Berberine Chloride (B3251 SIGMA).

Содержание действующего вещества в 1 таблетке/капсуле в миллиграммах (X) в образце вычисляют по формуле:

где:

— площадь пика соответствующего компонента в испытуемом образце;

— площадь пика соответствующего компонента в растворе РСО;

— масса стандарта, мг;

— объем испытуемого раствора, мл;

— объем введенной пробы, мкл.

Пределы обнаружения алкалоидов: в таблетках БАД массой от 0,5 до 2,0 г составляют для иохимбина — 0,1 мг/табл., для берберина — 0,02 мг/табл.

17. Определение стевиозидов в БАД, содержащих стевию (Stevia rebaudiana)

Содержание стевиозида в листьях стевии 10 — 12%, в растениях, выращенных в Средней Азии, до 18%, в Крыму, Украине, Молдавии, Грузии — 5 — 7%. Стевиозид хорошо растворим в воде, спирте, при нагревании неустойчив.

Подготовка образца

Таблетки или содержимое капсулы перетирают в ступке до порошка и экстрагируют трижды 60%-ным этанолом при 50 °C с обратным холодильником в течение 15 мин. на водяной бане. Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. К сухому остатку прибавляют воду, а затем хлороформ. Пробу переносят в делительную воронку и встряхивают. Сливают нижний слой и экстракцию проводят еще два раза. Хлороформ полностью отделяют (если необходимо, пробу центрифугируют), к водному слою прибавляют этанол до конечной его концентрации 50%.

Идентификация и количественное определение стевиозида

ВЭЖХ: колонка из нержавеющей стали, длина 250 мм, диаметр 4,0 мм. Сорбент — сепарон SGX NH2, зернение 7 мкм. Перед работой новую колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (80:20).

Стандартный раствор стевиозида концентрацией 200 мкг/куб. см в 50%-ном этаноле.

Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 208 нм, шкала 0,02 AUFS, скорость потока 1,0 куб. см/мин., время удерживания стевиозида — 12,4 +/- 0,1 мин. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows, версия 1.39.

Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +/- 2%.

18. Определение салидрозидов в БАД, содержащих родиолу розовую (Rhodiola rosae L)

Приборы и реактивы

Пластины для ТСХ «Silufol».

Облучатель ультрафиолетовый.

Спектрофотометр.

Раствор ацетата свинца, 10%. Раствор натрия карбоната, 2%. Насыщенный раствор сульфата натрия.

Диазотированный сульфанил: 7 г сульфацила натрия растворяют в 50 куб. см воды в мерной колбе вместимостью 100 куб. см, добавляют 9 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят раствор до метки. 1 куб. см полученного раствора помещают в колбу вместимостью 100 куб. см, ставят на лед, добавляют 50 куб. см воды, 0,2 куб. см 10% натрия нитрита.

Подготовка образца

1. 1,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 куб. см метанола, смесь нагревают на водяной бане с обратным холодильником при температуре 65 °С и перемешивании в течение 20 мин. Раствор фильтруют.

2. 0,5 г продукта экстрагируют 10 куб. см воды при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Раствор фильтруют или центрифугируют, осадок экстрагируют еще трижды по 10 куб. см воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают.

Идентификация тестовых соединений с помощью ТСХ

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20 — 25 мм, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта, приготовленного по п. 1. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси хлороформа, метанола и воды, взятых в объемном соотношении 26:14:3. Дают фронту растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку просматривают в УФ-свете (254 нм). На хроматограмме обнаруживают доминирующее пятно фиолетового цвета с Rf 0,4 — розавин. Пластинку опрыскивают 10% водным раствором натрия карбоната, нагревают в сушильном шкафу при температуре 110 °С в течение 2 мин., опрыскивают диазотированным сульфанилом и снова нагревают 2 мин. при 100 °С. На хроматограмме салидрозид наблюдают в виде полосы красноватого цвета с Rf 0,42.

Количественное определение салидрозида

К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 6 куб. см 10% ацетата свинца, 2 куб. см насыщенного раствора сульфата натрия, перемешивают, доводят объем до 50 куб. см, фильтруют, первые 15 куб. см отбрасывают. В мерную колбу на 25 куб. см переносят 5 куб. см фильтрата, прибавляют 2,5 куб. см натрия карбоната и 2,5 куб. см диазотированного сульфанила, доводят объем до метки, перемешивают и через 5 мин. измеряют оптическую плотность раствора относительно воды при 486 нм.

Содержание салидрозида, %, вычисляют по формуле:

где:

D — оптическая плотность;

253 — удельный показатель поглощения (Е/% см);

m — масса в г;

W — влажность, %.

19. Определение дубильных веществ в БАД, содержащих черемуху (Padus Avium Mill); ольху (ALNus incana); дуб (Qercus robur); бадан (Bergenia crassifolia)

Приборы и реактивы

Раствор перманганата калия 0,02 М.

Раствор индигосульфокислоты: в мерную колбу помещают 1 г индигокармина, 50 куб. см концентрированной серной кислоты, объем доводят водой до 1 куб. дм.

Подготовка образца

К 2 г измельченных корней добавляют 250 куб. см нагретой до кипения воды, смесь кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин., экстракт фильтруют.

Количественное определение дубильных веществ

25 куб. см раствора, полученного выше, разбавляют водой до 500 куб. см, добавляют 25 куб. см раствора индигосульфокислоты и титруют раствором перманганата до золотисто-желтого окрашивания.

1 куб. см раствора перманганата соответствует 4,157 мг таннина.

Содержание дубильных веществ по галловой кислоте

Приборы и реактивы

0,05 М раствор натрия тетрабората — буры (тетраборнокислого 10-водного): 19,07 г буры растворяют в 1000 куб. см воды.

0,1 Н раствор соляной кислоты: 8,5 куб. см соляной кислоты концентрированной (плотность 1,190) разбавляют до 1 куб. дм водой.

Буферный раствор, pH 9: смешивают 900 куб. см 0,05 М раствора буры и 100 куб. см 0,1 Н соляной кислоты.

Количественное определение дубильных веществ

2 — 4 куб. см исследуемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, добавляют 30 куб. см 50%-ного этилового спирта, взбалтывают до растворения, доводят до метки 50%-ным этиловым спиртом (раствор А).

1 куб. см раствора А помещают в колбу вместимостью 50 куб. см, доводят до метки буферным раствором (раствор В).

Через 10 мин. измеряют оптическую плотность раствора В при 277 нм. В качестве раствора сравнения используют буферный раствор.

Массовую долю дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту, % (X), определяют по формуле:

где:

E — удельный показатель поглощения галловой кислоты, равный 508 (оптическая плотность 1% раствора галловой кислоты, мг/куб. см);

m — масса образца, г;

К — коэффициент разведения (10 = 250 / 25)

или по формуле:

где 0,0197 — концентрация раствора галловой кислоты, мг/куб. см, оптическая плотность которого равна 1.

20. Определение производных антрахинона

20.1. В БАД, содержащих марену красильную (Rubia tinctorum L.), марену грузинскую (Rubia iberica (FICH.EX.DC).C.COCH)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870 куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора аммиака.

Подготовка образца

0,1 г измельченного продукта помещают в колбу на 200 куб. см, добавляют 7,5 куб. см ледяной уксусной кислоты, 1 куб. см концентрированной соляной кислоты, смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин., периодически встряхивая и смывая осадок со стенок. Колбу охлаждают и проводят экстракцию эфиром 3 х 30 куб. см при нагревании на водяной бане при 35 °С с обратными холодильником в течение 15 мин. с момента закипания эфира. Объединенные эфирные извлечения после охлаждения фильтруют через вату в делительную воронку на 250 куб. см, промывают водой 2 х 20 куб. см. При непрерывном охлаждении приливают малыми порциями сначала 15 куб. см 30%-ного раствора едкого натра, затем 25 куб. см щелочно-аммиачного раствора, не переставая охлаждать смесь, встряхивают 5 мин. и окрашенный раствор собирают в мерную колбу на 500 куб. см. Экстракцию щелочно-аммиачным раствором повторяют несколько раз до прекращения окрашивания щелочного раствора. К объединенному извлечению добавляют 3 капли пергидроля, перемешивают и доводят объем щелочно-аммиачным раствором до метки (раствор 1).

Для извлечения свободных производных антрахинона 0,1 г измельченного продукта помещают в колбу на 300 куб. см, прибавляют 50 куб. см эфира и нагревают на водяной бане с обратным холодильником 10 мин. Экстракцию повторяют трижды, эфирные извлечения объединяют, охлаждают и экстрагируют производные антрахинона 4 х 20 куб. см щелочно-аммиачным раствором, каждый раз встряхивая по 5 мин., щелочной раствор переносят в мерную колбу на 100 куб. см, прибавляют каплю пергидроля, доводят объем до метки щелочно-аммиачным раствором (раствор 2).

Количественное определение антрахиноновых производных

Количественное определение антрахиноновых производных

Измеряют оптическую плотность растворов 1 и 2 при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта концентрациями 10 — 50 мг/куб. см. 10 мг/куб. см хлорида кобальта соответствует концентрации свободных производных антрахинона 0,0027 мг/куб. см.

Содержание суммы производных антрахинона (%) вычисляют по формуле:

Содержание свободных производных антрахинона (%) вычисляют по формуле:

где:

и — концентрации производных анатрахинона, определенные в растворах 1 и 2;

М — масса образца;

W — потеря при высушивании, %.

Содержание связанны производных антрахинона (X, %) Х = — .

20.2. В БАД, содержащих ревень тангутский (Rheum palmatum L.)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870 куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора аммиака.

Подготовка образца

1. 1,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 куб. см 10%-ного спиртового раствора едкого натра, смесь кипятят в течение 3 — 5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают, подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, взбалтывают в течение 2 — 3 мин. Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.

2. 0,05 г продукта экстрагируют 7,5 куб. см ледяной уксусной кислоты при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения в колбу через обратный холодильник добавляют 30 куб. см эфира и кипятят 15 мин., экстракты охлаждают, фильтруют или центрифугируют, промывают осадок на фильтре или центрифугат эфиром. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют или центрифугируют. Осадок экстрагируют еще трижды по 10 куб. см воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают, фильтрат подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, встряхивают в течение 2 — 3 мин.

Идентификация тестовых соединений

5 куб. см эфирного экстракта, полученного по п. 1, смешивают с 5 куб. см раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в желтый цвет (хризофон).

Количественное определение антраценовых производных (в пересчете на истизин)

К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 100 куб. см щелочно-аммиачного раствора и осторожно встряхивают в течение 5 — 7 мин., охлаждая воронку под струей воды. После полного расслоения прозрачный красный нижний слой сливают в мерную колбу на 250 куб. см. Из эфирного слоя экстракцию продолжают аммиачно-щелочным раствором до прекращения окрашивания раствора, объединенные экстракты доводят до метки аммиачно-щелочным раствором. 25 куб. см этого раствора помещают в коническую колбу на 100 куб. см, нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане при периодическом перемешивании. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 25 куб. см и доводят объем водой до метки. Измеряют оптическую плотность раствора при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта 10 — 50 мг/куб. см. Концентрация 2,5 мг/куб. см хлорида кобальта соответствует концентрации истизина 0,0009 мг/куб. см.

20.3. В БАД, содержащих крушину ольховидную (Frangula alnus mill)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870 куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора аммиака.

Подготовка образца

1. 1,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 куб. см 10%-ного спиртового раствора едкого натра, смесь кипятят в течение 3 — 5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают, подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, встряхивают в течение 2 — 3 мин., эфирный слой окрашивается в желтый цвет.

2. 0,05 г образца экстрагируют 7,5 куб. см ледяной уксусной кислоты при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения в колбу через обратный холодильник добавляют 30 куб. см эфира и кипятят 15 мин., экстракт охлаждают, фильтруют или центрифугируют, промывают осадок на фильтре или центрифугат эфиром. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют или центрифугируют. Осадок экстрагируют еще трижды по 10 куб. см воды, объединенный экстракт фильтруют, охлаждают, фильтрат подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, встряхивают в течение 2 — 3 мин.

Идентификация тестовых соединений

5 куб. см эфирного экстракта, полученного по п. 1, смешивают с 5 куб. см раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в желтый цвет (хризофановая кислота).

Количественное определение антраценовых производных (в пересчете на истизин)

К экстракту, полученному по п. 2, прибавляют 100 куб. см щелочно-аммиачного раствора и осторожно взбалтывают в течение 5 — 7 мин., перемешивают, охлаждая воронку под струей воды. После полного расслоения прозрачный красный нижний слой сливают в мерную колбу на 250 куб. см, из эфирного слоя экстрагируют аммиачно-щелочным раствором до прекращения окрашивания раствора, объединенные экстракты доводят до метки аммиачно-щелочным раствором. 25 куб. см этого раствора помещают в коническую колбу на 100 куб. см, нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане при периодическом перемешивании, после охлаждения раствор переносят в мерную колбу на 25 куб. см и доводят объем водой до метки. Измеряют оптическую плотность раствора при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта 10 — 50 мг/куб. см. Концентрация 2,5 мг/куб. см хлорида кобальта соответствует концентрации истизина 0,0009 мг/куб. см.

20.4. В БАД, содержащих сенну (Salvia officinalis L)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр или ФЭК.

Щелочно-аммиачный раствор: 50 г едкого натра растворяют в 870 куб. см воды, добавляют 80 куб. см концентрированного раствора аммиака.

Подготовка образца

1. 0,5 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, добавляют 10 куб. см 10%-ного спиртового раствора едкого натра, смесь кипятят в течение 3 — 5 мин. Раствор фильтруют, охлаждают, подкисляют разбавленной соляной кислотой до слабокислой реакции по индикаторной бумаге, прибавляют 10 куб. см эфира, взбалтывают в течение 2 — 3 мин. Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.

2. 0,4 г продукта экстрагируют 100 куб. см воды при нагревании с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения в колбу через обратный холодильник добавляют эфир, экстрагируют 2 раза по 30 куб. см, эфирные экстракты отбрасывают, водную фазу подогревают до исчезновения запаха эфира, добавляют 0,1 г натрия гидрокарбоната, 10 куб. см 10%-ного раствора хлорида окисного железа, нагревают на кипящей водяной бане при перемешивании в течение 20 мин., добавляют 5 куб. см 50%-ной серной кислоты и нагревают еще 20 мин. После охлаждения раствор переносят в делительную воронку, колбу ополаскивают 20 куб. см воды и 75 куб. см эфира, экстрагируют из объединенной водной фазы эфиром еще дважды по 20 — 30 куб. см, объединенные эфирные экстракты фильтруют, промывают водой. К эфирному экстракту добавляют 100 куб. см щелочно-аммиачного раствора, перемешивают 5 мин., водную фазу переносят в колбу на 300 куб. см, к эфирному экстракту добавляют 20 куб. см воды и 3 куб. см концентрированной соляной кислоты, воронку охлаждают под струей воды и перемешивают слои, водную фазу переносят в колбу с водно-щелочной вытяжкой. Объединенные щелочно-аммиачные экстракты доводят до метки щелочно-аммиачным раствором.

Идентификация тестовых соединений

5 куб. см эфирного экстракта, полученного по п. 1, встряхивают с 5 куб. см раствора аммиака. Аммиачный слой приобретает вишнево-красное окрашивание (эмодины), эфирный слой остается окрашенным в желтый цвет (хризофановая кислота).

Количественное определение антраценовых производных (в пересчете на хризофановую кислоту)

Измеряют оптическую плотность раствора, полученного по п. 2, при 530 нм, в качестве калибровочных используют растворы хлорида кобальта 1 — 5%; 1%-ный раствор хлорида кобальта соответствует концентрации хризофановой кислоты 4,3 мг/куб. дм щелочно-аммиачного раствора.

21. Определение гидрохинона и его производных в БАД, содержащих толокнянку (Uvae ursi folium)

Арбутин (бета-глюкозид гидрохинона) является полифенольным индикаторным компонентом толокнянки Uva Ursi. Метод анализа арбутина включает стадии кислотного гидролиза с последующим определением гидрохинона с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ с спектрофотометрическим детектором при длине волны 280 нм.

Приборы и реактивы

Система ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором.

Гидрохинон, Sigma.

Приготовление рабочего стандартного раствора

Точную навеску 1 мг стандартного образца гидрохинона переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, до половины содержащую метанол, встряхивают до полного растворения вещества, доводят объем метанолом до метки и тщательно перемешивают.

Подготовка образца

Содержимое капсул или растертых таблеток, содержащих около 1,0 г порошка листьев или экстракта толокнянки, помещают в круглодонную колбу объемом 250 куб. см, добавляют 90 куб. см смеси метанол — вода — концентрированная соляная кислота (70:30:2) и экстрагируют на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Объем экстракта доводят дистиллированной водой до метки.

Проведение анализа

Колонка: Kromosil C18 или аналогичная, 5 мкм, 250 х 4,6 мм ID.

Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,1 М ортофосфорная кислота, pH 2,6 (20:80), скорость потока 1,0 куб. см/мин.

Детектирование: УФ, 280 нм.

Объем вводимой пробы 5 — 20 мкл.

Примерное время удерживания гидрохинона 4,5 — 5 мин.

Идентификацию гидрохинона проводят сравнением времени удерживания со стандартным образцом. При количественном определении используют метод внешней калибровки, сравнивая площади пиков гидрохинона в образце и стандарте.

Концентрацию арбутина определяют умножением найденной концентрации гидрохинона на коэффициент пересчета 2,473.

22. Определение производных кумарина

22.1. В БАД, содержащих крапиву (Urtica dioica L)

Скополетин (6-метокси-7-оксикумарин-гельзелиновая кислота)

Приборы и реактивы

Пластины для ТСХ «Silufol».

Облучатель ультрафиолетовый.

10%-ный водный раствор серной кислоты.

20%-ный раствор аммиака.

Стандартный раствор: 0,05%-ный раствор скополетина в метаноле (раствор 1).

Подготовка образца

Экстракция стеринов

5,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 100 куб. см хлористого метилена, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток растворителя удаляют в токе воздуха. Вещество растворяют в 2 куб. см хлористого метилена.

2,0 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 100 куб. см циклогексана, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Смесь фильтруют, повторяют экстракцию в тех же условиях. Объединенные экстракты охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток растворителя удаляют током воздуха. Вещество растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрил — тетрагидрофуран (96:4).

Экстракция скополетина

5,0 г измельченного продукта помещают в плоскодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, добавляют 50 куб. см метанола, смесь нагревают на водяной бане при перемешивании в течение 30 мин. Раствор охлаждают, фильтруют, растворитель упаривают на ротационном испарителе до небольшого объема, остаток растворителя удаляют в токе воздуха. Вещество растворяют в 2 куб. см метанола.

Качественный анализ скополетина с помощью метода ТСХ

На стартовую линию пластины Silufol (20 х 20 см), отстоящую от края пластины на 20 — 25 мм, микрошприцем или стеклянным капилляром наносят в виде полосы 20 х 3 мм 10 мкл экстракта и 5 мкл контрольного раствора 1. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси толуол — эфир диэтиловый (40:60) насыщенным раствором 10%-ной уксусной кислоты. Дают фронту растворителя подняться на 10 см, затем после высушивания пластинку опрыскивают 20% раствором аммиака. При рассматривании в УФ-свете (длина волны 360 нм) обнаруживают синюю флуоресцирующую полосу с Rf 0,25, соответствующую полосе скополетина в контрольном образце.

22.2. В БАД, содержащих вздутоплодник сибирский (Pholojodicarpus sibiricus-fisch.ex.sp re ng)

Производные пиранокумаринов: виснадин, дигидросамидин

Приборы и реактивы

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором.

Раствор фловерина (природная смесь дигидросамидина и виснадина) — 0,5 мг/куб. см в 95%-ном этаноле.

Подготовка образца

1 г измельченного сырья экстрагируют в аппарате Сокслета хлороформом в течение 1 часа (9 — 10 сливов). Хлороформ упаривают до объема 1 — 2 куб. см. К остатку добавляют 5 куб. см 95% этанола, содержимое количественно переносят в мерную колбу на 10 куб. см, объем доводят до метки 95% этанолом.

Идентификация и количественное определение тестовых соединений

Проводят ГЖХ определение суммарного содержания производных пиранокумаринов. Условия ГЖХ: стеклянная колонка 1200 х 2 мм, заполненная хроматоном N-AW-HMDS с размером частиц 0,16 — 0,20 мм с 2% лукопрена G1000.

Температура колонки — 200 °С, испарителя — 240 °С.

Скорость газа-носителя (азот) — 50 куб. см/мин.

В инжектор вводят 5 — 6 мкл исследуемого раствора и такое же количество контрольного раствора фловерина.

Фловерин при данных условиях разделения элюируется одним пиком. Расчет производят по площадям пиков контрольного образца и пробы.

23. Определение содержания эфирных масел и подтверждение состава компонентов

Таблица 43

КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ (КРАТКИЙ ПЕРЕЧЕНЬ)

Приборы и реактивы

ГХ-МС с энергией ионизирующих электронов 70 эВ, квадрупольный анализатор, диапазон массовых чисел 39 — 450 а.е.м., температура источника ионов и переходных линий 200 — 250 °С. Обработка данных на МС-станции с библиотечным поиском.

ГХ с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД).

Подготовка образца

Эфирные масла извлекают общепринятыми методами: перегонкой с водяным паром, экстракцией органическими растворителями (ГФ IX, с. 328, ГФ XI, т. 1, с. 287). Суммарное количественное определение содержания эфирных масел проводят гравиметрическим методом.

Идентификация и количественное определение состава

Анализ выделенных эфирных масел проводят с помощью методов ГХ-ПИД и ГХ-МС с использованием двух колонок разной полярности. В случае ГХ-ПИД идентификацию проводят с использованием индексов Ковача (http://www.nysaes.cornell.edu/-fst/faculty/acree/flavornet/OV101.html) при одинаковых условиях хроматографического разделения. Количественный анализ проводят с использованием метода внутреннего стандарта.

Условия хроматографического разделения (примеры)

1. ГХ-МС/ПИД: кварцевая капиллярная колонка длиной 30 — 50 м, внутренним диаметром 0,2 — 0,25 мм с неподвижной полиметилсилоксановой фазой толщиной пленки 0,2 — 0,3 мкм типа SE30 или SE54. Анализ проводят при программировании температуры: 60 °С (5 мин.) -> 280 °С, 5 °/мин. Газ-носитель — гелий, давление на входе колонки 1 — 1,5 атм. Температура инжектора — 200 — 250 °С, температура интерфейсной линии ГХ-МС — 200 °С.

2. ГХ-МС/ПИД: кварцевая капиллярная колонка длиной 30 — 50 м, внутренним диаметром 0,2 — 0,32 мм с неподвижной полиэтиленгликолевой фазой типа ПЭГ-20М или ФФАП толщиной пленки 0,2 — 0,3 мкм. Анализ проводят при программировании температуры: 50 °С (5 мин.) -> 220 °С, 5 °/мин. Газ-носитель — гелий, давление на входе колонки 0,5 — 10 атм. Температура инжектора — 200 — 220 °С, температура интерфейсной линии ГХ-МС — 200 °С.

Примечание. Из БАД на основе плодов и ягод эфирные масла предпочтительно анализировать на полярных колонках, т.к. достигается лучшее разделение основных компонентов — смешанных сложных эфиров. Эфирные масла, выделенные из БАД на основе цитрусовых и хвойных растений, содержащие терпеновые компоненты, предпочтительнее разделять на колонках SE30 и SE54.

24. Определение содержания инулина в БАД

Метод основан на определении инулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с рефрактометрическим детектором.

Смола Дауэкс 50 x 4, 200 — 400 меш., и Дауэкс 1 х 8, 200 — 400 меш.

Стандартный раствор инулина 10 мг/куб. см: предварительно высушивают в сушильном шкафу при 105 °С до постоянного веса в стеклянных бюксах.

Подготовка смол

Смолу Дауэкс 50 х 4, 200 — 400 меш., последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2Н NaOH, дистиллированной водой, 3Н HCl и опять водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения колонки.

Ионообменная способность для Дауэкса 50 х 4 в сухом виде составляет 5,1 мэкв/куб. см и во влажном 1,7 мэкв/куб. см соответственно.

Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из смолы Дауэкс 1 x 8 ( -форма), пропуская через смолу на бюхнеровской воронке 3Н формиат натрия до тех пор, пока проба на не станет отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу промывают большими объемами дистиллированной воды и заполняют колонку.

Ионообменная способность для Дауэкс 1 x 8 в сухом виде составляет 3,2 мэкв/куб. см и во влажном виде — 1,4 мэкв/куб. см.

Проведение испытания

Подготовка пробы

Моно- и дисахара экстрагируют 80% этиловым спиртом с учетом естественной влаги. Навеску образца заливают в колбе в соотношении 1:4 по сухим веществам 96%-ным этанолом и необходимым количеством воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80 — 82%. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70 — 80 °С в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще 3 — 4 раза. Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и др.). Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей, экстракты пропускают через колонку со смолой Дауэкс 50 х 4, непосредственно соединенную с колонкой, содержащей Дауэкс 1 х 8. С двух колонок собирают элюат и, если необходимо, его концентрируют на роторном испарителе. Чтобы в бане не поднимать высоко температуру, воду упаривают азеотропной отгонкой с этанолом. Сконцентрированный образец количественно переносят в мерную емкость, замеряют объем и хроматографируют.

Навеску исходного образца гидролизуют 2%-ным раствором щавелевой кислоты в течение часа при 100 °С. В качестве контроля на полноту гидролиза параллельно гидролизуют раствор инулина. Полученный после гидролиза продукт пропускают через колонки вышеописанным способом, после чего хроматографически определяют суммарное количество фруктозы с помощью ВЭЖХ.

Условия ВЭЖХ

Перед работой новую хроматографическую колонку с сепароном переводят на обратнофазный режим работы. Для этого колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии. Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (77:23). Смесь дегазируют на роторном испарителе. Детектирование — рефрактометрическое. Скорость потока 2,5 куб. см/мин.

Обработка результатов

От общего количества фруктозы вычитают фруктозу моно- и дисахаров и получают количество инулина и полифруктозидов. При расчете используют коэффициент 0,9, который учитывает присоединение воды при гидролизе. Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз.

Ошибка метода +/- 2%.

Качественный тест на инулин

Пробу обрабатывают 1 — 2 каплями 20% спиртового раствора нафтола и 1 каплей концентрированной серной кислоты. Наблюдают красно-фиолетовое окрашивание. При замене нафтола резорцином и тимолом соответственно красное и розово-малиновое окрашивание.

25. Определение содержания аралозидов А, В, С в БАД, содержащих аралию маньчжурскую (Araliae elatae (Mig) Seem)

Приборы и реактивы

Приготовление пластин для ТСХ

6 г силикагеля КСК, предварительно промытого соляной кислотой и водой и высушенного, и 0,6 г сульфата кальция растирают в ступке, добавляют 17 куб. см воды и выливают на пластинку 20 х 20 см. Сушат в течение суток на воздухе, активируют при 120 — 140 °С 30 — 40 мин.

Стандартный раствор — 0,6% раствор сапарала в метиловом спирте.

Подготовка образца

1. 1 г измельченного образца кипятят с 20 куб. см метилового спирта на водяной бане при 80 — 85 °С с обратным холодильником в течение 1 ч, дают раствору отстояться.

2. 5 г измельченного образца помещают в аппарат Сокслета с рабочим объемом 150 — 200 мл. В колбу-приемник наливают 250 мл метанола, 70 мл 50%-ного раствора серной кислоты и проводят экстракцию на кипящей водяной бане в течение 7 ч. Полученную в приемнике смесь разбавляют водой 1:1 и колбу охлаждают под струей холодной воды в течение 10 мин. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой, подсушивают на фильтре под вакуумом. Осадок количественно переносят 50 куб. см горячей смеси метилового и изобутилового спиртов (1:1,5).

Качественный тест на аралозиды

20 мкл экстракта, полученного по п. 1, и 10 мкл стандартного раствора сапарала наносят на стартовую линию пластинки с силикагелем, хроматографируют в системе хлороформ — метиловый спирт — вода (61:32:7). Дают фронту растворителя подняться на 16 — 18 см, затем после высушивания пластинку опрыскивают 20% раствором серной кислоты и нагревают в сушильном шкафу при 105 °С 10 мин. На пластинке должны проявиться три основных пятна вишневого цвета аралозидов, соответствующих по Rf аралозидам в сапарале.

Количественное суммарное определение аралозидов

Полученный по п. 2 раствор титруют потенциометрически 0,1 М раствором едкого натра в смеси метилового спирта и бензола. При титровании отмечают количество титранта, израсходованного на доведение pH испытуемого раствора до 7,0.

Расчет суммарного содержания аралозидов в пересчете на аммонийную соль аралозидов А, В, С с усредненной молекулярной массой не менее 5% в % на сухое вещество рассчитывают по формуле:

где:

0,10422 — количество аммонийных солей аралозидов, соответствующих 1 куб. см раствора едкого натра 0,1 М;

V — объем титранта, израсходованный на титрование пробы;

— объем титранта, израсходованный на доведение pH до 7,0;

— объем титранта, израсходованный на холостой опыт;

W — потеря при высушивании, %;

0,2020 — коэффициент пересчета бихромата калия на гнафалозид А;

1,03 — поправочный коэффициент на неполное элюирование гнафалозида А с сорбента;

W — потеря массы при высушивании, %.

26. Определение содержания экдистена в БАД, содержащих левзею сафлоровидную (Leuzea carthamoides (Willd.DC))

Приборы и реактивы

Приготовление пластин для ТСХ: сорбент состоит из смеси Аl2О3 нейтральной и силикагеля, промытого последовательно 5Н соляной кислотой (15 — 20 ч) и водой и высушенного при 120 °С 12 час. Для приготовления пластинок 9 г силикагеля и 3 г оксида алюминия растирают в ступке с 0,4 г сульфата кальция, постепенно прибавляя 25 куб. см воды, массу перемешивают и выливают на пластинку 20 х 20 см, высушивают и активируют при 120 °С 1 ч.

Спектрофотометр.

Раствор ГСО экдистена: 0,15 г ГСО экдистена (ВФС42-1713-87) помещают в мерную колбу на 25 куб. см и доводят раствор до метки 95%-ным этанолом. 7 куб. см полученного раствора переносят в мерную колбу на 25 куб. см и объем доводят до метки 95% этанолом (раствор А).

Раствор ванилина в концентрированной серной кислоте.

Подготовка образца

15 г измельченного образца экстрагируют 180 — 200 куб. см метилового спирта в аппарате Сокслета с рабочим объемом 150 куб. см в течение 7 час. (25 — 30 сливов). Экстракт концентрируют на ротационном испарителе при температуре 40 °С до объема 5 куб. см, количественно переносят в мерную колбу на 25 куб. см, доводят объем метанолом до метки (раствор Б). На пластинку, разделенную на 5 зон, с помощью микрошприца или стеклянного капилляра наносят в виде полос 20 х 3 мм 150 мкл раствора Б и 150 мкл стандартного раствора экдистена (раствор А) — на 4 зоны, пятая зона остается пустой (для раствора сравнения). Пластинку помещают в хроматографическую камеру и элюируют в смеси метанол — хлороформ — ацетон (2:6:1). Дают фронту растворителя подняться на 16 — 18 см. После высушивания пластинки две зоны опрыскивают раствором ванилина, отмечают полосу стандарта и собирают сорбент из необработанных зон стандарта и образца. Вещества смывают с силикагеля 15 мл метанола в течение 4 час.

Проведение анализа

Спектрофотометричекое количественное определение экдистена

Измеряют оптическую плотность растворов стандарта и образца относительно раствора «холостого опыта» при длине волны 242 нм в кюветах 10 мм. Содержание экдистена в сырье должно быть не менее 0,1%.

Качественный тест на инулин

Сухой порошок обрабатывают 1 — 2 каплями 20% спиртового раствора нафтола и 1 каплей концентрированной серной кислоты. Наблюдают красно-фиолетовое окрашивание. При замене нафтола резорцином и тимолом наблюдают соответственно красное и розово-малиновое окрашивание.

27. Определение содержания четвертичных аммонийных оснований (глицинбетаин) в БАД, содержащих солянку холмовую (Salsola collina PALL)

Приборы и реактивы

Спектрофотометр.

ВЭЖХ с УФ-детектором.

5% раствор соли Рейнеке (1,25 г соли Рейнеке, перекристаллизованной из воды и высушенной при 60 °С, растворяют при перемешивании в 25 куб. см дистиллированной воды, нагретой до 60 °С).

Подготовка образца

1. 2 — 3 г измельченного продукта экстрагируют в аппарате Сокслета 200 куб. см 70% этилового спирта в течение 2 — 2,5 ч. Экстракт фильтруют и упаривают досуха, остаток растворяют в 10 куб. см 1 М НСl, фильтруют через бумажный фильтр, промывают 1 М НСl.

Получение производного глицинбетаина для ВЭЖХ: р-бромфенациловый эфир глицинбетаина

2. Экстракт переносят в мерную колбу на 200 куб. см и доводят объем 70% этанолом. 1,25 куб. см этого экстракта переносят в реакционную пробирку с пробкой на 10 куб. см и растворитель упаривают досуха в токе воздуха при нагревании 80 — 90 °С. В пробирку добавляют 0,25 куб. см 40% раствора ацетонитрила, содержащего 10 мМ КН2РО4, 10 мМ КНСО3, 5мМ 18-краун-6 эфира, и после встряхивания добавляют 1,0 куб. см раствора р-бромфенацилбромида (15 мг/куб. см) в ацетонитриле. После инкубации 30 мин. при 80 °С пробирку охлаждают и добавляют по 2,5 куб. см 0,1Н раствора серной кислоты и хлороформа. Пробирку встряхивают и центрифугируют 3 мин. Отбирают водную фазу.

Количественное определение четвертичных оснований с помощью метода спектрофотометрии

К фильтрату, полученному по п. 1, добавляют при перемешивании 5 куб. см горячего 5% раствора соли Рейнеке. Через 1 ч выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 20 куб. см эфира, переносят в стаканчик и растворяют в 15 куб. см ацетона. Раствор фильтруют в мерную колбу на 25 куб. см, добавляют 7,5 куб. см воды, доводят до метки ацетоном. Определяют оптическую плотность раствора при 520 нм. Раствор сравнения ацетон — вода (7:3).

Расчет содержания четвертичных оснований в пересчете на глицинбетаин, %, проводят по формуле:

где:

D — оптическая плотность раствора;

153 — молекулярная масса глицинбетаинхлорида;

118 — коэффициент молярного поглощения рейнеката глицинбетаина при 520 нм;

а — навеска травы;

V — объем пробы.

Количественное определение четвертичных оснований с помощью метода ВЭЖХ

Условия хроматографии: сорбент: а) катионообменный (Nucleosil-50, SA) или б) ионно-парный (Silasorb-5, C18), размеры колонки 2 х 64 мм, подвижная фаза — раствор додецилсульфоната натрия, скорость потока 0,1 мл/мин. Детектор УФ 210 нм.

В хроматограф вводят 5 мл водной фазы (п. 2). Расчет — по производному глицинбетаина. Время выхода р-бромфенацилового эфира глицинбетаина — 6 мин.

28. Определение содержания гексозаминов

Для определения гексозаминов используют колориметрический метод Элсона и Моргана (Biochem. J., 27, 1824 (1933)). Метод основан на конденсации аминосахара с щелочным ацетилацетоном с образованием 2-метил-3-ацетилпиррола и 2-метилпиррола; в присутствии реактива Эрлиха (4-диметиламинобензальдегида) 2-метилпиррол является основным хромогеном. Образование этих хромогенов сопровождается появлением красновато-розоватой окраски. В реакции этого типа глюкозамин и галактозамин дают одинаковую окраску с одинаковой величиной молярной экстинкции. Взаимодействие между сахарами и аминокислотами мешает определению, поэтому гексозамины отделяют от аминокислот на ионообменной колонке.

Если гексозамины находятся в связанном виде, то их отделяют путем гидролиза в 4Н соляной кислоте при 100 °С в течение 4 часов в запаянных ампулах под азотом.

Выделение фракции гексозаминов и отделение их от нейтральных сахаров, аминокислот и пептидов осуществляют хроматографией на смоле Дауэкс 50 х 4 (200 — 400 меш., -форма). Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2Н NaOH, дистиллированной водой, 3Н HCl и опять водой. Избыток влаги удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию промытой смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения хроматографических колонок.

Перед нанесением на колонку образец освобождают от соляной кислоты. Для этого его помещают в вакуумный эксикатор с NaOH. Для защиты от кислоты насос снабжают ловушкой с негашеной известью. Используют хроматографическую колонку с внутренним диаметром 10 мм (можно использовать в качестве колонки пластмассовый шприц). На дно колонки помещают маленький фильтр из стеклянной ваты, сверху наливают 5 куб. см суспензии и дают ей осесть. После того как образец проникнет в смолу, колонку промывают четырьмя порциями по 5 куб. см дистиллированной воды. Гексозамины элюируют 5 — 10 куб. см 2Н HCl. Элюат освобождают от кислоты указанным выше способом и в остатке сразу определяют количество гексозаминов колориметрическим методом.

Реактивы

Приготовление щелочного раствора ацетилацетона

2,4-пентандион (ацетилацетон) должен быть бесцветным. Его накануне перегоняют и хранят в темной посуде при 4 °С. Непосредственно перед использованием 2 мл ацетилацетона растворяют в 98 куб. см 1 М Na2CO3.

Реактив Эрлиха 2,7%-ный (вес/объем) раствор 4-диметиламинобензальдегида в смеси этанол — концентрированная HCl (1:1, по объему). Этот реактив следует готовить в день определения.

Проведение анализа

В пробирках со стеклянными пробками смешивают 1 куб. см раствора гексозамина (5 — 30 мкг) с 1 куб. см раствора щелочного ацетилацетона. Пробы нагревают в течение 45 мин. при 100 °С и затем охлаждают водопроводной водой. Добавляют 4 куб. см 95%-ного этанола и тщательно перемешивают, а затем добавляют 1 куб. см реактива Эрлиха и опять интенсивно перемешивают. На последнем этапе следует периодически выпускать образующийся СO2, приоткрывая пробку несколько раз во время перемешивания. Пробирки оставляют на 1 ч при комнатной температуре и затем определяют оптическую плотность раствора при 530 нм. Параллельно проводят обработку стандартных и слепых проб.

29. Определение содержания гуминовых кислот и глицина в мумие

Методика основана на гравиметрическом определении содержания гуминовых кислот, экстрагированных из продукта щелочным раствором. Глицин идентифицируют в кислотном гидролизате методом ТСХ при обнаружении пятен аминокислот обработкой нингидроновым реагентом.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр.

1% раствор NaOH.

6Н, 0,5Н растворы НСl.

0,3% раствор нингидрина в н-бутаноле.

Уксусная кислота концентрированная.

25% раствор аммиака.

Раствор глицина в 0,5 н НСl — 2 мг/куб. см.

Подготовка образца

К 2 г образца добавляют 25 куб. см 1% раствора NaOH и нагревают в колбе с обратным холодильником в течение 2 — 2,5 ч на кипящей водяной бане. Экстракт фильтруют или центрифугируют при 3000 об./мин., остаток снова обрабатывают 10 куб. см раствора щелочи. Объединенные экстракты фильтруют или центрифугируют, фильтрат подкисляют 5% НСl до pH 3 — 4, колбу с выпавшим осадком помещают на 30 — 60 мин. в холодильник, далее взвесь переносят в ц/ф пробирку с известным весом, центрифугируют, осадок промывают водой, снова центрифугируют, супернатант отделяют, а осадок высушивают при температуре 105 °С до постоянного веса. В образце определяют содержание золы, прокалив его при температуре 350 °С в течение 5 — 6 ч. Содержание беззольных гуминовых кислот рассчитывают по разнице массы гуминовых кислот и золы. Записывают спектры раствора гуминовых кислот с концентрацией 2 мг/куб. см в 0,1Н NaOH в области длин волн 465 — 730 нм. Раствор гуминовых кислот мумие характеризуется максимумами с убывающей интенсивностью при 726, 665, 620, 575, 530, 500, 465 нм.

200 мг образца помещают в запаянную стеклянную ампулу, добавляют 10 куб. см 6Н НСl и проводят гидролиз при 100 — 105 °С в течение 24 ч; далее кислоту упаривают досуха. Остаток растворяют в 0,5Н НСl.

Идентификация глицина

На стартовую линию пластины «Силуфол» наносят по 2 — 3 мкл растворов образца и глицина и помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь бутанола, уксусной кислоты и воды, взятых в объемном соотношении 4:1:1. Дают растворителю подняться на 10 см, пластинку вынимают, сушат от растворителя и опрыскивают 0,3% раствором нингидрина. Помещают пластину на 5 — 10 мин. в термостат при 105 °С. Глицин обнаруживают в виде красного пятна с Rf 0,5.

Глава 4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК В СОСТАВЕ БАД

I. Метод определения консервантов (бензойная и сорбиновая кислоты) с помощью ВЭЖХ

Сущность метода

Метод основан на извлечении бензойной кислоты (БК) и сорбиновой кислоты (СК) из БАД перегонкой с паром и/или экстракцией органическим растворителем с последующим хроматографическим разделением их в тонком слое сорбента, элюции и измерении оптической плотности полученных элюатов.

Подготовка к испытанию

Приготовление стандартных растворов

Раствор 1. Навеску 100 мг бензойной кислоты переносят в мерную колбу на 25 куб. см и доводят до метки этилацетатом (концентрация полученного раствора 4 мг/куб. см).

Раствор 2. Навеску 40 мг сорбиновой кислоты переносят в мерную колбу на 100 куб. см и доводят до метки этилацетатом (концентрация полученного раствора 0,4 мг/куб. см).

Раствор 3. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Концентрация БК в полученном растворе 2,0 мг/куб. см, СК — 0,2 мг/куб. см.

Выделение бензойной и сорбиновой кислот

Анализируемую пробу продукта (кроме напитков) массой около 10 г отвешивают с точностью до 0,01 г, измельчают и гомогенизируют с добавкой 25 г Na2SO4 и 40 куб. см 1 М H2SO4. Гомогенат переносят в колбу емкостью 1 куб. дм, соединенную с парообразователем, и нагревают (рис. 25).

В момент, когда жидкость в колбе начинает закипать, закрывают парообразователь пробкой и отгоняют БК и СК с паром, собирая около 80 куб. см дистиллята в приемник, содержащий 10 куб. см 1 М NaOH. Дистиллят переносят в делительную воронку, насыщают Na2SO4 (на 10 куб. см дистиллята добавляют 6 г Na2SO4), подкисляют 1 М H2SO4 до pH 2,0 — 3,0 и экстрагируют этилацетатом трижды по 10 куб. см. Объединенный экстракт сушат, добавляя 2 г прокаленного безводного Na2SO4. Этот экстракт обозначают . Экстракт упаривают на ротационном испарителе (допускается упаривание в фарфоровой чашке на песчаной бане) до объема 1 куб. см.

При анализе напитков исключают стадию отгонки, 10 куб. см напитка разбавляют вдвое 0,5 М H2SO4, добавляя 10 г Na2SO4, интенсивно перемешивают и экстрагируют БК и СК 3 раза по 5 куб. см этилацетатом. Объединенный экстракт () сушат 1 г безводного прокаленного Na2SO4. Экстракт упаривают на ротационном испарителе или в фарфоровой чашке до конечного объема 1 куб. см.

Количественное определение с помощью ВЭЖХ согласно ГОСТ Р 30059-93 «Напитки безалкогольные. Методы определения аспартама, сахарина, кофеина и бензоата натрия».

Хроматографический анализ

Аппаратура, материалы

Жидкостной хроматограф с УФ-детектором, длина волны 272 нм.

Автоматическая система обработки данных типа «Амперсент» или интегратор.

Колонка «Kromasil 5 мю С18», размер колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм.

Полученный экстракт и раствор стандарта 3 поочередно вводят в жидкостной хроматограф при следующих условиях работы: состав элюэнта: 0,025 М ацетат натрия, pH 4,5, — ацетонитрил (8:2); скорость подвижной фазы 1,0 куб. см/мин.; детектирование в УФ-спектре при 272 нм; объем вводимой пробы 5 — 10 мкл; чувствительность детектора 0,01 о.е.п.

На хроматограмме экстракта идентифицируют пики БК и СК по времени удерживания стандартов: для БК — 3,4 мин. +/- 0,2, для СК — 4,4 +/- 0,2 мин.

Для подтверждения правильности идентификации консервантов аликвоты раствора 3 и экстракта вводят в хроматограф в тех же условиях повторно, регистрируя в максимумах хроматографических пиков спектр поглощения БК (250 — 270 нм) и СК (230 — 270 нм). БК имеет три максимума поглощения в указанном интервале спектра — 268, 270 и 272 нм, а СК — один — 254 нм, что является дополнительным идентификационным признаком для подтверждения присутствия их в образце.

Обработка результатов

Измеряют высоту пиков стандартов БК и СК на хроматограммах и рассчитывают их содержание в мг/кг или мг/куб. дм по формуле:

где:

К — коэффициент, учитывающий степень извлечения БК и СК;

Р — концентрация БК или СК в растворе стандарта (раствор 3), мг/куб. см;

— высота пика БК или СК на хроматограмме экстракта, мм;

— высота пика БК или СК на хроматограмме стандартов, мм;

— объем экстракта, куб. см;

М — масса образца, взятая для анализа (г), или объем напитка (куб. см).

Вычисление проводят до второго десятичного знака.

За конечный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 44.

Таблица 44

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

II. Метод определения заменителей сахара

Идентификация и количественное определение осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1. Метод определения аспартама

Аспартам: 1-метиловый эфир N-L-альфа-аспартил-L-фенилаланина.

Условия ВЭЖХ

Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм. Сорбент — Кромасил 100 С18, зернение 5 мкм. Перед работой новую колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы. Для этого колонку промывают 40 куб. см изопропанола, затем 80 куб. см деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза

5,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, безводного (КН2РO4) растворяют в 820 куб. см бидистиллированной воды, доводят pH до 4,3 добавлением фосфорной кислоты, после чего прибавляют 180 куб. см ацетонитрила. Смесь дегазируют на роторном испарителе.

Стандарт аспартама с концентрацией 1 мг/куб. см.

Детектирование

Спектрофотометр, длина волны УФ 255 нм, шкала 0,5 AUFS, скорость потока 0,8 куб. см/мин., время удерживания аспартама — 6,2 +/- 0,05 мин. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows, версия 1.39.

Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +/- 5%.

2. Метод определения дикетопиперазина

Дикетопиперазин: 5-бензил-3,6-диокси-2-пиперазилуксусная кислота.

Подготовка образца

При определении аспартама и дикетопиперазина в БАД учитывают неустойчивость аспартама к нагреванию, а также то, что он гидролизуется в сильнокислых и нейтрально-щелочных средах.

Проведение анализа

Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ — по методу 1.

Детектирование: УФ 210 нм, шкала 0,01 AUFS, скорость потока 0,8 куб. см/мин., стандартный раствор 2 мкг/куб. см, время удерживания дикетопиперазина 3,9 +/- 0,02. Ошибка метода +/- 2 %.

3. Метод определения ацесульфама К

Ацесульфам: 6-метил-1,2,3-оксатиазин-4(3Н)-он-2,2-диоксид, калиевая соль.

Проведение анализа

Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ — по методу 1.

Детектирование: УФ 225 нм, шкала 0,05 AUFS, время удерживания 2,8 +/- 0,02.

4. Метод определения сахарина

Сахарин: 3-оксо-2,3-дигидробензо[d]изотиазол-1,1-диоксид.

Подготовка образца

При выделении из БАД учитывают следующие свойства сахарина: 1 г сахарина растворяется в 290 куб. см холодной воды или в 25 куб. см кипящей воды, в 31 куб. см этилового спирта и в 12 куб. см ацетона. Сахарин практически нерастворим в хлороформе, хорошо экстрагируется этиловым и петролейным эфирами. Растворимость его увеличивается при добавлении лимонной, винной или уксусной кислот. Он устойчив при нагревании до 150 °С при pH 3,3 и 7,0.

Проведение анализа

Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ — по методу 1.

Детектирование: УФ 269 нм, шкала 0,1 AUFS, время удерживания 2,9 +/- 0,1 мин.

5. Метод определения цикламата и цикламата в смеси с сахарином

Цикламат: натриевая соль циклогексиламино-N-сульфоновой кислоты.

Условия ВЭЖХ

Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм. Сорбент — Кромасил 100 С18, зернение 5 мкм. Перед работой новую колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы согласно описанию в методе 1.

Подвижная фаза

5,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, безводного (КН2РO4) растворяют в 850 куб. см бидистиллированной воды, доводят pH до 1,8 добавлением фосфорной кислоты, после чего прибавляют 150 куб. см ацетонитрила. Смесь дегазируют на роторном испарителе.

Детектирование

Спектрофотометр, длина волны УФ 210 нм, шкала 0,02 AUFS, скорость потока 0,6 куб. см/мин., время удерживания цикламата — 7,1 +/- 0,02 мин., сахарина — 8,5 +/- 0,05 мин.

Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +/- 5 %.

6. Метод определения сукралозы

Сукралоза: 1,6-дихлор-1,6-дидеокси-бета-D-фруктофуранозил-4-деокси-альфа-D-галактопиранозид; -трихлоргалактосахароза.

Условия ВЭЖХ

Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм. Сорбент: сепарон SGX С18, зернение 7 мкм. Перед работой новую колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы согласно описанию в методе 1.

Подвижная фаза

Ацетонитрил — вода (15:85).

Стандарт концентрацией 1,0 мг/куб. см. Стандартный раствор готовят в подвижной фазе.

Детектирование: рефрактометр, скорость потока 0,7 куб. см/мин., время удерживания сукралозы — 6,5 +/- 0,05 мин. Ошибка метода +/- 5%.

7. Метод определения изомальта

Пищевая добавка, заменитель сахара Е 953 изомальт — дисахаридный полиол, состоящий из смеси примерно равных частей D-глюкопиранозил-1,6-D-сорбита (GPS) и D-глюкопиранозил-1,1-D-маннита (GPM). Брутто-формула С12Н24О11.

Принципиальная схема метода

Метод заключается в количественном определении основных компонентов изомальта (GPS и GPM) или суммы их концентраций и предусмотренных спецификацией примесей сорбита, маннита, изомальтулозы, а также глюкозы, фруктозы и сахарозы в исследуемом экстракте с помощью катионообменной ВЭЖХ в форме при температуре хроматографической колонки 80 °С или с помощью ВЭЖХ на амино-фазе с использованием рефрактометрического детектора.

Материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5 куб. см/мин. с устройством для термостатирования колонки.

Колонка и предколонка с катионитом в форме «НРХ-87 С, BioRad» или аналогичная колонка и предколонка на основе сульфированного стиролдивинилбензола в ионной кальциевой форме (8%), например «Rezex RCU-USP Sugar Alcohols» или «Waters Sugar-Pak», длина колонки 250 мм, предколонки — 30 мм, внутренний диаметр колонки и предколонки 4,0 или 4,6 мм.

Колонка и предколонка Kromasil NH2 (MetaChem Technologies, США) или аналогичная, параметры колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц сорбента 5 мкм.

Рефрактометрический детектор; например, MERK L 7490, Германия, регистрирующий потенциометр (самописец) или интегратор или автоматическая система обработки данных «МультиХром для Windows 9x&NT», версия 1,5х.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с допустимой погрешностью +/- 0,01 г.

Весы лабораторные общего назначения с допустимой погрешностью +/- 0,001 г.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Вакуум-сушилка.

Эксикатор.

Термометр ртутный стеклянный лабораторный на 200 °С по ГОСТ 215-73.

Изомальт фирмы Sudzucker, LIMS N 200009040.

Фруктоза, глюкоза, сорбит, маннит, сахароза, изомальтоза кристаллические.

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Вода бидистиллированная деионизированная по ГОСТ 6709 и фильтрованная через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 °С.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Бюкса с притертой крышкой по ГОСТ 7148-70.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100 и 250 куб. см.

Цинк уксуснокислый 2-водный, х.ч. по ГОСТ 5823-78; раствор концентрацией 300 г/куб. дм.

Приготовление стандартных растворов

Аналитический образец изомальта высушивают до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 «Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги». Готовят стандартный раствор изомальта с массовой концентрацией 3 мг/куб. см. Точные концентрации GPS и GPM в полученном стандартном растворе рассчитывают исходя из навески изомальта и количеств каждого компонента смеси, декларированных в аналитическом сертификате. Таким образом, концентрации GPS и GPM должны составить от 1,4 до 1,6 мг/куб. см.

Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита, маннита, сахарозы, изомальтулозы с массовыми долями 3 мг/куб. см.

Приготовление исследуемого образца

Анализируемый образец БАД или пищевого продукта размельчают или растирают в ступке. Навеску массой 5 +/- 0,01 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 150 куб. см подогретой до 75 — 80 °С дистиллированной воды и встряхивают на аппарате для встряхивания 20 — 30 минут. Доводят температуру смеси до комнатной, переносят в делительную воронку, встряхивают с хлороформом (3 раза по 50 куб. см), хлороформный слой отбрасывают, верхний водный слой количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см. Добавляют 15 куб. см 30%-ного раствора ацетата цинка, встряхивают, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр «синяя лента». Остаток хлороформа из фильтрата отдувают в токе азота и аликвоту вводят в хроматограф.

Анализ с помощью ВЭЖХ

I вариант (с использованием катионообменной ВЭЖХ).

Условия ВЭЖХ: температура 80 — 90 °С, подвижная фаза бидистиллированная, деионизированная и фильтрованная вода, скорость подвижной фазы 0,4 — 0,8 куб. см/мин., аликвота, вводимая в инжектор, 10 — 15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливается таким образом, чтобы ввод 1,5 мкг GPS или GPM соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Определяют каждый компонент изомальта (GPS и GPM) и суммируют их.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании катионообменной ВЭЖХ (зависят от типа колонки, скорости подвижной фазы и температуры колонки): сахароза — 9 +/- 1, изомальтулоза — 10 +/- 1, глюкоза — 12 +/- 2, GPM — 14 +/- 1, фруктоза — 15 +/- 1, GPS — 16 +/- 1, маннит — 22 +/- 2, сорбит — 29 +/- 2.

II вариант (с использованием аминофазы).

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза: ацетонитрил — вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0 куб. см/мин., аликвота, вводимая в инжектор, 10 — 15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 30 мкг фруктозы, глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Определяют сумму концентраций (GPS и GPM) в виде изомальта.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании амино-фазы: фруктоза — 7,0 +/- 0,2, сорбит — 7,5 +/- 0,2, глюкоза — 8,5 +/- 0,1, сахароза — 11 +/- 0,1, изомальт — 13 +/-0,2.

Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения метода по манниту, сорбиту и изомальтулозе — около 30,0 мг/куб. дм, или 0,003%. Стандартное отклонение сходимости (Sr) при концентрации сорбита 1% не превышает 0,1 — 0,13. Среднее значение открываемости маннита, сорбита и изомальтулозы 91 — 95%, GPS и GPM — 96 — 98%.

Метод позволяет определять содержание GPS, GPM или изомальта, а также концентрации примеси глюкозы, фруктозы, сорбита, маннита, сахарозы и изомальтозы.

Обработка результатов измерений

Количественное определение компонентов осуществляют методом внешнего стандарта. Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,005, 0,01 и 0,02 куб. см соответствующих стандартных растворов. Для каждого количества определяют площадь пика на хроматограмме.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см (10 мкл) раствора анализируемого образца. Определяют площадь пика, соответствующего по времени удерживания стандартам. Расчет концентрации компонентов проводят по формуле:

где:

С — концентрация компонента в образце, %;

— объем анализируемого образца, куб. см (250 куб. см);

— объем аликвоты раствора анализируемого образца, внесенный в хроматограф (0,01 куб. см);

m — масса стандарта, введенного в хроматограф при калибровке, мкг;

М — навеска образца, взятая для анализа, г;

— площадь пика в анализируемом образце;

— площадь пика стандарта.

III. Методы определения состава ароматизаторов

Состав и содержание ароматизаторов определяют методом хромато-масс-спектрометрии (ХМС). Если допускает состав пробы, ХМС анализ проводят по следующим схемам:

а) прямой ХМС анализ исходного образца;

б) ХМС анализ экстракта.

Приборы

Хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных и библиотекой масс-спектров.

Подготовка пробы

Органические компоненты экстрагируют из образца, разбавленного водой в соотношении 1:5, смесью эфир — пентан (5 x 3 куб. см); если растворитель — пропиленгликоль, экстракцию проводят пентаном. Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают в токе азота при комнатной температуре до 100 мкл, 1 мкл экстракта вводят в инжектор.

Условия хроматографического разделения

Кварцевая капиллярная колонка длиной 30 — 50 м, внутренним диаметром 0,2 — 0,23 мм, неподвижная фаза полиметилсилоксан типа SE 30, толщина пленки 0,2 — 0,3 мкм, газ-носитель — гелий, давление на входе колонки 1,6 атм. Температура источника ионов 160 °С, испарителя и переходных линий 220 и 200 °С, режим программирования температуры колонки: 50 °С (2 мин.), 120 °С (5 мин.), далее — повышение температуры за 4 мин. до 250 °С, изотерма — 20 мин.

Условия масс-спектрометрии: энергия ионизирующих электронов 70 eV, сканирование по ПИТ от 39 до 450 а.е.м., обработка данных с использованием библиотек масс-спектров для идентификации отдельных ароматических компонентов (http://www.nysaes.cornell.edu/fst/faculty/acree/flavornet/OV101.html).

Список разрешенных ароматизаторов приведен в СанПиН 2.3.2.1293-03 «Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования по применению пищевых добавок».

IV. Метод определения синтетических пищевых красителей

К синтетическим пищевым красителям относятся органические соединения следующих групп: азокрасители, пиразолоновые, трифенилметановые, антрахиноновые, индигоидные, ксантеновые, хинолиновые и полициклические (Е102 — «Тартразин», Е103 — «Алканет», Е104 — «Желтый хинолиновый», Е107 — Желтый 2G, Е110 — «Желтый «Солнечный закат», Е122 — «Азорубин, Кармуазин», Е124 — «Понсо 4R», Е128 — «Красный 2G», Е129 — «Красный «Очаровательный» AC», E131 — «Синий патентованный FCF», E142 — «Зеленый S», E143 — «Зеленый прочный FCF», E151 — «Черный блестящий PN», E155 — «Коричневый NT»).

В зависимости от типов заместителей растворимость в воде рассматриваемых красителей колеблется от очень хорошей до очень плохой. Увеличение числа сульфатных или карбоксильных групп повышает растворимость в воде. Наличие заместителей (хлор, нитрогруппа или метил) повышает растворимость красителей в органических растворителях. В настоящей методике органические красители разделены на несколько групп в соответствии с их химическим строением: азокрасители, пиразолоновые, трифенилметановые, антрахиноновые, индигоидные, ксантеновые, хинолиновые и полициклические.

Таблица 45

ПЕРЕЧЕНЬ И СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКИХ ПИЩЕВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ

1. Определение качественного состава красителей в БАД методом ТСХ

1.1. Качественное определение индивидуальных и смесевых синтетических пищевых красителей

Качественный состав индивидуальных и смесевых пищевых красителей (СПК) определяют методом ТСХ на силикагеле в системах:

Наносят на пластинку ТСХ 2 — 5 мкл раствора исследуемого образца с концентрацией 10 мг/100 куб. см. Проводят разделение в системе А.

Таблица 46

ВЕЛИЧИНЫ Rf НЕКОТОРЫХ СПК ПРИ ТСХ

В случае, если в системе А смеси пищевых красителей не разделились либо величины Rf пищевых красителей, находящихся в смеси, близки, проводят хроматографическое разделение в системе В либо двумерную ТСХ, используя в качестве второй подвижной фазы систему В.

1.1.1. Очистка образца

В случае, если в матриксе пищевого красителя присутствуют вещества, препятствующие нанесению на пластинку ТСХ либо способствующие необратимой сорбции образца пищевого красителя на старте, необходимо провести предварительную очистку образца. Для этого на стеклянный фильтр диаметром 25 — 30 мм помещают целлюлозу в виде суспензии в 25%-ном растворе сульфата аммония слоем толщиной около 5 мм. На слой целлюлозы наносят очищаемый образец и производят элюирование поэтапно: метанолом (20 куб. см) и 25%-ным раствором сульфата аммония (80 куб. см) до исчезновения окраски целлюлозы. Полученный элюат используют для проведения анализа методом ТСХ.

1.1.2. Очистка образца хроматографическими методами

10 — 20 г порошка целлюлозы перемешивают примерно с 200 куб. см воды. Дают смеси отстояться и декантируют жидкость. Повторяют промывку и декантацию. К промытой целлюлозе добавляют приблизительно 100 куб. см элюента, перемешивают и переносят суспензию в хроматографическую колонку. После стекания жидкости промывают содержимое колонки еще 100 куб. см элюента. 5 г целлюлозы промывают, как описано выше. К промытой целлюлозе добавляют 100 куб. см элюента, перемешивают, дают смеси отстояться и отделяют жидкость декантацией.

Соединяют 5 г промытой целлюлозы с образцом красителя, добавляют 10 г сульфата аммония. Тщательно перемешивают. Количественно переносят смесь в колонку. Для ополаскивания используют приблизительно 25 куб. см элюента. Когда весь раствор стечет, добавляют около 400 куб. см элюента. Собирают восемь фракций по 50 куб. см каждая и анализируют с помощью ТСХ.

1.2. Количественное определение состава синтетических пищевых красителей в БАД с помощью ТСХ и спектрофотометрии

1.2.1. Обработка образца

Водорастворимые БАД

Твердый образец

Навеску 5,0 г образца переносят в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Добавляют примерно 50 куб. см кипящей воды и встряхивают до полного растворения образца. Переносят окрашенные соединения на полиамидный порошок согласно п. 1.2.2.

Жидкий образец

Отбирают 50,0 куб. см образца и переносят окрашенные соединения на полиамидный порошок согласно п. 1.2.2.

БАД с высоким содержанием жира

Обезжиривают образец при помощи петролейного эфира. Навеску 5,0 г переносят в центрифужную пробирку. Добавляют приблизительно 20 куб. см петролейного эфира и перемешивают при помощи стеклянной палочки. Декантируют петролейный эфир. Повторяют до полного обезжиривания. Если образец не содержит жира, его переносят в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см кипящей воды и далее действуют согласно п. 1.2.2.

БАД с высоким содержанием крахмала и белка

Навеску 5,0 г БАД переносят в центрифужную пробирку. Добавляют 25 куб. см кипящей воды и перемешивают. Добавляют 25 куб. см смеси метанол — 5%-ный аммиак, 95:5. Проверяют pH (величина pH должна составлять приблизительно 9). Тщательно перемешивают. Оставляют образец в холодильнике примерно на 15 мин. Центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 10 мин. Декантируют чистый раствор в плоскодонную колбу емкостью 250 куб. см. Добавляют 5 куб. см воды в центрифужную пробирку, перемешивают и добавляют 10 куб. см смеси метанол — 25%-ный аммиак, 95:5. Перемешивают и центрифугируют, как описано выше. Повторяют указанную процедуру до полной экстракции окрашенных соединений. Объединяют все экстракты. Упаривают объединенный экстракт на водяной бане приблизительно до объема 25 куб. см (чтобы удалить весь метанол). Добавляют 25 куб. см воды и нагревают раствор. Далее действуют согласно п. 1.2.2.

1.2.2. Перевод красителей на полиамидный порошок

Используя раствор уксусной кислоты в метаноле (1:1 по объему) или водный аммиак, доводят pH образца до 4 — 5. Добавляют 1 г полиамидного порошка к теплому раствору. Перемешивают в течение 1 минуты. Дают порошку осесть. Проверяют исчезновение окраски раствора. Если окраска сохранилась, добавляют еще некоторое количество полиамидного порошка и перемешивают. (Синтетические красители полностью абсорбируются на полиамиде, натуральные красители — лишь частично. Свойство красителей абсорбироваться на полиамидной матрице можно использовать для определения наличия натурального красителя в образце.) Полиамидный порошок: SC6 «Machery Nagel & Со» Duren, размер пор 0,05 — 0,16 мкм.

Перемешивают и переносят суспензию на стеклянную колонку. Промывают плоскодонную колбу тремя порциями по 10 куб. см горячей воды и переносят на колонку. Колонку промывают 10 куб. см горячей воды и затем 3 х 5 куб. см метанола. Стеклянная колонка: длина — 20 см, внутренний диаметр — 30 мм.

1.2.3. Элюирование и концентрирование индивидуальных красителей

Помещают круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см под колонку и элюируют красители с полиамида растворителем (метанол — 25%-ный аммиак, 95:5 (по объему)) порциями по 5 мл со скоростью 2 мл/мин. до тех пор, пока полиамид не обесцветится. Упаривают элюат досуха на вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Добавляют 1 — 2 куб. см смеси метанол — 25%-ный аммиак, 95:5. Используют полученный раствор для разделения красителей методом ТСХ.

1.2.4. Разделение методом ТСХ

Используя микрошприц или микропипетку, наносят на хроматографическую пластинку (целлюлоза, толщина слоя 0,10 мм, DC-Fertigplatten, Merck Art 5716 без флуоресцентного индикатора) полосу образца, полученного по п. 1.2.3, длиной около 3 см. Объем пробы 50 — 100 мкл. Высушивают нанесенный образец феном.

ТСХ проводят в одной из трех систем растворителей:

2,5%-ный водный раствор цитрата натрия (C6H5Na3O7 x 2H2O) — 25%-ный аммиак — метанол, 80:20:12 (по объему);

1-пропанол — этилацетат — вода, 6:1:3 (по объему);

трет-бутанол — пропионовая кислота — вода, 50:12:38 (по объему).

Соскабливают разделившиеся окрашенные зоны с пластинки в различные центрифужные пробирки. Доводят аммиаком pH растворов до 7. Добавляют по 5 или 10 куб. см воды, закрывают пробками и встряхивают в течение 1 мин. Удаляют пробки и центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 10 мин. Декантируют супернатант в другие центрифужные пробирки и повторяют центрифугирование.

1.2.5. Количественное определение

Определяют поглощение чистых растворов на спектрофотометре при характерных для каждого красителя длинах волн максимума поглощения. Для контроля чистоты красителя и подтверждения структуры красителя снимают спектр образца и сравнивают со спектром стандартного раствора или библиотечным спектром.

1.2.5.1. Расчет содержания основного вещества в красителях

Содержание основного вещества X, определенное спектрофотометрически, рассчитывают по формуле:

где:

D — оптическая плотность исследуемого раствора;

V — объем, куб. см;

Э — коэффициент светопоглощения эталона настоящей методики;

g — масса, мг.

2. Определение синтетических пищевых красителей методом ВЭЖХ

2.1. Условия ОФ ВЭЖХ

Колонка: Kromasil С18, 5 мю м, 250 х 4,6 мм ID.

Элюент: 10 мМ фосфатный буфер, pH 4,2, — ацетонитрил, 80:20 об. %.

Скорость подачи элюента: 1 куб. см/мин.

Детектирование: UV-Vis 500 нм (красные), 450 нм (желтые) и 600 нм (синие СПК).

2.2. Условия ион-парной ОФ ВЭЖХ

Колонка: Kromasil С18, 5 мю м, 250 х 4,6 мм ID.

Элюент: 10 мМ тетрабутиламмоний фосфат, 10 мМ фосфатный буфер, pH 4,2, — ацетонитрил, 55:45 об. %.

Скорость подачи элюента: 0,9 куб. см/мин.

Детектирование: UV-Vis 500 нм (красные), 450 нм (желтые) и 600 нм (синие СПК).

2.3. Подготовка стандартных растворов

Стандартные растворы синтетических пищевых красителей готовят путем растворения точных навесок СПК с известной концентрацией основного вещества в мерных колбах дистиллированной водой. Эритрозин (Е 127) растворяют в метаноле. Градуировочные графики строят в координатах S (площадь пика) — С (концентрация СПК), г/л, в интервале концентраций 0,002 — 0,01 г/л.

2.4. Пробоподготовка

Соки и сокосодержащие БАД (10 куб. см) разбавляют дистиллированной водой в колбе объемом 100 куб. см, пробы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Концентраты соков (10 г) разбавляют дистиллированной водой в колбе объемом 250 куб. см, пробы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

Глава 5. Методы исследований безопасности

I. Методы определения микотоксинов

Для обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов используют следующие методы:

— двумерную и одномерную ТСХ (для серийных определений);

— ВЭЖХ с УФ-фотометрическим и флуориметрическим детектированием (для серийных и арбитражных анализов).

Специфическое оборудование и материалы

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Ротационный испаритель с ловушкой, модель ИР-2М (завод «Химлабприбор»), или аналогичный.

Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Облучатель настольный ультрафиолетовый, снабженный светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 365 нм.

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5 куб. см/мин.; колонка и предколонка с силикагелем или с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18), или с силикагелем, химически связанным с алкилнитрилом, с размером частиц 5 мкм; длина колонок — 25 см, предколонок — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см; ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны; флуориметрический детектор; регистрирующий потенциометр (самописец) или интегратор.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длине волны 275 — 360 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%.

Кюветы кварцевые с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150 °С.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения 4000 об./мин., стаканы центрифужные стеклянные вместимостью 200 куб. см.

Насос водоструйный лабораторный, ГОСТ 25336.

Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например стеклянный четырехугольный сосуд размером 195 х 195 х 200 мм завода «Дружная горка».

Пластинки для ТСХ «Силуфол» размером 15 х 15 или 20 х 20 см (Чехия) или подобные.

Распылитель стеклянный с грушей.

Воронки делительные ВД 2-250 или ВД 2-500, ГОСТ 25336.

Колонки стеклянные хроматографические 230 х 15 и 300 х 22 мм.

Силикагель L для колоночной хроматографии с размером частиц 100 — 160 мкм, «Lachema» (Чехия).

Флоризил, 60 — 100 меш., «Merk» (Германия).

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-71.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3543-74.

Бензол, ч.д.а., ГОСТ 5955-75.

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-73.

1,4-Диоксан, ч.д.а., ГОСТ 10455.

Изопропиловый спирт (пропанол-2), ч.д.а., ТУ 6-09-402-76.

Метанол, ч., ГОСТ 6995-77.

Спирт этиловый ректификат, ТУ 6-09-1710-77.

Толуол, ч., ГОСТ 5789-78.

Хлороформ медицинский, ГОСТ 3160-51, или технический, ГОСТ 20015.

Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), ч., ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый медицинский, ГОСТ 6265-52.

Кислота азотная, ч.д.а., ГОСТ 4461-67.

Кислота лимонная, 1-водная, ч.д.а., ГОСТ 3652-29.

Кислота муравьиная, ч.д.а., ГОСТ 5848-73.

Кислота серная, ч., ГОСТ 4204-77.

Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118.

Кислота уксусная, ч.д.а., ГОСТ 61-75.

Алюминия оксид нейтральный по Брокману 11 для колоночной хроматографии, «Reanal» (Венгрия), номер по каталогу 01125, или алюминия оксид для хроматографии, ТУ 6-09-3916-75.

Алюминий хлористый, 6-водный, х.ч., ГОСТ 3759-75.

Бензидин, ч.д.а., раствор в муравьиной кислоте концентрацией 5 г/куб. дм.

Йод, ч., ГОСТ 4159, раствор в этиловом эфире концентрацией 250 г/куб. дм.

Калий хлористый, х.ч., ГОСТ 4234-77.

Калий железосинеродистый 3-водный, х.ч., ГОСТ 4207, водный раствор концентрацией 150 г/куб. дм (раствор Карреза I).

Цинк уксуснокислый, 2-водный, х.ч., ГОСТ 5823, водный раствор концентрацией 300 г/куб. дм (раствор Карреза II).

Калий марганцовокислый, х.ч., ГОСТ 20490, водный раствор концентрацией 15 г/куб. дм.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-66.

Натрий углекислый кислый (гидрокарбонат), х.ч., ГОСТ 4201-79, водный раствор концентрацией 50 г/куб. дм.

Прочный синий В-соль (диазоль синий С) для гистологии («Chemapol», Чехия), водный раствор концентрацией 10 г/куб. дм.

Свинец уксуснокислый, х.ч., ГОСТ 1027-67, водный раствор концентрацией 150 г/куб. дм.

Серебро азотнокислое, ч., ГОСТ 1277, водный раствор концентрацией 250 г/куб. дм.

Уголь активированный, Р.72.270.3.

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

Приготовление и хранение стандартных растворов микотоксинов

Чистоту и аутентичность стандартных препаратов микотоксинов определяют с помощью УФ-спектрофотометрии (табл. 47) и хроматографических методов (ТСХ, ВЭЖХ).

Расчет концентрации стандартных растворов проводят по данным УФ-спектрофотометрии. Данные о коэффициентах молярной экстинкции микотоксинов в максимумах поглощения в УФ-спектре приведены в табл. 47.

Таблица 47

КОЭФФИЦИЕНТЫ МОЛЯРНОЙ ЭКСТИНЦИИ МИКОТОКСИНОВ

<*> Длины волн, используемые для определения концентрации стандартных растворов.

<**> Растворитель, используемый для определения концентрации стандартного раствора.

<***> Для охратоксина А используется смесь бензол — уксусная кислота (99:1).

Приготовление и расчет концентрации стандартных растворов микотоксинов

Для приготовления стандартных растворов микотоксинов рекомендуется использовать растворители, очищенные перегонкой. Данные о растворителях и концентрациях стандартных и рабочих растворов микотоксинов приведены в табл. 48.

Таблица 48

СТАНДАРТНЫЕ И РАБОЧИЕ РАСТВОРЫ МИКОТОКСИНОВ

В мерную колбу вместимостью 100 или 250 куб. см помещают навеску микотоксина (1 — 10 мг), взятую с точностью до 0,01 мг, приливают нужное количество ацетонитрила согласно таблице 33 или 20 — 30 куб. см бензола, тщательно перемешивают до полного растворения вещества, доводят бензолом до метки и измеряют оптическую плотность по данным УФ-спектрофотометрии против соответствующего растворителя.

При необходимости измерения концентрации стандартного раствора в метаноле 3 куб. см бензольного или бензол-ацетонитрильного раствора переносят в чистую пробирку, растворитель упаривают в токе азота досуха, к остатку добавляют 3 куб. см метанола и измеряют оптическую плотность полученного метанольного раствора.

Рассчитывают концентрацию микотоксина в стандартных растворах по формуле:

где:

С — концентрация исследуемого раствора, мкг/куб. см или нг/мкл;

D — оптическая плотность раствора;

М — молекулярная масса микотоксина (табл. 47);

Е — коэффициент молярной экстинкции (табл. 47);

L — толщина слоя раствора, см.

Рабочие растворы стандартов готовят путем разбавления соответствующих стандартных растворов, для чего необходимую аликвоту рабочего раствора микотоксина доводят до соответствующего объема бензолом или смесью бензол — ацетонитрил согласно табл. 48. Например, для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 с концентрациями 1,0, 0,5, 0,4 и 0,2 мкг/куб. см соответственно в мерную колбу 50 куб. см помещают 5,0 куб. см стандартного раствора афлатоксина B1, 2,5 куб. см раствора B2, 2,0 куб. см раствора G1 и 1,0 куб. см раствора G2, затем доводят до метки смесью бензол — ацетонитрил (98:2). Для приготовления стандартного раствора афлатоксина M1 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см в мерную колбу на 50 куб. см помещают 1 куб. см стандартного раствора афлатоксина M1 и доводят до метки смесью бензол — ацетонитрил (9:1).

Если используют расфасованные во флаконы кристаллические стандарты микотоксинов, полученные от фирм-поставщиков, поступают следующим образом: во флакон с веществом добавляют, согласно табл. 48, необходимое количество растворителя и тщательно перемешивают до полного растворения микотоксинов, содержимое флакона количественно переносят в мерную колбу с объемом, необходимым для получения концентрации стандартного раствора микотоксина, указанной в соответствующей колонке табл. 48. Флакон тщательно промывают несколькими порциями растворителя, каждый раз перенося содержимое флакона в мерную колбу, затем доводят объем до метки растворителем. Измеряют концентрацию полученного раствора по данным УФ-спектрофотометра, как описано выше.

Хранение стандартных растворов микотоксинов

Стандартные растворы микотоксинов следует хранить в стеклянной посуде с притертыми пробками в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и использовать для приготовления рабочих стандартных растворов.

Перед употреблением в работе стандартные растворы следует довести до комнатной температуры и только после этого открывать пробки.

В процессе хранения стандартных растворов вследствие испарения растворителей могут происходить некоторые изменения их концентраций. По этой причине следует проводить их систематический контроль (1 — 2 раза в квартал), как описано выше.

1. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания афлатоксинов в БАД на зерновой и зернобобовой основе с помощью тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии

Экстракция

Отобранную пробу измельчают в течение 1 — 2 мин. в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного БАД помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 куб. см, тщательно перемешивают с 25 куб. см 10% раствора хлорида натрия. Добавляют 0,0125 куб. см стандартного раствора афлатоксина В2 (внутренний стандарт), что соответствует загрязнению пробы афлатоксином на уровне 1 ПДК, перемешивают. Добавляют 100 куб. см ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбирают 50 куб. см фильтрата.

Очистка экстракта

К 50 куб. см фильтрата добавляют 20 куб. см 15% раствора ацетата свинца и 30 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 10 мин. в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 куб. см фильтрата. Встряхивают в делительной воронке с гексаном (2 х 30 куб. см), каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Водно-ацетоновый слой экстрагируют хлороформом (1 раз 40 куб. см, 2 раза 30 куб. см смеси хлороформ — ацетон, 3:1). Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 куб. см, для удаления воды добавляют 5 — 7 г безводного сульфата натрия, встряхивают и оставляют на 30 мин. в темноте. Высушенный раствор фильтруют через химическую воронку с комочком ваты в грушевидную колбу, сульфат натрия промывают 10 куб. см хлороформа, добавляя смыв к фильтрату. Хлороформный экстракт упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 0,4 куб. см смеси бензол — ацетонитрил (98:2) — раствор А и анализируют с помощью ТСХ.

Обнаружение афлатоксинов с помощью одномерной ТСХ

Пластинку для ТСХ («Силуфол») размечают тонкими карандашными линиями в соответствии с рис. 28. На горизонтальной линии, проведенной в 1,5 см от нижнего края пластинки, наносят с помощью микрошприца в 2 см друг от друга по 0,002, 0,005 и 0,01 куб. см рабочих растворов афлатоксина B1 (2, 5 и 10 нг соответственно) и афлатоксина В2 (1, 2,5 и 5 нг соответственно) или рабочего раствора смеси афлатоксинов В1, В2, G1 и G2. На расстоянии 1 см между пятнами стандартов наносят 0,01 и 0,02 куб. см раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир — метанол — вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку до достижения фронтом растворителя линии, проведенной в 1 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 5 мин. и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном наличии афлатоксинов в БАД. Наличие пятна внутреннего стандарта свидетельствует о правильном извлечении афлатоксинов из пробы.

Тесты, подтверждающие наличие афлатоксинов в БАД

Тест первый

Для подтверждения наличия афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился с синего (B1, B2) или сине-зеленого (G1, G2) на желтый, а цвет флуоресценции пятен экстракта на желтый не изменился, то афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в БАД.

Тест второй

На стеклянную пластинку 20 х 20 см наносят 2 — 4 куб. см 5 — 10%-ного раствора йода в эфире, распределяют его по всей поверхности и дают испариться. Над ТСХ-пластинкой на расстоянии 0,5 — 1 см помещают пластинку с тонким слоем йода и подвергают ее воздействию паров йода в течение 1 — 2 мин. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сохранение цвета и интенсивности флуоресценции пятен стандартов и соответствующих им пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в БАД.

Подтверждение наличия афлатоксинов и количественное определение афлатоксина В1 с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 0,02 куб. см раствора А, в правом верхнем углу наносят 0,005 куб. см рабочего раствора смеси афлатоксинов или рабочих растворов афлатоксинов B1 и В2. В левом нижнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от левого края и 1,5 см от нижнего края пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 куб. см рабочего раствора смеси афлатоксинов или рабочих растворов афлатоксинов B1 и В2. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир — метанол — вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин., затем развитие пластинки проводят во втором направлении в системе хлороформ — ацетон — вода (90:10:1). После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее извлекают, сушат на воздухе и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение афлатоксинов в растворе А производят аналогично описанному выше. В случае подтверждения наличия афлатоксинов сравнивают интенсивность флуоресценции пятна стандарта B1 с пятном афлатоксина B1 в растворе А и определяют количество вещества в пятне. Расчет содержания афлатоксина B1 в образце производят по формуле:

где:

С — концентрация афлатоксина B1 в образце, мг/кг;

— объем водно-ацетоновой смеси для экстракции, куб. см (125 куб. см);

— объе водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб. см);

— объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата свинца, куб. см (100 куб. см);

— объем водно-ацетонового фильтрата после очистки ацетатом свинца, куб. см (80 куб. см);

— объем экстракта перед ТСХ (раствор А), куб. см (0,4 куб. см);

— объем экстракта (раствор А), наносимый на пластинку, куб. см (0,02 куб. см);

M — навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

m — масса афлатоксина В1 в куб. см экстракта, оцененная по ТСХ, нг;

К — степень извлечения афлатоксина B1 по табл. 50.

Пр приведенны скобка объема навеска формула содержания афлатоксина B1 выражается следующим образом:

Если интенсивность флуоресценции афлатоксина B1 в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,006 куб. см рабочего раствора (6 нг афлатоксина В1), на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем ), либо разбавить раствор А смесью бензол — ацетонитрил (98:2) (увеличить объем ), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

По интенсивности флуоресценции внутреннего стандарта можно оценить степень извлечения афлатоксинов из пробы.

Очистка экстракта перед ВЭЖХ

В случае анализа экстракта на содержание афлатоксинов методом ВЭЖХ необходимо произвести его очистку с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки размером 230 х 5 мм помещают кусочек ваты, присыпают безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), заливают суспензию 2 г силикагеля в бензоле и, не давая бензолу стечь (колонка закрыта снизу), насыпают слой безводного сульфата натрия (20 мм). Дают бензолу стечь и на колонку наносят экстракт образца (раствор А). Грушевидную колбу из-под экстракта ополаскивают смесью бензол — ацетонитрил (98:2) 2 раза по 0,3 куб. см и раствор наносят на колонку, бензольный элюат отбрасывают. Колонку элюируют 60 куб. см смеси хлороформ — ацетон (9:1), элюат фильтруют через бумажный или капроновый фильтр, упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в 0,4 куб. см смеси бензол — ацетонитрил (98:2) (очищенный раствор А) и анализируют с помощью ВЭЖХ.

Обнаружение и количественное определение афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 с помощью ВЭЖХ

Условия и параметры хроматографического анализа приведены в табл. 49.

Таблица 49

УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АФЛАТОКСИНОВ

Время удерживания токсина на колонке при конкретных условиях анализа целесообразно выражать через коэффициент ее емкости, средние значения которого приведены в данной табл. 49. Коэффициент емкости характеризует удерживание анализируемого компонента (афлатоксина) в единицах мертвого объема колонки и определяется по формуле:

где:

К’ — коэффициент емкости данной колонки;

— мертвый объем системы, соответствующий времени выхода растворителя;

— время удерживания афлатоксина.

Рекомендуется использовать перегнанные метанол, толуол, этилацетат и дистиллированную воду. Эфир перед использованием пропускают через колонку с оксидом алюминия. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.

Для достижения необходимого предела обнаружения при ВЭЖХ афлатоксинов групп В, G и М с использованием подвижной фазы эфир — метанол — вода необходимо заполнить кювету флуориметрического детектора силикагелем типа «Силасорб 600» с размером частиц 5 — 8 мкм.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 360 нм (или устанавливают соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуориметрическим детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 400 или 420 нм. Входное напряжение самописца — 10 мВ, чувствительность детектора устанавливают таким образом, чтобы 1 — 2 нг афлатоксина В1 соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы.

Для калибровки прибора по флуориметрическому детектору в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,001 куб. см рабочего раствора смеси стандартов для ВЭЖХ или по 0,001 куб. см рабочих растворов афлатоксинов В1 и В2 (соответствует 1,0 нг афлатоксина В1, 0,5 нг — В2, 0,4 нг — G1 и 0,2 нг — G2) и затем 0,002 куб. см рабочего раствора (2,0 нг — В1, 1,0 нг — В2, 0,8 нг — G1 и 0,4 нг — G2). Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика. Рассчитывают калибровочные коэффициенты для афлатоксинов по следующей формуле:

где:

К — калибровочный коэффициент для афлатоксинов В1, G1 или G2;

С — концентрация афлатоксинов В1, G1 или G2 в рабочих растворах, мкг/куб. см;

— концентрация афлатоксина В2 (внутренний стандарт) в рабочем растворе, мкг/куб. см;

— высота пика афлатоксина В2 (внутренний стандарт), мм;

h — высота пика афлатоксинов B1, G1 или G2, мм.

При высоких уровнях загрязнения БАД афлатоксинами (свыше 0,1 мг/кг по афлатоксину В1) возможно использование также ВЭЖХ с УФ-детектором. Калибровку прибора по УФ-детектору проводят так же, как в случае флуориметрического детектора, вводя в петлю инжектора 0,010, 0,015 и 0,020 куб. см рабочего раствора (соответствует 10, 15 и 20 нг афлатоксина В1; 5, 7,5 и 10 нг афлатоксина В2; 4, 6 и 8 нг — G1; 2, 3 и 4 нг — G2).

В инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 0,02 куб. см раствора А (20 мкл). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с афлатоксином B1 (B2, G1, G2), определяют его высоту (h).

Расчет концентрации афлатоксинов проводят по формуле:

где:

С — концентрация афлатоксина в БАД, мг/кг;

K — калибровочный коэффициент для афлатоксинов В1 (или G1, G2);

h — высота пика афлатоксинов B1 (или G1, G2);

— высота пика афлатоксина В2 (внутренний стандарт), внесенный в пробу, куб. см;

— концентрация афлатоксина В2 (внутренний стандарт) в стандартном растворе, мкг/куб. см (см. табл. 48);

V — объем стандартного раствора афлатоксина В2 (внутренний стандарт), внесенный в пробу, куб. см;

m — навеска образца, взятая для анализа, г.

Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого в инжектор раствора экстракта или разбавляя раствор очищенного экстракта смесью бензол — ацетонитрил (98:2). При необходимости дополнительного подтверждения проводят совместную ВЭЖХ экстракта со стандартом афлатоксинов.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения, по данным авторов методов анализа микотоксинов В1 и M1, приведены в табл. 50, в которой приведены также относительные внутрилабораторные () и межлабораторные () среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения микотоксинов.

Таблица 50

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ B1

2. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания охратоксина А

Экстракция

Навеску 25 г отобранной измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 куб. см, добавляют 12,5 куб. см 1% раствора уксусной кислоты в воде и 125 куб. см хлороформа. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см, отбирают 50 куб. см фильтрата.

Очистка экстракта

В делительную воронку переносят 50 куб. см фильтрата, добавляют 35 куб. см 3% раствора гидрокарбоната натрия в смеси метанол — вода (1:4). Встряхивают, после разделения слоев верхний водный слой отделяют. Нижний хлороформный слой экстрагируют (2 раза по 35 куб. см) водно-метанольным раствором гидрокарбоната натрия. Объединенные водные экстракты встряхивают в делительной воронке с хлороформом (2 х 25 куб. см), каждый раз после разделения слоев отбрасывая нижний хлороформный слой. Водный экстракт подкисляют раствором серной кислоты в воде с концентрацией 2 моль/куб. дм до pH 2 — 3 по универсальной индикаторной бумаге (примерно 9,5 — 10 куб. см раствора серной кислоты). Подкисленный водный раствор немедленно экстрагируют в делительной воронке хлороформом (1 раз по 50 куб. см и 2 раза по 25 куб. см). Объединенные хлороформные экстракты сушат безводным сульфатом натрия (10 — 12 г) в течение 0,5 ч. Раствор порциями фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу, осушитель промывают 15 куб. см хлороформа, который также фильтруют в ту же колбу, и раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 — 45 °С. Остаток растворяют в 0,4 куб. см смеси бензол — уксусная кислота (99:1) для проведения ТСХ анализа или в 0,4 куб. см метанола для проведения анализа с помощью ВЭЖХ (раствор А).

Обнаружение и количественное определение охратоксина А с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слой силикагеля, согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 куб. см раствора А, в правом верхнем углу наносят 0,002 и 0,004 куб. см рабочего раствора охратоксина А (10 и 20 нг соответственно). В левом нижнем углу пластинки наносят 0,001, 0,003 и 0,005 куб. см рабочего раствора охратоксина А (5, 15 и 25 нг охратоксина А соответственно).

Пластинку помещают в хроматографическую камеру для ТСХ со смесью эфир — гексан — хлороформ — муравьиная кислота (30:30:30:1) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки.

Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят элюирование во втором направлении в системе толуол — этилацетат — муравьиная кислота (55:35:10). После достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3,5 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе.

Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. В этих условиях пятна охратоксина А флуоресцируют зелено-синим цветом. Пластинку опрыскивают насыщенным раствором карбоната натрия в воде и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Цвет флуоресценции охратоксина A должен измениться на синий. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цветам флуоресценции и хроматографической подвижности в двух системах растворителей пятнам стандарта охратоксина А, свидетельствует о наличии охратоксина А в образце. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта охратоксина А с интенсивностью флуоресценции пятна охратоксина А в образце, оценивают количество нг охратоксина А в нанесенном на пластинку объеме раствора А.

Концентрацию охратоксина А в образце рассчитывают по формуле:

где:

С — концентрация охратоксина А в образце, мг/кг;

— объем хлороформа для экстракции образца, куб. см (125 куб. см);

— объем хлороформного фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб. см);

— объем экстракта для ТСХ (раствор А), куб. см (0,4 куб. см);

— объем экстракта (раствор А), нанесенный на пластинку, куб. см (0,02 куб. см);

m — количество охратоксина А в пятне, оцененное по ТСХ, нг;

М — навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

К — степень извлечения охратоксина А по табл. 51.

При приведенных в скобках объемах и навесках формула концентрации охратоксина А в образце выражается следующим образом:

Если интенсивность флуоресценции пятна охратоксина А в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,005 куб. см стандартного раствора (25 нг охратоксина А), то на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем ), либо разбавить раствор А смесью бензол — уксусная кислота, 99:1 (увеличить объем ), повторно провести ТСХ и внести соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Обнаружение и количественное определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ

Приготовление стандартного раствора охратоксина А для ВЭЖХ

0,2 куб. см стандартного раствора охратоксина А концентрацией 50 мкг/куб. см помещают в мерную колбу на 10 куб. см, растворитель удаляют в токе азота, остаток растворяют в метаноле и доводят метанолом до метки. Получают стандартный раствор охратоксина А для ВЭЖХ концентрацией 1 мкг/куб. см (1 нг/мкл).

Количественное определение охратоксина А с помощью обращеннофазной ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза: метанол — вода — уксусная кислота (75:25:1,5), расход подвижной фазы — 1 куб. см/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 330 — 333 нм (или устанавливают соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуориметрическим детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с границей пропускания от 415 до 420 нм. Входное напряжение самописца 10 мВ, чувствительность детектора устанавливают таким образом, чтобы 5 нг охратоксина А соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002, 0,003 и 0,005 куб. см (2, 3 и 5 нг) рабочего раствора охратоксина А для ВЭЖХ. Для каждого количества введенного охратоксина А определяют высоту пика. При описанных выше условиях коэффициент емкости (К’) для охратоксина А составляет примерно 1,9 — 2,5. В инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 0,02 куб. см раствора охратоксина А в метаноле. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, определяют его высоту (h).

Расчет концентрации охратоксина А в образце производят по формуле:

где:

С — концентрация охратоксина А в образце, мг/кг;

— объем хлороформа для экстракции образца, куб. см (125 куб. см);

— объем хлороформного фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб. см);

— объем экстракта (раствор А) перед ВЭЖХ, куб. см (0,4 куб. см);

— объем экстракта (раствор А), введенный в хроматограф, куб. см (0,02 куб. см);

m — масса стандарта охратоксина А, введенного в хроматограф,нг;

— высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

h — высота пика охратоксина из образца, мм;

М — навеска образца для анализа, г (25 г);

К — степень извлечения охратоксина А по табл. 51.

Если пик охратоксина А в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно после разбавления экстракта (раствор А) метанолом (после увеличения объема ).

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения, по данным авторов методов анализа охратоксина А, приведены в табл. 51, в которой приведены также относительные внутрилабораторные () и межлабораторные () среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения микотоксинов.

Таблица 51

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОХРАТОКСИНА А

3. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в БАД на зерновой основе

Экстракция

Навеску 25 г измельченной отобранной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 куб. см, добавляют 125 куб. см смеси ацетонитрил — вода (84:16). Встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр. Отбирают 25 куб. см фильтрата для анализа на дезоксиниваленол и 50 куб. см фильтрата для анализа на зеараленон.

Обнаружение, идентификация и определение содержания дезоксиниваленола в экстракте

Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г порошка активированного угля и сверху — слой 0,75 г оксида алюминия.

Над слоем оксида алюминия помещают кусочек ваты. Осторожно наливают в колонку 25 куб. см экстракта, соответствующие 5 г исходного образца. Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (84:16).

Объединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 куб. см, бумажный фильтр промывают 5 — 10 куб. см изопропилового спирта в ту же колбу и фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5 — 7 куб. см. Добавляют около 20 куб. см изопропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 0,2 куб. см смеси бензол — ацетонитрил (5:1) и плотно закрывают стеклянной пробкой (раствор А). Для обращеннофазной ВЭЖХ остаток растворяют в 0,2 куб. см ацетонитрила (раствор A1).

Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью одномерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают в соответствии с рис. 28. На линию, проведенную в 1,5 см от нижнего края пластинки, с помощью микрошприца наносят 0,002, 0,005, 0,01 и 0,02 куб. см раствора А. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 0,002, 0,004, 0,006 куб. см стандартного раствора дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг дезоксиниваленола). Пластинку помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан — ацетон (3:2) на расстояние 15 см. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 3 — 4 мин. и опрыскивают 10% раствором хлористого алюминия в этаноле. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5 — 7 мин. при 105 °С, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией с Rf 0,25 — 0,30. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту дезоксиниваленола, свидетельствует о возможном наличии этого токсина в образце. Для количественного определения сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов дезоксиниваленола с интенсивностью флуоресценции их пятен в образце, визуально оценивая количество нг токсинов в нанесенных на пластинку объемах раствора А. Концентрацию дезоксиниваленола в образце рассчитывают по формуле:

где:

— объем раствора А, куб. см (0,2 куб. см);

— объем раствора А, нанесенный на пластинку, куб. см;

m — масса дезоксиниваленола в куб. см раствора А, оцененная визуальным сравнением со стандартом на ТСХ-пластинке, нг;

М — аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5 г для пшеницы, 3 г для кукурузы);

К — степень извлечения дезоксиниваленола по табл. 54.

Если интенсивность флуоресценции пятна дезоксиниваленола в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола соответствующего 0,006 куб. см стандартного раствора, то следует разбавить раствор А смесью бензол — ацетонитрил (5:1), т.е. увеличить объем РИС, внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу. Окончательное заключение о наличии и уровне загрязнения образца дезоксиниваленолом принимается только на основе данных двумерной ТСХ.

Подтверждение наличия и количественное определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 30. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 куб. см раствора А. В левом нижнем углу пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 куб. см стандартного раствора дезоксиниваленола, 0,002 и 0,005 куб. см раствора А. В верхнем правом углу пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 куб. см стандартного раствора дезоксиниваленола, 0,01 и 0,02 куб. см раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан — ацетон (3:2) и элюируют ее в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнего края, пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во втором направлении смесью хлороформ — ацетон — изопропиловый спирт (78:12:10). Для элюирования пластинки во втором направлении можно также использовать смесь: эфир — гексан — изопропиловый спирт — вода (77:18:4,5:0,5). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнею края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе.

Обнаружение и количественное определение проводят аналогично описанному выше.

Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ

Условия и параметры анализа дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ приведены в табл. 52.

Таблица 52

УСЛОВИЯ АНАЛИЗА ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА

Расход подвижной фазы 1,0 куб. см/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливают на длину волны 220 — 224 нм, шкала чувствительности 0,01 или 0,005 е.о.п. Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят по 0,002 и 0,004 куб. см стандартных растворов, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола (при обращеннофазной ВЭЖХ 1 куб. см стандартного раствора дезоксиниваленола в смеси бензол — ацетонитрил (5:1), упаривают досуха в токе азота и растворяют в 1 куб. см ацетонитрила).

Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. В инжектор хроматографа вводят 10 мкл раствора А (или A1). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом дезоксиниваленола, определяют его высоту (h). Расчет концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по формуле:

где:

С — концентрация дезоксиниваленола в образце, мг/кг;

— объем раствора А, куб. см (0,2 куб. см);

— объем раствора А, внесенный в хроматограф, куб. см (0,01 куб. см);

m — масса стандарта дезоксиниваленола, введенная в хроматограф, нг;

М — аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5 г);

— высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

h — высота пика дезоксиниваленола из образца, мм;

К — степень извлечения дезоксиниваленола — по табл. 54.

Если пик дезоксиниваленола в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора A (A1) смесью бензол — ацетонитрил (при нормальнофазной ВЭЖХ) или ацетонитрилом (при обращеннофазной ВЭЖХ), т.е. после увеличения объема РИС.

Обнаружение, идентификация и определение содержания зеараленона

Очистка экстракта

В делительную воронку на 500 куб. см помещают 50 куб. см фильтрата (раздел «Экстракция»), добавляют 50 куб. см гексана (или гептана), насыщенного ацетонитрилом. Встряхивают, после разделения слоев отбрасывают верхний гексановый слой. Нижний ацетонитрильный слой дважды встряхивают с 30 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. К обезжиренному ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 150 куб. см дистиллированной воды и 60 куб. см бензола. Встряхивают и после разделения слоев отделяют верхний бензольный слой. Если полного расслоения жидкостей не происходит, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и смесь еще раз слегка встряхивают. Водный слой экстрагируют еще дважды 30 куб. см бензола, бензольные слои объединяют и сушат безводным сульфатом натрия.

После фильтрования упаривают в грушевидной колбе на 100 куб. см на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45 °С. Сульфат натрия промывают 10 куб. см бензола в ту же грушевидную колбу и упаривают раствор досуха. Остаток растворяют в 0,5 куб. см бензола — раствор В.

Обнаружение и идентификация зеараленона с помощью одномерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают в соответствии с рис. 28. На линию, проведенную в 1,5 см от нижнего края пластинки, с помощью микрошприца наносят 0,005 и 0,01 куб. см раствора В. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 0,005, 0,01 и 0,02 куб. см рабочего раствора зеараленона (50, 100 и 200 нг зеараленона соответственно). Аналогично готовят вторую пластинку «Силуфол». Обе пластинки помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан — ацетон (7:3). Пластинки извлекают, сушат на воздухе 3 — 4 мин. Для обнаружения пятен зеараленона на первой пластинке используют опрыскивание 10% раствором хлорида алюминия в этиловом спирте с последующим нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100 — 105 °С в течение 10 мин. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по цвету флуоресценции (синий) и хроматографической подвижности пятнам стандартов зеараленона, свидетельствует о возможном наличии зеараленона в образце.

Для подтверждения наличия зеараленона вторую ТСХ-пластинку опрыскивают 1% раствором прочной синей В-соли или прочной фиолетовой В-соли в дистиллированной воде, затем пластинку немедленно опрыскивают 5%-ным раствором углекислого натрия до появления красно-бордовой окраски пятен стандарта зеараленона. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету и хроматографической подвижности стандартам зеараленона, подтверждает наличие зеараленона в образце.

Количественное определение зеараленона с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис. 30. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 куб. см раствора В. В правом верхнем углу наносят 0,003 и 0,007 куб. см рабочего раствора зеараленона, 0,01 и 0,02 куб. см раствора В; в левом нижнем углу наносят 0,005 и 0,01 куб. см рабочего раствора зеараленона, 0,002 и 0,005 куб. см раствора В. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан — ацетон (7:3) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят хроматографию во втором направлении в системе толуол — этилацетат — хлороформ — 85%-ная муравьиная кислота (45:25:25:5) до достижения карандашной линии, проведенной в 5,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат и обнаруживают пятна по флуоресценции после обработки раствором хлорида алюминия, как описано выше. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта зеараленона с интенсивностью флуоресценции пятна зеараленона в экстракте (раствор В), определяют количество нг зеараленона в экстракте.

Содержание зеараленона в образце рассчитывают по формуле:

где:

С — концентрация зеараленона в образце, мг/кг;

— объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции, куб. см (125 куб. см);

— объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб. см);

— объем очищенного экстракта перед ТСХ (раствор В), куб. см (0,5 куб. см);

— объем очищенного экстракта (раствор В), наносимый на пластинку, куб. см (0,02 куб. см);

М — навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

m — масса зеараленона в куб. см очищенного экстракта, оцененная по ТСХ, нг;

К — степень извлечения зеараленона по табл. 54.

При приведенных в скобках объемах и навесках формула содержания зеараленона выражается следующим образом:

Если интенсивность флуоресценции пятна зеараленона в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,02 куб. см стандартного раствора (200 нг зеараленона), то на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем ), либо разбавить раствор В бензолом (увеличить объем ), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Обнаружение и количественное определение зеараленона с помощью ВЭЖХ

Условия и параметры анализа зеараленона с помощью ВЭЖХ приведены в табл. 53.

Таблица 53

УСЛОВИЯ АНАЛИЗА ЗЕАРАЛЕНОНА

Рекомендуется использовать перегнанные гексан и метанол или петролейный эфир и эфир, профильтрованный через слой оксида алюминия (5 см). УФ-детектор устанавливают на длину волны 283 нм, шкала чувствительности 0,005 е.о.п. Шкала самописца 10 мВ. Если используют флуориметрический детектор, то длину волны на линии возбуждения устанавливают около 283 нм, а на линии эмиссии — фильтр от 420 нм (или 440 нм в случае монохроматора на линии эмиссии).

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002 и 0,005 куб. см рабочего раствора зеараленона, что соответствует 20 и 50 нг зеараленона. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см раствора В. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом, определяют его высоту (h).

Расчет концентрации зеараленона в образце проводят по формуле:

где:

С — концентрация зеараленона в образце, мг/кг;

— объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции, куб. см (125 куб. см);

— объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб. см);

— объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор В), куб. см (0,5 куб. см);

— объем очищенного экстракта (раствор В), внесенный в хроматограф, куб. см (0,02 куб. см);

М — навеска образца, взятая для анализа, г (25 г);

m — масса стандарта зеараленона, введенная в хроматограф, нг;

— высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

h — высота пика зеараленона из образца, мм;

К — степень извлечения зеараленона по табл. 54.

Если пик зеараленона в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора В бензолом, т.е. после увеличения объема .

При ВЭЖХ зеараленона чувствительность УФ- и флуориметрического детекторов примерно одинакова. Преимуществом флуориметрического детектора является его селективность (меньшее количество посторонних пиков на хроматограмме).

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения, по данным авторов методов анализа дезоксиниваленола и зеараленона, приведены в табл. 54, в которой указаны также относительные внутрилабораторные () и межлабораторные () среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона.

Таблица 54

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА И ЗЕАРАЛЕНОНА

4. Метод обнаружения, идентификации и количественного определения патулина в БАД на плодоовощной основе

Подготовка проб

Навеску жидких БАД массой 50 г или фруктового порошка массой 25 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см. В мерную колбу вносят 15 куб. см раствора Карреза I и 15 куб. см раствора Карреза II. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 50 куб. см фильтрата.

Экстракция

Фильтрат из цилиндра переносят в делительную воронку, добавляют 50 куб. см этилацетата и смесь интенсивно встряхивают. После разделения слоев отделяют верхний этилацетатный слой и переносят его в сухую плоскодонную колбу. Затем экстракцию проводят еще раз со свежей порцией этилацетата. Если полного расслоения жидкостей не происходит, в делительную воронку добавляют 10 — 12 г хлорида натрия и смесь слегка встряхивают. Этилацетатные экстракты объединяют, сушат безводным сульфатом натрия и фильтруют через кусочек ваты в грушевидную колбу. Сульфат натрия промывают 10 куб. см этилацетата и фильтруют в ту же колбу. Экстракт упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 1 куб. см этилацетата.

Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты и 5 куб. см бензола, насыпают слой безводного сульфата натрия (5 мм) и наливают суспензию 2 г (3,6 куб. см) силикагеля в 15 куб. см бензола. Не давая колонке просохнуть (колонка закрыта снизу), насыпают слой безводного сульфата натрия (10 мм). Бензолу дают стечь, на верхний слой сорбента наносят экстракт, дают впитаться в фильтрующий слой. Отгонную колбу ополаскивают 5 куб. см этилацетата, переносят раствор на колонку и дают этилацетату полностью впитаться в фильтрующий слой. Колонку промывают 25 куб. см бензола. Патулин элюируют 75 куб. см смеси этилацетат — бензол (25:75). Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток растворяют в 0,2 куб. см смеси бензол — ацетонитрил (9:1) для анализа методом ТСХ или в 0,2 куб. см метанола для анализа методом ВЭЖХ (раствор А).

Обнаружение и количественное определение патулина с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 29. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 0,02 куб. см раствора А. В левом нижнем углу пластинки наносят 0,002 и 0,004 куб. см стандартного раствора патулина, что соответствует 20 и 40 нг стандарта. В верхнем правом углу пластинки наносят 0,006 и 0,008 куб. см стандартного раствора патулина, что соответствует 60 и 80 нг стандарта. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью хлороформ — ацетон (4:1) и элюируют в первом направлении до достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во втором направлении смесью толуол — этилацетат — муравьиная кислота (5:4:1). После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее извлекают из камеры и сушат на воздухе до исчезновения запаха растворителя. На дно эксикатора помещают стеклянный стакан вместимостью 150 куб. см с 25 куб. см раствора марганцовокислого калия, осторожно приливают 25 куб. см соляной кислоты, быстро устанавливают вставку эксикатора и на нее хроматографическую пластинку, плотно закрывают эксикатор. Через 15 мин. пластинку извлекают из эксикатора и оставляют выветриваться в вытяжном шкафу еще на 15 — 20 мин. до полного исчезновения запаха хлора. (Работу с хлором следует проводить в вытяжном шкафу лаборатории с использованием индивидуальных средств защиты.) Затем пластинку опрыскивают раствором бензидина, выдерживают 20 — 30 мин. и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Патулин обнаруживается в виде желтых флуоресцирующих пятен. Наличие на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о его наличии в анализируемом продукте. Сравнивая интенсивность флуоресценции пятна патулина в пробе (в растворе А) с интенсивностью флуоресценции стандартов, оценивают количество. Содержание патулина в анализируемом продукте определяют по формуле:

где:

С — содержание патулина в продукте, мг/кг;

— объем раствора, до которого доведена исходная навеска продукта, куб. см (250 куб. см);

— объем фильтрата, отобранный на анализ, куб. см (50 куб. см);

— объем очищенного хлороформного экстракта перед ТСХ, куб. см (0,2 куб. см);

— объем хлороформного экстракта, нанесенный на пластинку, куб. см (0,02 куб. см);

m — количество патулина, обнаруженное в пятне, нг;

М — масса образца, взятая на анализ, г;

К — степень извлечения патулина по табл. 55.

Если интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 0,008 куб. см стандартного раствора (80 нг патулина), то на пластинку следует либо нанести меньшее количество экстракта (уменьшить объем ), либо разбавить раствор А хлороформом (увеличить объем ), внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Обнаружение и количественное определение патулина с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза изопропанол — гексан (1:4); расход подвижной фазы 1,0 куб. см/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители. УФ-детектор устанавливают на длину волны 276 нм, шкала чувствительности 0,005 е.о.п. Шкала самописца 10 мВ.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002, 0,005 и 0,015 куб. см рабочего раствора патулина, что соответствует 4, 10 и 30 нг патулина. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных условиях ВЭЖХ коэффициент емкости (К’) для патулина составляет 2,3 — 2,7.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 куб. см раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания со стандартом, определяют его высоту (РИС). Расчет концентрации патулина в образце проводят по формуле:

где:

С — концентрация патулина в образце, мг/кг;

— объем, до которого доведена навеска при экстракции водой, куб. см (250 куб. см);

— объем фильтрата, взятый для анализа, куб. см (50 куб. см);

— объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор А), куб. см (0,2 куб. см);

— объем очищенного экстракта (раствор А), внесенный в хроматограф, куб. см (0,02 куб. см);

М — навеска образца, взятая для анализа, г (50 или 25 г);

m — масса стандарта патулина, введенная в хроматограф, нг;

— высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм;

— высота пика патулина из образца, мм;

К — степень извлечения патулина по табл. 55.

Если пик патулина в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора А метанолом, т.е. после увеличения объема .

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения, по данным авторов методов анализа патулина, приведены в табл. 55, в которой приведены также относительные внутрилабораторные () и межлабораторные () среднеквадратичные отклонения и средняя степень извлечения патулина.

Таблица 55

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДЛЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТУЛИНА

5. Метод обнаружения, идентификации и определения содержания трихотеценовых микотоксинов группы А в пищевых продуктах и БАД на зерновой основе с помощью газожидкостной хроматографии (арбитражный метод)

В основу положен метод групповой индикации трихотеценовых микотоксинов группы А, в т.ч. наиболее токсичного среди них Т-2-токсина, с помощью газожидкостной хроматографии по внутреннему стандарту — 3-О-метил-Т-2-тетраолу.

5.1. Экстракция

Навеску измельченной пробы зерна массой 20 г помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 10 куб. см 4%-ного раствора хлорида калия и 90 куб. см ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 куб. см фильтрата (соответствует 14 г исходного образца).

5.2. Очистка экстракта

В делительную воронку на 250 куб. см помещают 70 куб. см фильтрата, добавляют 50 куб. см гексана, после встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 куб. см гексана, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Если слои плохо разделяются, добавляют сульфат аммония. К ацетонитрильному слою добавляют 2 — 3 куб. см бензола и сульфат аммония на кончике шпателя, встряхивают и отбрасывают нижний водный слой. Ацетонитрильный слой помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха с добавлением изопропанола до объема 1 куб. см.

5.3. Омыление пробы

К пробе добавляют 1 куб. см 4%-ного раствора едкого натра в 30%-ном изопропиловом спирте. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре.

5.4. Экстракция продуктов омыления

Щелочь нейтрализуют добавлением 2%-ного раствора уксусной кислоты (около 2 куб. см) до pH среды 5 — 7 (контроль по универсальной индикаторной бумаге). Смесь помещают в делительную воронку или в пробирку вместимостью 10 куб. см, добавляют 3,5 куб. см смеси ацетонитрил — бензол (3:0,5), на кончике шпателя — сульфат аммония, встряхивают и отделяют в чистую сухую колбу верхний ацетонитрильный слой (при использовании пробирки экстракт отделяют с помощью пипетки). Экстракцию повторяют дважды. Объединенные экстракты высушивают добавлением 1 г безводного сульфата натрия, фильтруют через ватный тампон в грушевидную колбу, куда предварительно помещают около 200 мг силикагеля для колоночной хроматографии, и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 — 45 °С (до получения сыпучего силикагеля).

5.5. Очистка продуктов омыления

Очистку продуктов омыления проводят с помощью колоночной хроматографии. Для хроматографии используют растворители, очищенные путем дистилляции. Безводный сернокислый натрий и силикагель промывают последовательно бензолом и ацетоном, затем высушивают на воздухе и прокаливают в сушильном шкафу при 100 °С в течение часа.

На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, 3 — 5 куб. см бензола, безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм, очищенный, как указано выше), заливают суспензию 2 г (3,6 куб. см) силикагеля в бензоле, не давая бензолу стечь (колонка закрыта снизу), высыпают омыленную пробу на силикагеле по п. 5.4 и после оседания твердых частиц насыпают безводного сульфата натрия (10 мм). Дают бензолу стечь и колонку промывают последовательно 25 куб. см смеси бензол — ацетон (95:5) (элюат отбрасывают) и 70 куб. см смеси бензол — ацетон (1:1). Элюат собирают в круглодонную колбу, упаривают на ротационном испарителе до объема 1 куб. см. Остаток переносят в вайл (емкость вместимостью 4 — 6 куб. см с герметично завинчивающейся крышкой) или в пробирку вместимостью 5 куб. см с НШ 14,5, упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,02 куб. см бензола, очищенного дистилляцией над металлическим натрием (раствор А).

5.6. Получение ТФА-производных

5.6.1. Получение стандартного раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола

5.6.1.1. Метелирование Т-2-токсина

1 г Т-2-токсина помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 3 куб. см очищенного перегонкой йодистого метила, 300 мг оксида серебра (катализатор) и кипятят на глицериновой бане (температура бани 60 °С) с обратным холодильником в течение 2 — 4 ч (контроль продуктов реакции по ТСХ на пластинках «Силуфол» в системе бензол — ацетон (5:1), эталон — исходный Т-2-токсин). После окончания реакции содержимое реакционной колбы охлаждают до комнатной температуры и упаривают досуха (от избытка йодистого метила) на ротационном испарителе. Остаток растворяют в 3 куб. см бензола.

5.6.1.2. Очистка 3-О-Ме-Т-2-токсина от исходного Т-2-токсина

Продукт реакции 3-О-Ме-Т-2-токсин необходимо очистить от исходного Т-2-токсина с помощью колоночной хроматографии. Для этого на дно стеклянной колонки размером 300 х 22 мм помещают кусочек ваты, приливают 5 — 10 куб. см бензола (колонка закрыта снизу), присыпают безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), заливают суспензию 20 г силикагеля в бензоле и насыпают слой безводного сульфата натрия (20 мм). Дают бензолу стечь и на колонку наносят раствор продуктов реакции в бензоле по п. 5.6.1.1 (3 куб. см). Реакционную колбу ополаскивают бензолом (0,5 куб. см) и раствор также наносят на колонку. Колонку последовательно промывают:

— бензолом — 100 куб. см;

— 2%-ным раствором ацетона в бензоле — 200 куб. см;

— 4%-ным раствором ацетона в бензоле — 100 куб. см;

— 5%-ным раствором ацетона в бензоле — 600 куб. см;

— 10%-ным раствором ацетона в бензоле — 300 куб. см;

— 15%-ным раствором ацетона в бензоле — 200 куб. см.

Отбирают фракции, содержащие чистый 3-О-Ме-Т-2-токсин (5%-ная смесь ацетона в бензоле) и Т-2-токсин (10 — 15%-ная смесь ацетона в бензоле). Контроль реакции проводят с помощью ТСХ на пластинках «Силуфол» в системе бензол — ацетон (5:1). Выход 3-О-Ме-Т-2-токсина после упаривания растворителя досуха на ротационном испарителе и высушивания остатка в вакууме составляет порядка 0,5 г (50%). Возврат Т-2-токсина — 50%.

5.6.1.3. Омыление Ме-Т-2-токсина

К высушенному остатку 3-О-Ме-Т-2-токсина добавляют 10 куб. см метанола, 2 куб. см воды и 3 куб. см раствора 3Н К2СО3. Смесь нагревают 2 ч при 40 °С при перемешивании на магнитной мешалке. Контроль продуктов реакции проводят с помощью ТСХ на пластинках «Силуфол» в системе бензол — ацетон (1:1). По окончании реакции смесь охлаждают, разбавляют 70 куб. см воды и нейтрализуют добавлением 0,4 куб. см ледяной уксусной кислоты до слабокислой среды (контроль по универсальной индикаторной бумажке).

5.6.1.4. Очистка 3-О-Ме-Т-2-тетраола на патроне Supelclean LC-18

Полученный раствор по п. 5.6.1.3 пропускают через концентрирующий патрон Supelclean LC-18 (толщина слоя 1 см), элюат отбрасывают. Патрон промывают 50 куб. см метанола. Элюат содержит неполярные примеси и следовые количества продукта, и его отбрасывают. 3-О-Ме-Т-2-тетраол смывают 10 куб. см смеси метанол — вода (5:1) и экстрагируют этилацетатом (5 куб. см х 3 раза). При плохом расслоении жидкостей в элюат добавляют хлорид натрия или центрифугируют. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают досуха и 3-О-Ме-Т-2-тетраол кристаллизуют из бензола с добавлением петролейного эфира до помутнения. Выход 3-О-Ме-Т-2-тетраола составляет порядка 70%.

5.6.1.5. Приготовление стандартного рабочего раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола

625 мг 3-О-Ме-Т-2-тетраола помещают в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, содержащую до половины бензол, перемешивают до полного растворения вещества и доводят бензолом до метки, тщательно перемешивают. Концентрация 3-О-Ме-Т-2-тетраола в полученном растворе 25 мг/куб. см.

5.6.2. Получение трифторацетильных производных стандартной смеси Т-2-тетраола и 3-О-метил-Т-2-тетраола

В вайл (емкость вместимостью 4 — 6 куб. см с герметично завинчивающейся крышкой) или пробирку вместимостью 5 куб. см с НШ 14,5 помещают 0,02 куб. см рабочего раствора Т-2-тетраола (1 мкг) и 0,04 куб. см рабочего раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола (1 мкг) в бензоле, добавляют 0,1 куб. см бензола, предварительно очищенного дистилляцией над металлическим натрием, 30 — 50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 0,05 куб. см трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и нагревают при 60 °С в течение 0,5 часа при периодическом встряхивании. Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 куб. см и фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку вместимостью 5 куб. см с НШ 14,5. Углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 куб. см бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха в токе азота (при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 0,02 куб. см бензола и анализируют с помощью ГЖХ.

5.6.3. Получение ТФА-производных продуктов омыления

К 0,02 куб. см раствора продуктов омыления экстракта по п. 5.5 (раствор А) добавляют 0,04 куб. см стандартного раствора 3-О-метил-Т-2-тетраола (1 мкг, внутренний стандарт) в бензоле, 30 — 50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 0,05 куб. см трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и проводят получение ТФА-производных согласно п. 5.6.2 при периодическом встряхивании.

5.7. ГЖХ анализ ТФА-производных

Условия ГЖХ анализа: колонка капиллярная, длина колонки 25 м, жидкая фаза SE-54, температура колонки — 210 °С, температура термостата детектора — 240 °С, температура инжектора — 300 °С, скорость газа-носителя — 2 куб. см/мин., скорость продувочного газа — 6 куб. см/мин., шкала чувствительности — 2 х А (на блоке ИМТ).

В инжектор газового хроматографа с помощью микрошприца вместимостью 1 или 10 мкл последовательно вводят две аликвоты (около 0,2 — 0,5 мкл) стандартной смеси ТФА-производных Т-2-тетраола и 3-О-метил-Т-2-тетраола по п. 5.6.2. При использовании метода внутреннего стандарта нет необходимости вводить в хроматограф точные количества проб. В каждом случае регистрируют время выхода растворителя бензола и время выхода ТФА-Т-2-тетраола и ТФА-3-О-метил-Т-2-тетраола. Определяют относительное приведенное время удерживания токсина (наиболее воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков токсинов (). Относительные приведенные времена удерживания определяют по следующей формуле:

где:

t’ — относительное приведенное время удерживания, мин.;

— время удерживания растворителя, мин.;

— время удерживания Т-2-тетраола, мин.;

— время удерживания 3-О-метил-Т-2-тетраола, мин.

Площадь пиков определяют по показанию интегратора или умножением высоты пика на ширину пика на половине его высоты.

Затем в газовый хроматограф вводят 0,2 — 0,5 мкл раствора ТФА-производного продуктов омыления экстракта по п. 5.6.3. При наличии пика, соответствующего относительному приведенному времени удерживания ТФА-производного Т-2-тетраола, определяют его площадь ().

Относительное приведенное время удерживания Т-2-тетраола в зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах 0,59 — 0,62.

5.8. Обработка результатов анализа

Расчет содержания Т-2-тетраола в анализируемой смеси проводят по формуле:

где:

М — масса анализируемого вещества (Т-2-тетраола), мкг;

— масса введенного внутреннего стандарта (3-О-метил-Т-2-тетраола), мкг;

S — площадь пика анализируемого вещества (Т-2-тетраола), кв. мм;

— площадь пика внутреннего стандарта (3-О-метил-Т-2-тетраола), кв. мм;

К — поправочный коэффициент вещества (Т-2-тетраола) по внутреннему стандарту (3-О-метил-Т-2-тетраолу).

Поправочный коэффициент определяют в соответствии с параметрами калибровочной смеси по следующей формуле:

где:

m — масса Т-2-тетраола, нг;

— масса 3-О-метил-Т-2-тетраола, нг;

— площадь 3-О-метил-Т-2-тетраола, кв. мм;

S — площадь Т-2-тетраола, кв. мм.

Пересчет количества Т-2-тетраола на кг исследуемого образца проводят следующим образом:

где:

— содержание суммы трихотеценовых микотоксинов группы А (Т-2-токсин, НТ-2-токсин, Т-2-тетраол и др.), мкг/кг;

М — масса анализируемого вещества (Т-2-тетраола), определенная во вколе, мкг;

m — масса анализируемой пробы, соответствующая 70 куб. см фильтрата (14 г) по п. 5.1, г.

5.9. Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения Т-2-тетраола во вколе при ГЖХ с использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ) — 0,5 — 1 нг; общий предел обнаружения 20 мкг/кг (0,02 мг/кг); относительное стандартное отклонение 0,28 — 0,35 (при уровне загрязнения 0,1 мг/кг).

II. Метод определения нитратов и нитритов

Метод определения нитратов и нитритов распространяется на БАД на растительной основе, определение проводится либо методом фотометрии в соответствии с ГОСТ 8558.1-78, либо методом ионометрии по ГОСТ 29270-95 «Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения нитратов и нитритов».

III. Метод определения N-нитрозаминов

Для определения N-нитрозаминов используют ГЖХ-хемилюминесцентный метод. Метод идентификации и количественного определения НА состоит в выделении летучих НА путем перегонки с паром или в вакууме, экстракции хлористым метиленом НА из водного дистиллята, концентрировании экстракта, разделении смеси методом газожидкостной хроматографии и количественном определении немодифицированных НА с помощью высокоселективного и высокочувствительного хемилюминесцентного (термоэнергетического) детектора ТЕА-502.

Идентификацию НА осуществляют по времени удерживания в сравнении с параметрами удерживания стандартных НА. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки с систематическим контролем калибровочного коэффициента.

1. Аппаратура, материалы, реактивы

Весы технические и весы аналитические.

Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель, колбонагреватель или электроплитка).

Ротационный испаритель с ловушкой.

Насос водоструйный.

Контактные термометры.

Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.

Система для отгонки нитрозаминов с водяным паром, принципиальная схема которой представлена на рис. 23.

Газовый хроматограф любой марки.

Детектор хемилюминесцентный — анализатор термической энергии типа ТЕА-502 фирмы «Теrmо Electron Corporation» (США).

Самописец любой марки.

Колонка газохроматографическая стеклянная длиной 3 м и диаметром 2 мм, заполненная 15% Carbowax-20M, нанесенном на Chromaton N-AW-DMCS (80 — 100 меш.).

Азот газообразный (ос.ч. или поверочный нулевой газ) или аргон газообразный, ос.ч.

Кислород газообразный, ос.ч.

Азот жидкий.

N-нитрозодиметиламин (НДМА).

N-нитрозодиэтиламин (НДЭА).

N-нитрозодипропиламин (НДПА).

N-нитрозодибутиламин (НДБА).

N-нитрозопиперидин (НПип).

N-нитрозопирролидин (НПир) фирмы «Fluka» (Швейцария).

Гексановый раствор НДПА (0,2 мкг/куб. см) — внутренний стандарт.

Гексановый раствор смеси стандартных НА (НДМА, НДЭА, НДБА, НПип, НПир) по 0,2 мкг каждого НА в 1 куб. см раствора.

Ацетонитрил, х.ч.

Бензол, х.ч.

Вода дистиллированная.

н-Гексан, х.ч.

Кальция хлорид прокаленный, ч.

Кислота соляная, х.ч., и ее водный раствор 0,1 н.

Кислота серная, х.ч., и ее водные растворы 1 н. и 5 н.

Кислота уксусная ледяная, х.ч.

Метилена хлорид, х.ч.

Натрия гидроокись, х.ч., и его водный раствор 0,1 н.

Натрий сернокислый прокаленный, х.ч.

Натрий углекислый кислый, х.ч.

Натрий хлористый, х.ч.

Спирт этиловый.

2. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором производят определение нитрозаминов, обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с нитрозаминами, стандартами, другими химическими соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.).

В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими НА, необходимо всегда иметь 2 — 3%-ный раствор газообразного НВr в уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие места и пол. В целях разрушения летучих НА в воздухе по окончании работы помещение необходимо обработать ультрафиолетовым светом.

Транспортировка и хранение НА осуществляются в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в металлическую тару, которую также заплавляют парафином.

НА хранят в специальном холодильнике в отсутствие анализируемых проб.

1,0 куб. см раствора НДПА из ампулы с концентрацией 0,2 мг/куб. см переносят в мерную колбу на 100 куб. см и доводят гексаном до метки. Полученный раствор с концентрацией 2 мкг/куб. см используют при анализе в качестве внутреннего стандарта.

3. Выделение нитрозаминов

3.1. Выделение нитрозаминов путем перегонки с паром

Навеску 50 — 100 г измельченного в гомогенизаторе БАД помещают в круглодонную колбу на 500 куб. см, соединенную с паровиком и прямым холодильником (принципиальная схема установки представлена на рис. 31). К образцу добавляют 10 г хлористого натрия, 10 г сульфата натрия или магния, 25 — 50 куб. см дистиллированной воды (в зависимости от влажности образца), 5 куб. см 2% раствора сульфаминовой (или сульфаниловой) кислоты, 5 — 10 куб. см 1 н. раствора серной кислоты до pH < 3,0; 1 куб. см гексанового раствора ДПНА и НА отгоняют с водяным паром, собирая 200 — 230 куб. см дистиллята. Если перегонка с паром сопровождается вспениванием массы, добавляют 5 — 10 куб. см насыщенного раствора апиезона в изопропиловом спирте, а в случае спекания образцов в процессе дистилляции — мелкие керамические крошки или кусочки стеклянных трубочек. Для наиболее полного выделения НА из БАД, содержащих спирт, необходимо разбавить образец водой до получения 20% концентрации в нем спирта. Дистиллят переносят в делительную воронку и нитрозамины экстрагируют свежеперегнанным хлористым метиленом 4 — 5 раз по 15 куб. см.

Объединенные хлорметиленовые экстракты высушивают прокаленным сульфатом магния, отфильтровывают, осушитель промывают небольшим объемом хлористого метилена, объединенные фильтраты помещают в круглодонную колбу на 100 — 150 куб. см, снабжают дефлегматором (или воздушным холодильником), помещают в водяную баню и упаривают хлористый метилен до 5 — 7 куб. см выдерживанием при температуре бани 55 — 65 °С. Целесообразно пропускание тока инертного газа через хлорметиленовый раствор. По достижении объема раствора 5 — 7 куб. см дефлегматор смывают 2 куб. см гексана и продолжают концентрировать пробу до 2 куб. см.

3.2. Выделение нитрозаминов перегонкой в вакууме

Пробу исследуемого образца массой 20 — 50 г, отвешенную с погрешностью 0,1 г, помещают в круглодонную колбу вместимостью 200 куб. см, добавляют 75 — 80 куб. см дистиллированной воды, 1 куб. см гексанового раствора НДПА, 4 куб. см 0,1 н. раствора гидроокиси натрия и 20 куб. см парафинового или вазелинового масла для предотвращения перебрасывания массы во время дистилляции и присоединяют к вакуумной системе (принципиальная схема установки изображена на рис. 32).

Колбу с исследуемым образцом помещают на песочную баню, под которой устанавливают газовую горелку; приемную колбу охлаждают смесью сухого льда и гексана (ацетона) или жидким азотом. Установив в системе вакуум до 0,1 атм., проводят дистилляцию до получения 50 куб. см дистиллята. Чтобы избежать потери НА, обязательно проводят дистилляцию в закрытой системе. Герметичность системы можно сохранить, используя чистую вакуумную смазку или тефлоновые манжеты для шлифов. После окончания дистилляции снимают обогрев, охлаждение, отсоединяют шланг вакуумной системы. После оттаивания приемной колбы систему перегонки разбирают, насадку ополаскивают несколькими куб. см дистиллированной воды, которые добавляют к дистилляту. В круглодонную колбу с дистиллятом добавляют 1 — 2 куб. см этанола, 0,5 куб. см 5 н. серной кислоты и экстрагируют трижды по 7 — 10 куб. см хлористым метиленом. Экстракт высушивают прокаленным сульфатом магния и концентрируют аналогично п. 3.1 до 2 куб. см.

4. Подготовка к испытанию и проведение анализа

Анализ НА осуществляют с помощью ГЖХ без дополнительной обработки хлорметиленового или гексанового раствора при следующих условиях: колонка стеклянная (длина 3 м с диаметром 2 мм), заполненная 15% Carbowax-20M, нанесенном на Chromaton N-AW-DMCS (80 — 100 меш.). Может быть использована другая по размеру набивная колонка, например, с содержанием Carbowax 10%, газ-носитель — азот или аргон, скорость — 20 куб. см/мин., температура колонки — 125 °С (изотермический режим); температура испарителя — 220 °С, температура каталитической печи — 450 °С, давление азота — 0,5 атм. (или расход — 40 куб. см/мин.), давление кислорода — 0,6 атм., температура охлаждающей ловушки — 110 — 130 °С, объем вводимой в хроматограф пробы — 1 — 10 мкл.

Записывают хроматограмму эталонной смеси НА и раствора внутреннего стандарта в начале и в конце каждой серии анализов. Идентификацию НА в пробе осуществляют по времени удерживания стандартов. Количество НА в пробе оценивают сравнением величины аналитических сигналов, полученных при анализе образцов и стандартных растворов.

Оценивают также полноту извлечения НА из БАД по внутреннему стандарту (НДПА), вносимому в продукт перед выделением НА.

Содержание НА в пробе рассчитывают по формуле:

где:

С — содержание исследуемого НА в образце, мкг/кг;

— площадь под интегральной кривой, полученной при анализе образца, кв. мм;

— площадь под интегральной кривой соответствующего стандартного НА, кв. мм;

— объем пробы, введенной в хроматограф, мкл;

— объем анализируемого экстракта, мкл;

n — количество стандартного НА, введенного в хроматограф, нг;

m — масса пробы, взятой на анализ, г;

А — степень извлечения внутреннего стандарта (70 — 95%).

5. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения приведены в табл. 56.

Таблица 56

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

IV. Метод определения биогенных аминов

1. Колориметрический метод определения гистамина

Принцип метода

В основе колориметрического метода определения гистамина лежит измерение величины абсорбции окрашенного производного при взаимодействии гистамина с диазореактивом. Предел обнаружения — 10 мг/кг, относительное стандартное отклонение при определении гистамина в интервале 20 — 75 мг/кг изменяется от 0,08 до 0,25, степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина — 94 — 99%.

Специфические приборы, реактивы, материалы

Колориметр фотоэлектрический по ГОСТ 12083-78 со светофильтром = 490 + 10 нм, спектрофотометр СФ-26 или аналогичный.

Микроизмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64.1-1505-63.

Гистамин или гидрохлорид гистамина.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, х.ч., раствор 3,75 г/л (0,1 н раствор).

Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/л (5% раствор).

Натрий азотистокислый по ГОСТ 4197-77, раствор 50 г/л (5% раствор).

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор 200 г/л (5% раствор).

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х.ч., прокаленный.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х.ч., раствор 40 г/л (4% раствор).

Пара-нитроанилин, ч.д.а.

Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч.д.а.

Подготовка к испытанию

Приготовление раствора пара-нитроанилина

Пара-нитроанилин очищают путем перекристаллизации в воде. Для этого его растворяют в горячей дистиллированной воде и охлаждают раствор до комнатной температуры. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и высушивают при 80 °С в течение 10 — 15 мин. 0,1 г пара-нитроанилина растворяют в 100 куб. см 0,1 н соляной кислоты. Хранят раствор в холодильнике до момента употребления.

Приготовление диазореактива

Диазореактив получают непосредственно перед использованием путем смешивания 10 куб. см раствора 1 г/куб. дм пара-нитроанилина в 0,1 н соляной кислоте и 1 куб. см раствора 50 г/куб. дм азотистокислого натрия и охлаждают до 0 °С.

Приготовление н-бутанола, насыщенного водой

Для приготовления н-бутанола, насыщенного водой, встряхивают 50 куб. см н-бутанола и 20 куб. см дистиллированной воды в делительной воронке. После разделения фаз отделяют верхний бутанольный слой.

Экстракция

Навеску 10 г (с точностью до 0,01 г) приготовленного образца помещают в сосуд микроизмельчителя тканей, добавляют 25 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают 5 мин. Полученную смесь переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 куб. см, ополаскивают сосуд смесителя дважды 5 — 10 куб. см 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и растворы объединяют. Колбу снабжают воздушным холодильником и выдерживают на водяной бане при 60 °С в течение 15 мин. Охлажденную смесь переносят количественно в цилиндр, доводят до 50 куб. см 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и фильтруют через складчатый фильтр (фильтрат 1).

Построение калибровочной кривой

Готовят стандартные растворы гистамина с концентрацией 5, 10, 20, 40 мкг/куб. см в 5%-ной трихлоруксусной кислоте. Для приготовления основного раствора гистамина с концентрацией 40 мкг/куб. см 4,0 мг гистамина помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в 5%-ной трихлоруксусной кислоте и доводят объем до метки. Рабочие растворы гистамина с концентрациями 20, 10 и 5 мкг/куб. см получают путем разбавления 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты основного раствора в 2, 4 и 8 раз соответственно. Основной раствор гистамина хранят в холодильнике неделю, рабочие растворы готовят в день проведения анализа.

5 куб. см каждого стандартного раствора помещают в пробирки с притертыми пробками, добавляют 1 куб. см 20%-ного раствора гидроксида натрия и вносят в раствор при перемешивании безводный углекислый натрий до получения насыщенного раствора. Добавляют 5 куб. см н-бутанола, насыщенного водой. Энергично встряхивают пробирки в течение 30 сек. После разделения фаз отбирают пипеткой или шприцем 3 куб. см верхнего бутанольного слоя и переносят в другую пробирку с притертой пробкой, содержащую 3 куб. см 0,1 н раствора соляной кислоты. Встряхивают содержимое пробирки в течение 30 сек. После разделения фаз отбирают 2 куб. см нижнего водного слоя в другую пробирку. Добавляют 2 куб. см 4%-ного раствора углекислого натрия и выдерживают 5 мин. при 0 °С. Добавляют 4 куб. см этилацетата и энергично встряхивают в течение 30 сек. После разделения фаз сухой пипеткой отбирают верхний слой и переносят в пробирку, содержащую безводный сульфат натрия (раствор окрашенного производного в этилацетате должен быть прозрачным). Измеряют величину абсорбции раствора при 495 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют этилацетат.

На основании полученных данных строят калибровочную кривую зависимости абсорбции от концентрации гистамина в растворе.

Проведение испытаний

5 куб. см фильтрата 1 помещают в пробирку и проводят процедуру, описанную выше, начиная с добавления раствора гидроокиси натрия.

Для определения концентрации гистамина в экстракте используют калибровочную кривую.

Обработка результатов

Содержание гистамина в образце (мг/кг) вычисляют по формуле:

где:

с — концентрация гистамина, найденная по калибровочной кривой, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, куб. см (50 куб. см);

m — навеска образца БАД, г (10 г);

Ф — фактор разбавления:

Вычисления проводят до единиц. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 20% по отношению к среднеарифметическому значению.

2. Определение содержания биогенных аминов с помощью ВЭЖХ

Принцип метода

Метод определения содержания биогенных аминов устанавливает хроматографическую методику выполнения измерений массовых концентраций биогенных аминов (тирамина, кадаверина, путресцина, спермидина, спермина, гистамина) в биологически активных добавках к пище и предназначены для проведения лабораторных исследований пищевой продукции и биологически активных добавок в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Специфические приборы, реактивы, материал

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 куб. см/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем с размером частиц 5 мкм; длина колонки — 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок — 0,46 см.

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Микроизмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64.1-1505-63.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с пределом допустимой погрешности +/- 0,0005 г по ГОСТ 2404-80.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.

Центрифуга лабораторная.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 по ГОСТ 29227.

Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/л (5%-ный раствор).

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., раствор 0,1Н.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х.ч., прокаленный.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х.ч., насыщенный раствор.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, х.ч., насыщенный раствор.

Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч.д.а.

Гексан по ТУ 6-09-3375-73, ч.

Бензол для хроматографии, х.ч. по ТУ 6-09-779-76.

Ацетон по ГОСТ 2603-71, ч.д.а.

5-диметиламино-нафталинсульфонил хлорид (дансилхлорид), Serva, раствор 5 г/л в ацетоне.

Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 «синяя лента» по ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор 0,45 мкм.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Баллон с сжатым азотом, ос.ч. по ГОСТ 9293-74.

Тирамин, кадаверин, путресцин, спермидин, спермин, гистамин или их гидрохлориды.

Подготовка к испытанию

Приготовление основных стандартных растворов биогенных аминов (БА)

Навески по 0,25 г аминов или соответствующие навески аминов гидрохлоридов помещают в мерные колбы вместимостью 50 куб. см, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты, доводят этим же раствором до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор аминов в 0,1 М HCl с массовыми долями каждого амина (тирамин, кадаверин, путресцин, спермидин, спермин, гистамин) 5 мг/куб. см.

Приготовление рабочих стандартных растворов биогенных аминов

Аликвоты в 1 куб. см основного стандартного раствора каждого биогенного амина переносят в мерные колбы вместимостью 50 куб. см, доводят 0,1 М HCl до метки и тщательно перемешивают. Получают рабочие стандартные растворы биогенных аминов концентрацией 0,1 мкг/куб. см.

Получение стандартных растворов ДНС-производных биогенных аминов

Для получения стандартных растворов ДНС-производных биогенных аминов отбирают по 0,05 куб. см каждого рабочего стандартного раствора БА (5 мкг амина), помещают в вайл вместимостью 4 — 6 куб. см, добавляют 0,5 куб. см насыщенного раствора бикарбоната натрия (pH 8,5 — 9) и 1 куб. см ацетонового раствора ДНС-хлорида с концентрацией 5 г/л. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 12 — 14 ч или 1 ч при 45 — 50 °С.

В реакционную смесь добавляют 1 куб. см дистиллированной воды и отдувают ацетон в токе азота. При этом можно вайл поместить в водяную баню, нагретую до 35 — 40 °С. ДНС-амиды экстрагируют бензолом (3 x 1 куб. см), каждый раз стеклянной пипеткой отбирая верхний бензольный слой. Объединенные бензольные экстракты сушат безводным сульфатом натрия, декантируют в сухой вайл, осушитель промывают бензолом, также декантируют и упаривают досуха. Перед анализом стандартные растворы ДНС-производных биогенных аминов растворяют в 1 куб. см бензола.

Подготовка проб к анализу

Экстракция

Навеску 20 г пищевого продукта, взятую с точностью до 0,01 г, размельченного в мясорубке или гомогенизаторе, или 20 — 40 таблеток или капсул БАД (в зависимости от веса таблетки), размельченных в ступке, помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см. Добавляют соответственно 100 куб. см и 50 куб. см 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, снабжают воздушным холодильником, перемешивают и выдерживают 15 мин. при температуре 60 °С на водяной бане, периодически встряхивая содержимое колбы. Полученную смесь охлаждают и фильтруют через складчатый фильтр.

Получение дансильных производных биогенных аминов из образца

Аликвоту экстракта 0,5 куб. см, соответствующую 0,1 г исходного образца, помещают в вайл вместимостью 4 — 6 куб. см, добавляют 0,5 куб. см насыщенного раствора бикарбоната натрия (pH 8,5 — 9) и 1 куб. см ацетонового раствора ДНС-хлорида с концентрацией 5 г/л. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 12 — 14 ч или 1 ч при 45 — 50 °С.

В реакционную смесь добавляют 1 куб. см насыщенного раствора натрия хлорида и отдувают ацетон в токе азота. При этом можно вайл поместить в водяную баню, нагретую до 35 — 40 °С. ДНС-амиды экстрагируют бензолом (3 х 1 куб. см), каждый раз стеклянной пипеткой отбирая верхний бензольный слой. Если расслоение жидкостей происходит трудно, смесь центрифугируют в лабораторной центрифуге. Объединенные бензольные экстракты сушат безводным сульфатом натрия, декантируют в сухой вайл, осушитель промывают бензолом, также декантируют и упаривают досуха. Перед анализом сухой остаток растворяют в 1 куб. см бензола.

Проведение испытаний

Условия хроматографического анализа

Насос высокого давления с верхним пределом давления не менее 25 МПа, диапазоном регулирования подачи растворителя не менее 0,1 — 5,0 куб. см/мин.

Петлевое устройство ввода проб с рабочим объемом петли 0,020 куб. см.

Флуориметрический детектор, длина волны возбуждающего излучения 335 нм, длина волны эмиссии 470 нм, проточная кварцевая кювета объемом 0,015 — 0,025 куб. см, с уровнем флуктуационных шумов не более 8 х ед. флуоресценции, относительной погрешностью измерения интенсивности флуоресценции не более 2%.

Подвижная фаза: гексан — этилацетат, 55:45.

Скорость потока 1,0 мл/мин.

Выполнение измерений

В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 куб. см каждого стандартного раствора ДНС-производного биогенных аминов и определяют времена удерживания и площади пиков на хроматограмме. Градуировку проводят через каждые 6 часов работы прибора.

В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 куб. см экстракта пищевого продукта или БАД. На хроматограмме определяют площади пиков, соответствующие по временам удерживанию стандартным ДНС-производным биогенных аминов. Если пик на хроматограмме экстракта выходит за пределы шкалы, анализ проводят повторно после разбавления исходного раствора.

Вычисление результатов анализа

Содержание каждого биогенного амина в анализируемой пробе рассчитывают по формуле:

где:

М — массовая концентрация БА, мг/кг или ppm;

m — массовая доля внешнего стандарта ДНС-амида, введенного для калибровки хроматографа, нг;

— площадь пика исследуемого компонента;

— средняя площадь пика внешнего стандарта ДНС-амида, введенного для калибровки хроматографа;

— общий объем анализируемой пробы, мл;

— объем экстракта, взятый для анализа, мл;

— объем, в котором растворен сухой экстракт, мкл;

— объем экстракта, введенный в хроматограф, мл;

Р — навеска пробы, г.

Вычисления проводят до первого десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 10% по отношению к среднеарифметическому значению.

Относительное стандартное отклонение при определении аминов составляет 0,06 — 0,1. Степень извлечения — 85,3 — 93,4%.

Предел обнаружения метода 0,03 мг/кг для тирамина и 0,1 мг/кг для гистамина.

V. Метод определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)

Сущность метода заключается в экстракции углеводородов из неомыляемой фракции липидов гексаном с последующей хроматографической очисткой, идентификацией и количественным определением ПАУ с помощью ВЭЖХ и спектрофлуориметрии, а также хромато-масс-спектрометрии.

Область применения метода распространяется в основном на БАД на основе рыбопродуктов, рыбьего жира и на основе растительных масел. Рекомендуемая масса пробы для анализа — 25 — 50 г.

Приведенные в методике варианты хроматографического разделения экстракта неомыляемой фракции липидов позволяют в зависимости от поставленной задачи реализовать имеющиеся в распоряжении аналитика приборы и реактивы.

В методику также включен как арбитражный метод хромато-масс-спектрометрии.

Схема выделения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) включает переэкстракцию ПАУ из гексанового раствора неомыляемой фракции липидов комплексообразователем — диметилформамидом и хроматографическую очистку экстракта на колонке с сефадексом LH-20. Анализ ПАУ проводят с помощью ВЭЖХ или низкотемпературной спектрофлуориметрии. Ввиду того, что бенз(а)пирен рассматривают в качестве индикатора загрязнения ПАУ, в методику включены прописи его выделения и определения. Первый способ позволяет определить бенз(а)пирен в сумме ПАУ методом низкотемпературной спектрофлуориметрии, второй предполагает его выделение из суммы ПАУ в тонком слое ацетилированной целлюлозы и определение методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре.

1. Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф со спектрофотометрическим (фотометрическим) и флуориметрическим детекторами и колонкой с обращеннофазовым сорбентом (силикагель ОDS или С18).

Хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных, энергией ионизирующих электронов 70 eV, диапазоном массовых чисел 40 — 420 а.е.м., с капиллярной колонкой с неполярной или слабополярной жидкой фазой.

Спектрофотометр флуоресцентный с монохроматорами на линиях возбуждения и эмиссии.

Спектрофотометр флуоресцентный с приставкой для анализа флуоресценции и фосфоресценции при температуре жидкого азота (типа Hitachi-850, MPF-44B).

Спектрометр ДФС-12 или ДФС-24.

Облучатель с переменной длиной волны на 250 и 360 нм типа ОЛД, ТУ 64-1-2242-77.

Пластины стеклянные 20 х 20 см для тонкослойной хроматографии.

Колонки стеклянные длиной 250 — 500 мм и внутренним диаметром 10 — 15 мм со стеклянным пористым фильтром ПОР 160 и шлифом 14.

Целлюлоза микрокристаллическая для хроматографии.

Силикагель для хроматографии 40 — 100 мкм.

Алюминия окись 5/40 мкм.

Сефадекс LH-20, «Фармация», Швеция.

Стандарты: флуорантен, пирен, бенз(а)антрацен, хризен, бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен, бенз(а)пирен, бенз(е)пирен, дибенз(а,h)антрацен, бенз(b)хризен, бенз(g,h,i)перилен, коронен, дибенз(а,е)пирен («Serva», Германия).

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление растворителей

Все используемые органические растворители перегоняют общепринятым способом.

Диметилформамид перегоняют, добавив к 250 куб. см растворителя 12 куб. см воды и 30 куб. см бензола.

Отбирают фракцию, выкипающую выше 153 °С.

2.2. Подготовка сернокислого натрия безводного

1 кг сульфата натрия безводного заливают 2 куб. дм перегнанного хлороформа или смеси хлороформа и метанола (1:1), оставляют на 3 — 4 ч или встряхивают в течение 1 ч на качалке в герметично закрытой колбе, суспензию отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывая осадок на фильтре 1 куб. дм растворителя, высушивают осадок на воздухе до полного удаления растворителя, после чего прокаливают при температуре 400 °С в течение 6 ч, хранят в колбе с притертой пробкой.

2.3. Приготовление адсорбентов для хроматографии

2.3.1. Приготовление ацетилированной целлюлозы для ТСХ

К 50 г микрокристаллической целлюлозы добавляют смесь 150 куб. см бензола или толуола, 70 куб. см уксусного ангидрида и 0,3 куб. см концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 6 — 8 ч, оставляют еще на 18 ч, после чего осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и заливают 300 куб. см этанола, оставляют на 24 ч. Отфильтровывают осадок, промывают его на фильтре 100 куб. см этанола, дистиллированной водой до нейтральной реакции (5 х 300 куб. см) и сушат на воздухе. Для приготовления пластинки 5 г ацетилированной целлюлозы суспендируют в 15 — 20 куб. см этанола и наносят ровным слоем на стеклянную пластинку 20 х 20 см. После полного испарения растворителя проверяют хроматографическую подвижность бенз(а)пирена в системе этанол — ацетон — вода, взятых в объемном соотношении 60:25:15. Rf бенз(а)пирена и бенз(k)флуорантена составляет 0,1 и 0,2 соответственно.

2.3.2. 10 г сефадекса заливают 50 куб. см этанола и оставляют для набухания на 3 — 4 ч, после чего переносят на колонку. Над сорбентом до начала работы должен быть слой растворителя 0,5 — 1,0 см.

2.4. Приготовление растворов сравнения, внутренних стандартов

Для приготовления исходных растворов берут навески не менее 5 мг, растворяют в бензоле в мерных колбах объемом 50 — 100 куб. см и хранят в холодильнике. Рабочие растворы готовят из исходных разведением в соответствующем растворителе. Концентрации рабочих растворов внутренних стандартов и растворов сравнения следующие.

Внутренние стандарты для хромато-масс-спектрометрического анализа:

— растворы сравнения и внутреннего стандарта для анализа ПАУ (ВЭЖХ) — 100 мкг/куб. см.

Растворы сравнения для анализа ПАУ низкотемпературной спектрофлуориметрией:

— бенз(а)пирен — 1,0…, 10…, 100 нг/куб. см, перилен — 1…, 10 нг/куб. см, пирен, флуорантен, хризен, бенз(а)антрацен, бенз(b)флуорантен, бенз(k)флуорантен, дибенз(а,h)антрацен, дибенз(а,с)антрацен, бенз(е)пирен, бенз(g,h,i)перилен, дибенз(а,с)пирен, коронен — 1…, 10…, 100…, 1000 нг/куб. см (в бензоле).

Концентрация раствора сравнения для определения бенз(а)пирена спектрофлуориметрией при комнатной температуре: бенз(а)пирен — 20…, 100…, 1000 нг/куб. см.

3. Проведение испытания

3.1. Щелочной гидролиз и экстракция неомыляемой фракции липидов

50 г измельченного образца помещают в плоскодонную колбу вместимостью 1000 куб. см, добавляют раствор 19,5 г гидроокиси калия в 250 куб. см 92%-ного этилового спирта, туда же помещают стеклянную трубочку-мешалку со впаянной стальной проволокой для перемешивания на магнитной мешалке. К реакционной смеси добавляют необходимые внутренние стандарты. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают при кипении реакционной массы и перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и через холодильник добавляют 350 куб. см воды. Полученный раствор переносят в делительную воронку на 1000 куб. см и экстрагируют трижды по 150 куб. см гексана. Объединенные гексановые экстракты промывают в делительной воронке водой трижды по 50 куб. см, переносят в плоскодонную колбу, добавляют 30 — 40 г сульфата натрия и сушат экстракт в течение 24 ч. Полученный экстракт (экстракт А) — раствор неомыляемой фракции липидов используют далее для выделения ПАУ.

3.2. Выделение ПАУ из неомыляемой фракции липидов (экстракта А)

3.2.1. Переэкстракция водным диметилформамидом

Экстракт А упаривают до объема 100 куб. см, переносят в делительную воронку емкостью 1000 куб. см и добавляют 100 куб. см смеси диметилформамида и воды, взятых в объемном соотношении 9:1. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин., отделяют нижний слой, а из верхнего гексанового экстрагируют ПАУ повторно, добавив в воронку новую порцию водного диметилформамида объемом 100 куб. см. Гексановый (верхний) слой отбрасывают, а объединенный диметилформамидный экстракт разбавляют 200 куб. см воды и экстрагируют ПАУ из слоя разбавленного водой диметилформамида гексаном — трижды по 75 куб. см. Гексановые экстракты объединяют и промывают водой (4 раза по 50 куб. см), отделяют и сушат с 30 г безводного сульфата натрия в течение 1 ч. Обезвоженный экстракт упаривают до объема 1 — 1,5 куб. см, остаток растворителя удаляют в токе азота. Вещество в колбе (экстракт В) растворяют в 1 — 1,5 куб. см этанола и очищают на колонке с сефадексом LH-20.

3.2.2. Хроматография на колонке с сефадексом LH-20

10 г сефадекса заливают 50 куб. см этанола и оставляют для набухания на 3 — 4 ч, после чего гель переносят на стеклянную хроматографическую колонку, дают растворителю стечь и переносят на колонку раствор экстракта В, смывая его из колбы 2 — 3 раза небольшим количеством этанола, каждый раз давая растворителю полностью впитаться в слой геля. Элюируют вещество с колонки этанолом со скоростью 0,5 куб. см/мин., обеспечивая такой поток небольшим избыточным давлением тока воздуха или азота, подаваемого на колонку через насадку со шлифом, заполненную силикагелем и слоем ваты. Первую фракцию — 50 куб. см этанола отбрасывают, вторую фракцию — 100 куб. см этанола, содержащую ПАУ с числом циклов 4 — 7, собирают, упаривают растворитель и далее анализируют с помощью ВЭЖХ, низкотемпературной спектрофлуориметрии или используют для выделения бенз(а)пирена.

3.2.3. Выделение бенз(а)пирена из фракции ПАУ ТСХ на ацетилированной целлюлозе

Фракцию ПАУ растворяют в 1 — 1,5 куб. см бензола и наносят вещество сплошной полосой на пластинку с ацетилированной целлюлозой размером 20 х 20 см, подготовленную, как указано в п. 2.3.1, оставляя снизу и с боков пластинки поля шириной 1,5 — 2,0 см. На стартовую линию бокового поля, отделенного от основного с помощью скальпеля, наносят в точку 1 — 2 мкл раствора бенз(а)пирена с концентрацией 1 мкг/куб. см. Пластинку помещают в хроматографическую камеру и проводят элюирование в смеси этанол — ацетон — вода (60:25:15). Камеру предварительно насыщают парами растворителя в течение 2 — 3 ч. Когда фронт растворителя достигнет 2 см от верхнего края пластинки, ее вынимают и отмечают зону бенз(а)пирена в УФ-свете с длиной волны 360 нм. Сорбент из зоны бенз(а)пирена (которая ниже зоны бенз(k)флуорантрена) собирают с помощью скальпеля на воронку Шотта и элюируют вещество бензолом (5 х 10 куб. см) в круглодонную колбу. Растворитель упаривают до небольшого объема, остаток отдувают в токе азота, затем добавляют 1 куб. см бензола и анализируют с помощью спектрофлуориметрии при комнатной температуре.

3.3. Определение ПАУ с помощью ВЭЖХ

Рекомендуемые условия хроматографического разделения и детектирования ПАУ:

1) колонка Zorbax ODS, 250 х 4 мм, подвижная фаза ацетонитрил — вода (84:16), скорость потока 1 куб. см/мин., детектор флуориметрический, длина волны возбуждающего света 280 нм, эмиссионного — 405 нм;

2) колонка та же, подвижная фаза метанол — вода (90:10), скорость потока 1,2 куб. см/мин., детектор спектрофотометрический при 254 или 290 нм;

3) колонка Supelcosil LC РАН, 150 х 4,6 мм, подвижная фаза ацетонитрил — вода (80:20 или 85:15), скорость потока 1 куб. см/мин., детектор флуориметрический, длина волны возбуждающего света 300 нм, эмиссионного > 418 нм.

Объем анализируемой пробы определяют экспериментально. Он составляет не менее 200 мкл, объем вводимой пробы 10 — 20 мкл.

Расчет содержания компонентов суммы ПАУ (X) в образце проводят по следующим формулам:

а) по методу абсолютной калибровки:

где:

— количество компонента, введенного в хроматограф со стандартным раствором, мкг;

— площадь пика компонента, введенного со стандартным раствором;

— площадь компонента на хроматограмме «холостого опыта»;

— объем раствора пробы, мкл;

— объем раствора пробы, введенной в хроматограф, мкл;

— площадь пика компонента на хроматограмме пробы;

G — масса образца, г;

б) по методу внутреннего стандарта (добавка бенз(b)хризена)

где:

количество введенного в образец внутреннего стандарта, мкг;

К — коэффициент пересчета, определяемый экспериментально в зависимости от выбранных условий детектирования по хроматограмме стандартной смеси ПАУ, включающей бенз(b)хризен. При длине волны возбуждающего света 360 нм и эмиссионного > 418 нм этот коэффициент равен для:

— бенз(b)хризена — 1,00;

— пирена — 42,40;

— бенз(е)пирена — 26,10;

— бенз(b)флуорантена — 0,99;

— бенз(k)флуорантена — 0,30;

— бенз(а)пирена — 3,00;

— бенз(а)антрацена — 19,20.

3.4. Определение ПАУ методом низкотемпературной спектрофлуориметрии

3.4.1. Определение бенз(а)пирена в сумме ПАУ методом добавки

Фракцию ПАУ, полученную по п. 3.2.2, растворяют в 5 — 10 куб. см бензола, из этого раствора в пробирку емкостью 10 куб. см отбирают 1 куб. см и добавляют к нему 2 куб. см н-октана, получая таким образом раствор с нулевой добавкой бенз(а)пирена.

Спектры люминесценции получают на спектрометре дифракционном ДФС-12 или ДФС-24, а также на любом спектрофлуориметре с разрешением не менее 0,3 нм в области 380 — 450 нм.

При перекрытом потоке УФ-излучения закрепляют пробирку, опущенную в прозрачный сосуд Дьюара, перед щелью спектрометра; спустя 2 мин. открывают доступ УФ-излучению к замерзшему раствору. Регулируя щели спектрометра, добиваются, чтобы интенсивность сигнала, создаваемого люминесценцией фона при длине волны 401,5 нм, не превышала 20% шкалы. Записывают на спектрометре спектрограмму люминесценции в области 401,5 — 410 нм. Наличие в квазилинейчатом спектре люминесценции раствора фракции ПАУ полос с максимумом 403,0 нм (более интенсивная) и 408,5 нм (менее интенсивная) свидетельствует о присутствии бенз(а)пирена в этой фракции. Запись повторяют не менее двух раз при воспроизводимости не ниже чем 10% интенсивности сигнала при 403 нм. По интенсивности в максимуме люминесценции с длиной волны 403 нм в сравнении с интенсивностью этой линии в спектрах стандартных растворов бенз(а)пирена, записанных при тех же условиях возбуждения и регистрации, определяют концентрацию стандартного раствора бенз(а)пирена для анализа методом добавки. Если интенсивность линии 403 нм в спектре исследуемого раствора с нулевой добавкой несравнимо ниже, чем интенсивность этой линии в спектре стандартного раствора концентрации 1 нг/куб. см, исходный раствор фракции ПАУ концентрируют до меньшего объема и готовят новый раствор с нулевой добавкой, а затем повторно регистрируют его спектр и сравнивают высоту пика на спектрограмме с высотой пика той же линии в спектре стандарта. Если интенсивность линии 403 нм в спектре исследуемого раствора выше, чем в спектре стандартного раствора концентрации 100 нг/куб. см, то исследуемый раствор разбавляют в таком разведении, чтобы интенсивность линии 403 нм в получаемом растворе с нулевой добавкой не превышала интенсивности этой линии, даваемой указанным выше стандартным раствором.

Для определения концентрации исследуемого раствора далее готовят пробу с добавкой, соответствующей концентрации нулевого раствора. Для этого в пробирку на 10 куб. см вносят 1 куб. см исследуемого раствора в том же разведении, что и раствора с нулевой добавкой, а также 1 куб. см н-октана и 1 куб. см стандартного раствора с концентрацией, выбранной по результатам предварительной оценки, в диапазоне 0,1 — 100 нг/куб. см. Записывают спектрограмму исследуемого раствора с добавкой, как описано выше. При правильном выборе концентрации раствора-добавки высоты пиков полосы 403 нм исследуемого раствора и раствора с нулевой добавкой должны быть сравнимыми, при этом высота пика раствора с нулевой добавкой должна быть достоверно ниже. Если высота пика на спектрограмме раствора с добавкой на порядок выше, чем у раствора с нулевой добавкой, приготавливают новый раствор с добавкой меньшей концентрации. Если высоты пиков сравнимы для обоих растворов, в качестве добавки используется стандартный раствор большей концентрации (но не выше 100 нг/куб. см). Если высота пика на спектрограмме раствора с добавкой неизмеримо ниже высоты той же линии в спектре стандартного раствора той же концентрации, то это может быть связано с гашением люминесценции примесями. В этом случае раствор разбавляют н-октаном в 10 — 100 раз и повторяют запись спектров растворов с нулевой добавкой и с добавкой стандартного раствора соответствующей концентрации.

Измеряют на спектрограмме высоту спектральной линии в максимуме при 403 нм над уровнем фона, создаваемого люминесценцией примесей при 401,5 нм в растворе с нулевой добавкой ( абсолютная) и высоту фона при той же длине волны над уровнем темнового тока ( абсолютная) и вычисляют отношение:

где — относительная интенсивность аналитической линии в растворе с 0-добавкой.

Аналогично вычисляют для повторной спектрограммы раствора с нулевой добавкой и находят:

Измеряют на спектрограмме высоту спектральной линии в максимуме при 403 нм над уровнем фона при 401,5 нм в растворе с концентрацией С0 ( абсолютная) и высоту фона при 401,5 нм над уровнем темнового тока ( абсолютная) и вычисляют отношение этих величин:

где — относительная интенсивность аналитической линии раствора с добавкой С концентрацией

Аналогично вычисляют для повторной спектрограммы этого раствора и находят среднее значение:

Вычисляют концентрацию бенз(а)пирена в исследуемой фракции по формуле:

Вычисляют содержание бенз(а)пирена (X) в образце по формуле:

где:

— объем раствора фракции в бензоле, куб. см;

n — степень разбавления раствора (n = 1, если фракцию не разбавляют и не концентрируют для окончательного анализа);

0,8 — поправка на полноту извлечения;

G — масса образца, г.

3.4.2. Определение компонентов фракции ПАУ

Для количественного определения во фракции ПАУ 17 наиболее часто исследуемых соединений последовательно записывают спектры люминесценции раствора ПАУ при селективных для каждого из этих ПАУ длинах волн возбуждающего и эмиссионного света, приведенных в табл. 57.

Таблица 57

СПЕКТРЫ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПАУ

При этом для каждого из 17 ПАУ готовят из исходного раствора фракции ПАУ серию из трех рабочих растворов, содержащих по 0,1 куб. см исходного раствора, соответственно 0,1, 0,05 и 0,00 куб. см н-октана и 0,00, 0,05 и 0,1 куб. см эталонного раствора определяемого соединения с концентрацией, выбранной в зависимости от ориентировочно найденной его концентрации в исследуемом растворе. Для бенз(а)пирена диапазон концентраций эталонного раствора составляет 1 — 100 нг/куб. см, для перилена — 1 — 10 нг/куб. см, для остальных ПАУ — 1 — 1000 нг/куб. см. На полученных спектрограммах замеряют высоты спектральных линий в максимумах аналитических длин волн, приведенных в табл. 57, и определяют относительную интенсивность аналитических линий (аналогично п. 3.4.1). Расчет содержания компонентов фракции ПАУ в образце проводят по формуле, приведенной в разделе 3.4.1.

3.5. Определение бенз(а)пирена методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре

Фракцию бенз(а)пирена, выделенную согласно п. 3.2.3, растворяют в 1 куб. см бензола. В качестве раствора сравнения используют раствор, получаемый при добавлении 50 — 200 нг бенз(а)пирена к «холостому опыту» и разведенный в 1 куб. см бензола. Записывают спектры флуоресценции этих растворов при длине волны возбуждающего света 388 нм в области 400 — 450 нм так, чтобы интенсивность в максимуме пика при 403 — 406 нм была не менее 25% и не более 90% шкалы. При необходимости изменяют разведение растворов и чувствительность прибора и снова записывают спектры в одном и том же режиме и при одинаковом разведении растворов.

Содержание бенз(а)пирена (X) в образце (мкг/кг) рассчитывают по следующей формуле:

где:

С — концентрация раствора стандарта, мкг/куб. см;

— интенсивность флуоресценции раствора пробы;

— интенсивность флуоресценции раствора сравнения;

V — объем пробы, куб. см;

G — масса образца, г;

0,75 — поправка на полноту извлечения.

4. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), а также предел определения, по данным авторов методики, приведены в табл. 58.

Таблица 58

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ДОПУСТИМЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr) И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

VI. Показатели окислительной порчи масел

1. Перекисное число

Метод основан на реакции взаимодействия продуктов окисления растительных масел и животных жиров (перекисей и гидроперекисей) с йодистым калием в растворе уксусной кислоты и хлороформа с последующим количественным определением выделившегося йода раствором тиосульфата натрия титрометрическим методом по ГОСТ Р (ИСО 3960-1998).

Специфические приборы и реактивы

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

Колбы Кн-I-250-29/32 ТСХ по ГОСТ 25336.

Колба I (2)-1000-2 по ГОСТ 1770.

Стаканчики стеклянные цилиндрические для испытуемой пробы.

Бюретки 1-1(2,3), 3-1(2)-5-0,02; 1-1(2,3)-1(2)-10-0,05 по ГОСТ 29251.

Пипетки 2-2-1(2)-1 по ГОСТ 29297.

Цилиндры 1(3)-25, 1(3)-100 по ГОСТ 1770.

Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч., ледяная, не содержащая кислорода.

Хлороформ по ГОСТ 20015 свежеперегнанный, не содержащий кислорода.

Калий йодистый.

Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия).

Стандарт-титры тиосульфата натрия 0,1 г-моль.

Крахмал растворимый.

Вода дистиллированная.

Проведение испытания

Готовят раствор крахмала: 5 г растворимого крахмала смешивают с 30 куб. см воды, добавляют 1000 куб. см кипящей воды и кипятят в течение 3 мин.

Готовят раствор тиосульфата натрия из стандарт-титров (1 ампула на 1 куб. дм дистиллированной воды). Для получения раствора тиосульфата натрия необходимых молярных концентраций 0,002 моль/куб. дм и 0,01 моль/куб. дм раствор разбавляют в 50 и 10 раз соответственно. Разбавление проводят непосредственно перед использованием.

Раствор йодистого калия хранят в темном сосуде. Для приготовления 50%-ного раствора KJ нужно 12,5 г поместить в колбу на 25 куб. см и долить до метки дистиллированной водой.

В колбу со взвешенной пробой приливают 10 куб. см хлороформа, быстро растворяют пробу, приливают 15 куб. см уксусной кислоты и 1 куб. см 50%-ного раствора йодистого калия, после чего колбу закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин. и оставляют на 20 мин. в темном месте. Приливают в колбу 75 куб. см воды, перемешивают и добавляют раствор крахмала до появления слабой однородной фиолетово-синей окраски. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия до молочно-белой окраски, устойчивой в течение 5 сек.

Выполняют контрольное определение параллельно с основным определением.

Обработка результатов

Перекисное число вычисляют по формуле:

ммоль акт. кислорода/кг,

где:

V — объем раствора тиосульфата натрия, использованный при определении, куб. см;

— объем раствора тиосульфата натрия, использованный при контрольном определении;

С — действительная концентрация использованного раствора тиосульфата натрия, вычисленная с учетом поправки к номинальной концентрации;

m — масса испытуемой пробы, г.

За определение принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Расхождение между результатами двух независимых единичных определений, выполненных при использовании одного метода, не должно превышать 10% от среднего значения перекисного числа для перекисных чисел менее 3 ммоль акт. кислорода/кг.

2. Кислотное число

Метод основан на реакции нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в маслах (ГОСТ 5476-64).

Специфические приборы и реактивы

Колбы конические вместимостью 250 мл по ГОСТ 10394-63.

Бюретки вместимостью 25 и 50 мл с делениями 0,1 мл по ГОСТ 1770-64.

Микробюретки вместимостью 2 мл с делениями 0,01 мм.

Весы технические.

Баня водяная.

Фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.

Кали едкое, 0,1Н водный раствор.

Эфир этиловый.

Спирт этиловый технический.

Проведение испытания

В коническую колбу на технических весах отвешивают 3 — 5 г испытуемого масла, приливают 50 куб. см нейтрализованной смеси (спирта с этиловым эфиром) и взбалтывают. Полученный раствор при взбалтывании быстро титруют 0,1Н раствором едкого кали до получения слабо-розовой окраски, устойчивой в течение 30 сек.

Обработка результатов

Кислотное число испытуемого масла (X) в мг вычисляют по формуле:

где:

V — объем 0,1 н раствора едкого кали или едкого натра, израсходованного на титрование, в куб. см;

К — поправка к титру 0,1 н раствора едкого кали или едкого натра;

G — навеска испытуемого масла;

5,611 — постоянный множитель, независимо от применяемой щелочи.

Конечный результат выражается как среднее арифметическое между двумя параллельными определениями: при испытании масел не более 0,06 мг.

Приложение 1

РАСЧЕТ МЕТРОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МЕТОДОВ И ВНУТРЕННИЙ ОПЕРАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ

Воспроизводимость (точность) — разброс относительно среднего результата, оценивают по отношению среднеквадратичного (стандартного) отклонения (sr) к среднему значению, выраженному в процентах. Правильность оценивают по измерению известного количества вещества в пробе и выражают в процентах. Сходимость — допустимое расхождение параллельных измерений при Р = 0,95, вычисляют по формуле 2,8 x sr.

Относительная сходимость — отношение сходимости к среднему арифметическому значению параллельных измерений, выраженное в процентах.

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95). Образцами для оперативного контроля воспроизводимости являются представительные пробы экстрактов (гидролизатов). Отбирают две пробы и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, т.е. получают 2 результата анализа, используя разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

где:

— результат анализа рабочей пробы, мкг/куб. см;

— результат анализа этой же пробы, полученный другим аналитиком с использованием другой мерной посуды и другой партии реактивов, мкг/куб. см;

— среднее значение результатов двух анализов, мкг/куб. см;

D — допустимые расхождения между результатами анализа одной и той же пробы, соответствующие относительной сходимости каждого метода.

Образцами для оперативного контроля точности являются представительные пробы экстрактов (гидролизатов), к которым делаются добавки определяемого вещества в виде раствора. Отбирают две пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы его содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 — 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X’. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X’ получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

где:

С — добавка к пробе в виде раствора концентрацией, мкг/куб. см;

— норматив оперативного контроля погрешности, мкг/куб. см.

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:

где:

— характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/куб. см.

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают:

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Analysis of Essential Oils by GC and MS // Edited by Yashiro Masada, J. Wiley and Y. Sons inc. N.Y., 1991.

2. Biochem. J., 27. 1824 (1933) «Specification for identity and purity of certain food additives FAO Food and Nutrition 38 JECFA. Food and agriculture organisation of United Nation». Rome, 1988. P. 228.

3. Carotenoids as colorants and vitamin A precursors. Technological and nutritional applications // Edited by J.C. Bauernfeind. New York: Academic Press, 1981. P. 883 — 918.

4. Flavoring Substances and Natural Sources of Flavorings // 4th Edition Counsil of Europe. Strasbourg, 1992.

5. Isler O., Brubacher G. Vitamine. Part 1 // Georg Thieme Verlag. Stuttgart, 1982. 183 p.

6. Official Methods of Analysis of the АОАС, 15th ed. 1990. Arlington.

7. Ollilalainen V., Finglas P.M., van den Berg H., Froidmontt-Gortz I. Certification of B-group vitamins in four food reference materials // J. Agr. And Food Chem. 2001. V. 49. N 1. P. 315 — 321.

8. «Виларин» ТУ 9361-002-00481152-99.

9. 865 душистых веществ для парфюмерии и бытовой химии / С.А. Войткевич. М.: Пищевая промышленность, 1994.

10. Лебедзинска А., Эллер К.И., Тутельян В.А. Определение биогенных аминов в рыбе и рыбопродуктах с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журнал аналитической химии. 1989. T. XLIV. Вып. 5. С. 928 — 931.

11. Кыргызский горный бальзам — мумие / Б.К. Корчубеков, О.Н. Нарбеков. Бишкек: Архар-Таш, 1992.

12. ВФС 68-86-93. Таблетки мумие экстракта, покрытые оболочкой.

13. Голубкина Н.А., Прудник О.В. // Журнал аналитической химии. 1989. T. XLIV. Вып. 8. С. 1349 — 1360.

14. ГОСТ 5476-64. Масла растительные. Метод определения кислотного числа.

15. ГОСТ Р (ИСО 3960-1998). Масла растительные. Метод определения перекисного числа.

16. ГОСТ Р 51483-99. Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме.

17. ГОСТ Р 51486-99. Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот.

18. ГОСТ 8558.1-78, ГОСТ 8558.2-78, ISO/DIS 6635, 1980. Мясные продукты. Методы определения нитрата и нитрита.

19. ГОСТ Р 50502-93. Напитки безалкогольные. Методы определения аспартама, сахарина, кофеина и бензоата натрия.

20. ГОСТ 24556-89. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С.

21. ГОСТ 29270-95. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения нитратов и нитритов.

22. ГОСТ Р 30711-2001. Продукты пищевые. Методы выявления и определения содержания афлатоксинов B1 и М1.

23. ГОСТ 26930-86. Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка.

24. ГОСТ 30178-96. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт.

25. ГОСТ 26929-94, ГОСТ 26927-86. Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов. Межгосударственный стандарт.

26. ГОСТ 28038-89. Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения микотоксина патулина.

27. ГОСТ 30627.2-98. Продукты молочные для детского питания. Методы измерений массовой доли витамина С (аскорбиновой кислоты).

28. ГОСТ Р 51650-2000. Продукты пищевые. Методы определения массовой доли бенз(а)пирена.

29. ГОСТ 9517-94. Топливо твердое. Методы определения выхода гуминовых кислот.

30. Госфармакопея СССР. XI изд. Т. 1 — 2.

31. Дополнение N 4274-87 к СанПиН 42123-4083-86. Временные гигиенические нормативы и метод определения содержания гистамина в рыбопродуктах.

32. Европейская фармакопея, 1997: 0957.

33. Ляпков Б.Г., Воробьева Л.Ш., Медведев Ф.А. и др. Экстракционное концентрирование и хромато-масс-спектрометрическое определение D-лимонена в маслах цитрусовых и других биологических образцах // ЖАХ. 1996. Т. 51. N 4. С. 451 — 454.

34. Методы исследования эфирных масел / Н. Гаряев, И. Плива. Алма-Ата, 1962.

35. МУ 4721-88. Методические указания по выделению, идентификации и количественному определению насыщенных, моно-, би-, три- и ряда полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах.

36. МУ 5178-90 «Методические указания по определению ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции».

37. МУК 4.4.1.011-93. Методы определения летучих N-нитрозаминов в пищевых продуктах и продовольственном сырье.

38. Немецкая фармакопея, 1997 (DAB 10).

39. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под. ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М.: Брандес-Медицина, 1998.

40. Справочник биохимика. Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991. 544 с.

41. Теоретические и клинические аспекты науки о питании. Т. 8. Методы оценки обеспеченности населения витаминами // Под ред. Волгарева М.Н. М., 1987. С. 173 — 184.

42. Французская фармакопея, X изд. Т. 2, 1990.

43. ФС 42-2725-90.

44. Эллер К.И., Пименова В.В., Левин Л.Г., Киселева М.Г. Комплексный подход к оценке подлинности окрашенных соков // Вопр. питания. 2003. N 2. С. 28 — 35.

45. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1993, N 1. С. 43 — 47.