Руководство по инструментальным методам исследований при разработке

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Валидация в соответствии с Правилами GMP – это действия, которые доказывают, что определенная методика, процесс, оборудование, сырье, деятельность или система действительно приводят к ожидаемым результатам [5].

Согласно российского стандарта ГОСТ Р ИСО 9000-2008, понятие валидация определена как подтверждение посредством представления объективных свидетельств того, что требования, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены [4].

Основой для проведения процедуры валидации служат методы статистической обработки результатов анализа, достаточно популярно изложенные применительно к области фармации в ряде публикаций [1, 6], на которые и опираются авторы данной статьи.

Валидация метода контроля качества – это процесс установления характеристик метода, показателей его эффективности и определения его ограничений [6]. Главной задачей валидации аналитической методики является экспериментальное доказательство того, что данная методика пригодна для достижения тех целей, для которых она предназначена. При валидации аналитических методов в фармации в основном используют такие метрологические характеристики, как прецизионность, точность, воспроизводимость, повторяемость, правильность, чувствительность, устойчивость, линейность.

Основной характеристикой аналитических методик для количественного определения лекарственных средств и количественной оценки примесей является прецизионность.

Прецизионность является общим термином для выражения изменчивости повторяющихся измерений. Согласно ГОСТ прецизионность – это степень близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных регламентированных условиях [3].

Прецизионность аналитической процедуры выражает близость значений (степень разброса) между сериями измерений, полученных в результате многократного анализа одного и того же образца при заданных условиях.

Она выражается как коэффициент вариации в % (относительное стандартное отклонение, %RSD) для статистически значимого количества образцов (n ≥ 10).

, (1)

где S – среднеквадратическое отклонение экспериментальных величин,

– концентрация анализируемого вещества (среднее значение).

Среднеквадратичное отклонение от среднего (стандартное отклонение выборки, S) является мерой рассеяния (дисперсии) результатов измерений и рассчитывается по формуле (2):

, (2)

где xi – результат эксперимента.

В измерениях принято использовать несколько типов прецизионности, в частности таких, как: повторяемость (сходимости, r) и воспроизводимость (R) результатов.

Повторяемость выражает прецизионность при одинаковых рабочих условиях на протяжении короткого промежутка времени, то есть является мерой прецизионности при выполнении ряда условий:

– работает один и тот же исследователь,

– используется один и тот же прибор,

– используется один и тот же метод,

– анализы выполняются в течении короткого промежутка времени,

– используется идентичный объект испытания,

– исследования проводятся в одной и той же лаборатории.

Мерой повторяемости является стандартное отклонение повторяемости (Sr ) и предел повторяемости (r). Предел повторяемости (сходимости) – это значение, которое с доверительной вероятностью 95 % не превышается абсолютной величиной разности между результатами двух измерений (или испытаний), полученными в условиях повторяемости (сходимости).

, (3)

где f – коэффициент критического диапазона.

Величина f (коэффициент критического диапазона) зависит от доверительного уровня вероятности и закона распределения случайной величины. Для пределов воспроизводимости и повторяемости доверительный уровень вероятности составляет 95 %, и в ГОСТ Р ИСО 5725 делается допущение, что лежащее в основе распределение является приближенно нормальным. Для нормального распределения на уровне вероятности 95 % коэффициент равен 1,96 [3].

Воспроизводимость результатов выражает прецизионность, оцененную по результатам, полученным разными исследователями (внутрилабораторная) или в разных лабораториях (межлабораторная) при выполнении ряда условий:

– работают разные исследователи,

– используется один и тот же метод,

– используется идентичный объект испытания,

– исследования проводятся в одной и той же (внутрилабораторная) или разных лабораториях.

При внутрилабораторных испытаниях прецизионности наблюдения осуществляются в одной и той же лаборатории, но при этом один или несколько факторов – «время», «оператор» или «оборудование» – могут меняться. При установлении прецизионности метода измерений очень важно точно определить соответствующие условия наблюдения, т.е. должны ли быть три вышеупомянутых фактора неизменными или нет. Внутрилабораторные испытания в различные моменты времени учитывают влияние изменения условий окружающей среды и перекалибровки оборудования между наблюдениями. Если в условиях повторяемости наблюдения осуществляются при неизменности всех внутрилабораторных факторов, то в условиях воспроизводимости эти факторы наоборот изменчивы. Если наблюдения выполняются в различных лабораториях, проявляются дополнительные эффекты, являющиеся следствием различия между лабораториями (в административном управлении, материально-техническом обеспечении, проверке стабильности наблюдений и т.д.).

Мерой воспроизводимости является стандартное отклонение воспроизводимости (SR ) и предел воспроизводимости (R = 2,77 SR).

Необходимость рассмотрения прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-2002 [3] возникает из-за того, что измерения, выполняемые на предположительно идентичных материалах, при предположительно идентичных обстоятельствах, не дают, как правило, идентичных результатов. Это объясняется неизбежными случайными погрешностями, присущими каждой измерительной процедуре, а факторы, оказывающие влияние на результат измерения, не поддаются полному контролю. При практической интерпретации результатов измерений эта изменчивость должна учитываться. Различия между результатами измерений, выполняемых разными операторами и/или с использованием различного оборудования, как правило, будут больше, чем между результатами измерений, выполняемых в течение короткого интервала времени одним оператором с использованием одного и того же оборудования.

Как применяются методы валидации в фармацевтическом анализе, можно проанализировать на примере анализа спирта этилового, который осуществляется в соответствии с ГОСТ Р 51698-2000, изм.1 «Газохроматографический экспресс-метод определения содержания токсичных микропримесей» [2].

Целью исследования является:

– доказательство пригодности метода для оценки качества лекарственных средств в соответствии с требованиями нормативных документов в условиях Испытательной контрольно-аналитической лаборатории ГУЗ «Центр сертификации и контроля качества лекарственных средств Рязанской области»;

– определение характеристики прецизионность, которая включает два показателя: повторяемость и воспроизводимость;

– разработка Стандартной операционной процедуры (СОП) «Валидация газохроматографического метода испытаний спирта этилового 95 %».

Газохроматографический метод применяется для анализа летучих веществ, либо веществ, которые могут быть переведены в парообразное состояние. В газовом хроматографе происходит разделение токсических микропримесей, содержащихся в спирте этиловом и последующее их детектирование пламенно-ионизационным детектором. В нашем случае применяется метод абсолютной градуировки, основанный на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью пика на хроматограмме. Полученная хроматограмма служит основой для качественного и количественного анализа токсических микропримесей в спирте этиловом.

Определение показателя «Повторяемость» выполняется одним провизором-аналитиком путем анализа 10 проб одного и того же образца трех серий спирта этилового 95 %.

Определение показателя «Воспроизводимость» оценивается по результатам анализов, выполненными параллельно двумя провизорами-аналитиками путем анализа 10 проб одного и того же образца трех серий спирта этилового 95 %.

Для примера приведены результаты испытания одной серии спирта этилового одним аналитиком по количественному содержанию метанола (табл. 1) и пропанола-2 (табл. 2) в анализируемом образце. По результатам испытаний проведён расчет среднеквадратичного отклонения (Sr) и коэффициента вариации ( %RSD). Результаты остальных испытаний по показателю повторяемости сведены в табл. 3. Результаты испытаний по показателю воспроизводимости сведены в табл. 4, по результатам испытаний проведён расчет среднеквадратичного отклонения (SR) и коэффициента вариации ( %RSD).

Таблица 1

Результаты анализа одного образца этилового спирта 95 % на содержание метанола, проведенные одним провизором-аналитиком

Заключение: коэффициент вариации ( %RSD) для 10 измерений по метанолу составил 3,3 %, что соответствует требованиям ГОСТ (не более 5 %) [3].

Таблица 2

Результаты анализа одного образца этилового спирта 95 % на содержание пропанола-2, проведенные одним провизором-аналитиком

Заключение: коэффициент вариации (RSD) для 10 измерений по содержанию пропанола-2 составил 11,6 %, что соответствует требованиям ГОСТ (не более 5 %) [3].

Таблица 3

Результаты расчета по показателю «повторяемость» (сходимость) испытаний по каждой из серий спирта этилового 95 % по содержанию метанола и пропанола-2

Заключение: коэффициенты вариации (RSD) по метиловому спирту и по содержанию других токсических микропримесей соответствует ГОСТ (не более 15 %) [3].

Аналогично произведен расчет по содержанию пропанола-2, коэффициент вариации ( %RSD) составил 5,79 % что соответствует требованию ГОСТ – должен быть не более 7 % [3].

Из результатов испытаний, проведенных двумя аналитиками в одной и той же лаборатории на одном и том же приборе, следует, что показатели повторяемости (сходимости) и воспроизводимости не превышают указанные пределы, установленные ГОСТ.

Повторная валидация обычно проводится при изменении условий проведения метода и по истечении определенного промежутка времени, в данном случае организация установила срок проведения повторной плановой валидации через пять лет.

Таблица 4

Результаты расчета по показателю «воспроизводимость» по одной из серий спирта этилового 95 % по содержанию метанола

Заключение: коэффициент вариации ( %RSD) составил по метанолу
0,38 % , что соответствует требованию ГОСТ – должен быть не более 6 %
[3].

Выводы

Пригодность метода для оценки качества спирта этилового 95 % в соответствии с требованиями нормативных документов (ОФС) в условиях Испытательной контрольно-аналитической лаборатории ГУЗ «Центр сертификации и контроля качества лекарственных средств Рязанской области» подтверждена характеристикой «Прецизионность», которая включает два показателя – повторяемость и воспроизводимость. Разработана Стандартная операционная процедура (СОП) «Валидация газожидкостного метода испытаний спирта этилового 95 %», обеспечивющая надежность результатов и пригодная для целей определения качества спирта этилового.

Библиографическая ссылка

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Проблема злоупотребления психоактивными веществами в России из года в год становится все более актуальной. В последнее время участились случаи обнаружения сибутрамина и его активных метаболитов (М1 и М2) в биологически активных добавках для похудения (БАД). Федеральная Служба РФ по контролю за оборотом наркотиков в Методических рекомендациях по криминалистическому исследованию сибутрамина от 2006 г. сообщала, что, с учетом дофаминовой теории формирования наркологических заболеваний, сибутрамин может вызывать привыкание и зависимость, а клинические описания его действия позволяют предположить использование его потребителями психоактивных веществ в качестве психостимулятора [4]. С 2008 года сибутрамин, а также его структурные аналоги, обладающие схожим психоактивным действием, включены в список сильнодействующих веществ для целей статьи 234 и других статей Уголовного кодекса Российской Федерации [3].

Сибутрамин метаболизируется изоферментом CYP3А4 до деметилированных метаболитов M1 и М2 (моно- и дидесметилсибутрамин), которые обуславливают его терапевтический эффект и являются структурными аналогами сибутрамина [6, 7, 8]. Установлено, что десметилсибутрамин (ДМС) и дидесметилсибутрамин (ДДМС) примерно в 100 раз активнее исходного соединения [5, 8].

Согласно действующему законодательству РФ, сильнодействующие вещества и их аналоги запрещены к использованию в составе БАД [2]. Ввиду сложившейся ситуации вопрос об усовершенствовании процедуры обнаружения посторонних токсикологически важных веществ, не заявленных в составе БАД, стоит достаточно остро. Однако на сегодняшний день в литературных источниках отсутствует какая-либо информация по процедуре контроля БАД на наличие сильнодействующих веществ, в то время как в практике судебно-химических исследований имеются факты обнаружения данных веществ в биологически активных добавках к пище.

Цель исследования

Разработка методики количественного определения активного метаболита сибутрамина, ДМС, методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ).

Материал и методы исследования

Субстанцию ДМС получали из содержимого капсул «Жуйдэмэн» (500 мг, № 60), содержащих данное вещество, при комнатной температуре следующим образом: содержимое капсул высыпали в чистую стеклянную склянку, залили спиртом этиловым 95% (1:10), встряхивали в течение 15 минут, затем надосадочную жидкость сливали в чистую стеклянную склянку. Оставшийся осадок вновь заливали спиртом этиловым 95% и операции повторяли. Надосадочные жидкости объединяли и выпаривали без нагревания до сухого остатка. Получившийся сухой остаток брался из расчета, что его состав соответствует экстракту содержимого одной капсулы. После перекристаллизации экстракт был проанализирован на газовом хроматографе Agilent 7890A с масс-спектрометром Agilent 5975C, в результате чего была идентифицирована и подтверждена его химическая структура: масс-спектр пика со временем удерживания 13,18 мин соответствовал библиотечному масс-спектру ДМС (рис. 1).

Рисунок 1. Хроматограмма перекристаллизованного экстракта (верхняя часть рисунка), масс-спектр пика с временем удерживания 13,18 мин (средняя часть рисунка) и библиотечный масс-спектр десметилсибутрамина (нижняя часть рисунка).

Готовили растворы ДМС в этиловом 96 % спирте в концентрациях 1 мг/мл, 500 мкг/мл, 200 мкг/мл, 100 мкг/мл, 50 мкг/мл и 10 мкг/мл. В качестве внутреннего стандарта использовали раствор метилстеарата в 96 % этиловом спирте в концентрации 1 мг/мл.

Исследование проводили на газовом хроматографе Хроматэк-Кристалл 5000 с пламенно-ионизационным детектором в следующих условиях: колонка HP-5MS, скорость потока газа-носителя (азот) 2,3 мл/мин, температура термостата колонки начальная 170 °С, конечная – 220 °С, температура детектора 250 °С, температура испарителя 230 °С, ввод пробы с делением потока 1/3, объем вводимой пробы 1 мкл, время хроматографирования 18 мин.

Результаты исследования и их обсуждение

Количественное определение ДМС осуществляли методом ГЖХ с расчетом концентрации по методу внутреннего стандарта, в качестве которого был выбран метилстеарат, преимуществами использования которого являются его хроматографические свойства, близкие к определяемому веществу, стабильность полученных результатов, и доступность для закупки на территории РФ.

Время удерживания ДМС и метилстеарата в заданных условиях хроматографирования составило 7,07 мин и 10,93 мин соответственно (рис. 2).

Рисунок 2. Хроматограмма раствора ДМС с внутренним стандартом (метилстеарат) в концентрации 1000 мкг/мл.

Валидацию разработанной методики осуществляли по показателям: линейность, правильность, прецизионность (на уровне intra-day и inter-day), аналитическая область [1].

Линейность

Для определения линейности проводили анализ 6 калибровочных спиртовых растворов ДМС с концентрациями от 10 мкг/мл до 1000 мкг/мл в присутствии внутреннего стандарта (1000 мкг/мл) (табл. 1).

Таблица 1

Значения концентраций калибровочных растворов и отношений площадей пиков ДМС к площадям пиков метилстеарата

*СДМС – концентрация десметилсибутрамина в растворе, СМС – концентрация метилстеарата в растворе,

SДМС – площадь пика ДМС, SМС – площадь пика метилстеарата.

По полученным значениям строили график линейной зависимости. Были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой у = 0,0006х методом наименьших квадратов, где у – среднее значение отношения площади пика ДМС к площади пика метилстеарата, рассчитанное по трем хроматограммам, х – концентрация ДМС, мкг/мл (Сфакт). (рис. 3).

Рисунок 3. Калибровочный график зависимости отношения площади пика ДМС к площади пика метилстеарата от концентрации ДМС в растворе

Квадрат линейного коэффициента корреляции (R2) характеризует степень соответствия между регрессионной моделью и исходными данными. В данном случае 99,68% изменений зависимой переменной описывается регрессионным уравнением. Коэффициент корреляции R = 0,9984, что свидетельствует о наличии прямой линейной зависимости между площадью пика ДМС и его концентрацией в растворе.

Правильность и прецизионность

Для оценки правильности и прецизионности методики проводили анализ 3 калибровочных спиртовых растворов ДМС с концентрациями 10 мкг/мл, 200 мкг/мл, и 1000 мкг/мл в течение первого дня (intra-day) и второго дня (inter-day). Каждый раствор хроматографировали в трех повторностях. Для полученных значений концентрации ДМС рассчитывали величину стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и отклонение от заданной величины (ε, %). Данные представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Оценка правильности и прецизионности (intra-day)

*Сфакт – фактическая концентрация ДМС в растворе, Сизм – концентрация ДМС в растворе, рассчитанная по методике.

Таблица 3

Оценка правильности и прецизионности (inter-day)

*Сфакт – фактическая концентрация ДМС в растворе, Сизм – концентрация ДМС в растворе, рассчитанная по методике.

Полученные значения RSD и ε свидетельствуют о достаточной степени соответствия между истинным значением определяемого вещества и его значением, рассчитанным по данной методике.

Аналитическая область методики

Аналитическая область методики на основании результатов оценки линейности, правильности и прецизионности составила 10 – 1000 мкг/мл.

Заключение

Разработана методика количественного определения десметилсибутрамина методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией, обладающая необходимой линейностью, правильностью и прецизионностью, что позволяет говорить о хороших валидационных характеристиках данной методики.

Рецензенты:

Вихарева Е.В., д.фарм.н., доцент, заведующий кафедрой аналитической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь;

Ярыгина Т.И., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической химии факультета очного обучения ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.

Библиографическая ссылка