Руководство к практическим занятиям по микробиологии 1983 - Большая энциклопедия инструкций и руководств

Авторы:

Пименова М.Н.,

Гречушкина Н.Н.,

Азова Л.Г.,

Семенова Е.В.,

Мыльникова С.И.
Год издания:
1983
Место издания:
Изд.МГУ М
Объём:

186 страниц
Добавил в систему:
Семенова Елена Владимировна

Источник

Руководство к практическим занятиям по микробиологии

Автор М.Н.Пименова, Н.Н.Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И.Нетрусов и др.

ОГЛАВЛЕНИЕ

РУКОВОДСТВО

ББК 28.4 Р 85

УДК 576.8 (075.8)

К ПРАКТИЧЕСКИМ

ЗАНЯТИЯМ

ПО МИКРОБИОЛОГИИ

3-е издание, переработанное и дополненное Под редакцией Н. С. Егорова

Авторы:

М. Н. Пименова, Н. Н. Гречушкина, Л. Г. Азова, А. И. Нетрусов, Е. В. Семенова, Н. Н. Колотилова, Л. М. Захарчук, В. В. Зинченко, С. И. Мыльникова, М. В. Нефедова, И. В. Ботвинко

Рекомендовано Госкомитетом Российской Федерации по высшему образованию в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению «Биология» и специальностям «Биология» и «Микробиология»

Федеральная программа книгоиздания России

Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Р 85 Учеб. пособие / Под ред. Н. С. Егорова. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ, 1995. — 224 с: ил. ISBN 5-211-03358—2

В «Руководстве к практическим занятиям по микробиологии» сохранена общая структура предыдущего издания (1-е изд. вышло в 1971 г., второе — в 1983). Существенно переработаны главы об общей характеристике микроорганизмов, их морфологии; включены новые главы о генетике, химическом составе клеток, систематике и идентификации микроорганизмов; с учетом последних достижений в области микробиологии пересмотрены и другие разделы учебного пособия. В книге приведены обобщенные данные отличительных признаков эукариотических и дрокариотических организмов, типы энергетического и конструктивного метаболизма.

ИЗДАТЕЛЬСТВО

МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ИЗ ПРЕДИСЛОВИЯ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ

Идея создания руководства к практическим занятиям по микробиологии принадлежит академику В. Н. Шапошникову, возглавлявшему в течение 29 лет кафедру микробиологии Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, и доценту А. Я. Мантейфель, которая длительное время работала на той же кафедре и была автором первых программ малого практикума для студентов. Однако при их жизни этот замысел не был осуществлен. Авторы настоящего пособия — ученики В. Н. Шапошникова и А. Я. Мантейфель — сочли своим долгом создать такое руководство, отразив в нем присущий школе академика В. Н. Шапошникова физиологический подход к изучению микроорганизмов.

В процессе подготовки книги был использован многолетний педагогический опыт кафедры микробиологии МГУ, где слушают теоретический курс и выполняют практические занятия по микробиологии все студенты-биологи 3-го года обучения. Различие в объеме и содержании лекционных курсов для студентов разных специальностей потребовало создания отдельных программ практических занятий. Для студентов-микробиологов малый практикум по микробиологии — это лишь первый этап знакомства с миром микроорганизмов, после чего они на 4-м курсе выполняют задачи большого практикума. Студентам других специальностей практические занятия по микробиологии послужат основой для получения навыков работы с микроорганизмами.

При составлении руководства авторы исходили также из принятого на кафедре микробиологии МГУ метода проведения практических занятий, в основе которого лежит принцип самостоятельной работы студентов.

Авторы выражают надежду, что предлагаемое руководство может быть полезным не только студентам университетов, но и студентам других учебных заведений, изучающим микробиологию, а также специалистам смежных областей, которым приходится работать с микроорганизмами.

ПРЕДИСЛОВИЕ К ТРЕТЬЕМУ ИЗДАНИЮ

Современное развитие биологии и биотехнологии, в которых существенную роль играет микробиология, ставит задачу познания микроорганизмов и методов работы с ними перед специалистами, занимающимися не только микробиологией, но и генетикой, молекулярной биологией, биохимией, а также занятыми в других областях науки. За двенадцать лет после выхода в свет второго издания книги «Руководство к практическим занятиям по микробиологии» (Изд-во МГУ, 1983) появились новые данные о микроорганизмах и методах работы с ними, что и отражено в 1-й главе книги. Включена глава по генетике микроорганизмов, изменения и дополнения внесены в другие главы.

Из коллектива авторов 1-го и 2-го изданий ушла из жизни Л. Г. Азова, не работают на кафедре микробиологии МГУ М. Н. Пи-менова и Н. Н. Гречушкина, однако их вклад в написание книги и их основные идеи сохранены в новом издании. Над подготовкой 3-го издания руководства работали сотрудники кафедры микробиологии МГУ: И. В. Ботвинко, Л. М. Захарчук, В. В. Зинченко, Н. Н. Коло-тилова, С. И. Мыльникова, А. И. Нетрусов, М. В. Нефелова, Е. — В. Семенова. Большую помощь в разработке отдельных задач практикума оказали И. Б. Наумова, В. В. Асеев, М, В. Гусев, М. Б. Куплетская, Е. Н. Красильникова, за что авторы им очень признательны.

Коллектив авторов, работавших над 3-м изданием руководства, выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой микро-биологии МГУ академику РАН профессору Е н Кондратьевой

за поддержку инициативы в переиздании этого учебного пособия и денные советы и замечания при его подготовке.

Н. С. Егоров.

ГЛАВА 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Микроорганизмы — это мельчайшие живые существа, величина которых в большинстве случаев не превышает 0,1—0,2 мм, что делает их невидимыми для человеческого глаза без увеличения. Мир микробов, населяющих нашу планету, велик и разнообразен. Они различаются между собой морфологически, а также физиологическими и биохимическими свойствами. По принципу клеточной организации все микроорганизмы могут быть разделены на два типа — прокариоты и эукариоты. У прокариот ядерный аппарат, называемый часто нуклеоидом, представлен кольцевой молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. У эукариот ядро содержит набор хромосом и отделено от цитоплазмы мембраной. Различия в организации ядерного аппарата коррелируют с рядом других особенностей эу- и прокариот (табл. 1). Первоначально к микроорганизмам относили и вирусы, однако в настоящее время их чаще рассматривают как особые формы жизни, не имеющие клеточного строения и содержащие, в отличие от про- и эукариот, лишь один тип нуклеиновых кислот (ДНК или РНК).

Среди прокариот различают бактерии (или эубактерии) и археи (или архебактерии). Основанием для выделения этих групп, рассматриваемых некоторыми исследователями как отдельные царства, послужили результаты сравнения олигонуклеотидных последовательностей 16S рибосомных РНК, а также выявления различий в составах клеточных стенок, липидов и ряда других особенностей. Большинство известных прокариот составляют различные группы бактерий (эубактерии). Известные архебактерии включают метаногенов, отдельных сульфатредукторов, экстремальных галофилов, термоплазм, лишенных клеточной стенки, а также экстремально термофильных бактерий, окисляющих и восстанавливающих молекулярную серу. За последние годы обнаружено значительное число новых представителей архей.

1.1.1. Размеры и форма клеток

Большинство прокариот — одноклеточные формы. Величина клеток многих прокариот находится в пределах 0,2—10,0 мкм. Однако среди них есть «карлики» (примерно 0,1 мкм — трепонемы, микоплазмы) и «гиганты» (длиной до 100 мкм — Achromatism, Macromonas). Формы ,клеток бактерий не отличаются большим разнообразием. Это чаще всего палочки разной длины, сферические клетки (кокки), а также извитые формы — вибрионы, спириллы и спирохеты. Обнаружены виды с треугольными, квадратными и плоскими (тарелкообразными) клетками, некоторые имеют отроет-, ки-простеки (рис. 1—7).

Тип группирования клеток иногда «помогает определить систематическую принадлежность бактерий. Они могут быть одиночными, объединяться в пары, короткие и длинные цепочки правильной (стрептококки) и неправильной (стафилококки) формы, образовывать пакеты из 4, 8 и более клеток (сардины), формировать розетки и сети. Значительное число бактерий из актиномицетной группы образуют мицелий. Известны также многоклеточные прокариоты, образующие трихомы, прямые и ветвящиеся (рис. 8— 13).

1.1.2. Строение клеток

Большинство прокариот имеет ригидную клеточную стенку, под которой расположена цитоплазматическая мембрана. Состав и строение клеточной стенки — важный систематический признак, по которому прокариоты подразделяют на следующие группы: грам-положительные, грамотрицательные и не имеющие клеточной стенки. Своеобразным строением и составом клеточной стенки характеризуются археи. Грамположительные бактерии отличаются от храмотрицательных большим (до 40 раз) содержанием муреина (пептидогликана) в клеточной стенке и отсутствием внешней мембраны. Археи муреина не синтезируют, но некоторые образуют псевдомуреин.

У многих бактерий на поверхности находят ворсинки (фимбрии, пили), а подвижные формы часто идоеют жгутики. На поверхности клеточных стенок многих прокариот можно обнаружить слизистые капсулы различной толщины. Они чаще всего полисахаридной, но бывают и гликопротеидной или полипептидной природы.

Прокариоты характеризуются сравнительно простой внутриклеточной организацией и не содержат автономных органелл, хотя многие бактерии имеют включения. Среди них в первую очередь следует отметить различного рода внутриклеточные мембранные пузырьки, образованные в результате инвагинации цитоплазмати-ческой мембраны. Развитая сеть внутрицитоплазматических мембран характерна для фототрофных прокариот (хроматофоры, тила-коиды)„ нитрифицирующих и метанокисляющих бактерий. Некоторые клетки образуют газовые вакуоли (аэросомы), окруженные

Рис. 4. Клубеньковые

бактерии: i — палочки и кокки в молодой культуре; 2 — бактероиды

Рнс. 5. Миксобактерии:

1 ~— вегетативные клетки;

2 — формы, переходные к микроцистам; 3 — микроцисты; 4 г- делящиеся клетки

Рис. 6. Извитые клетки: вибрионы; 2 — спириллы; 3 — спирохеты

Рис. 7. Бактерии, образующие

выросты: I — Caulobacter; 2 — Hypho— microbium; 3 — Ancalomicro— bium; 4 — (Jallionella

Рнс. 9. Мицелий актиномицета (1) и гриба (2) при одинаковом

увеличении

Рис. И. Микобактерии: / — суточная культура; 2 •— 2-суточная; 3 — 3—4-суточная; 4 —

10-суточная

1 *

Рис. 12. Arthrobacter (1) и Corynebacterium (2)

белковой мембраной, выполняющие у

Источник

Книжные памятники Свет

Обратная связь
Добавить в
закладки

Версия для слабовидящих

Войти

НЭБ

Коллекции и спецпроекты
Новости

Электронные читальные залы
Информация для библиотек

Вопросы и ответы
Обратная связь

Наши продукты

Книжные памятники

Свет

Мы в соцсетях

Версия для слепых

Руководство к практическим занятиям по микробиологии Учеб. пособие для биол. спец. пед. ин-тов

Аникиев В.В.
, Лукомская К.А.

Скачать
rusmarc-запись

Руководство к практическим занятиям по микробиологии Учеб. пособие для биол. спец. пед. ин-тов

Аникиев В.В.
, Лукомская К.А.

Скачать rusmarc -запись

Электронная копия документа недоступна

127 с.

Количество страниц

1983

Год издания

Москва

Место издания

О произведении

Издательство

Просвещение

Библиотека

Российская национальная библиотека (РНБ)

Еще

Ближайшая библиотека с бумажным экземпляром издания

Пожалуйста, авторизуйтесь

Вы можете добавить книгу в избранное после того, как
авторизуетесь на портале. Если у вас еще нет учетной записи, то
зарегистрируйтесь.

Источник

РУКОВОДСТВО
К ПРАКТИЧЕСКИМ
ЗАНЯТИЯМ
по микро-
БИОЛОГИИ
ОГЛАВЛЕНИЕ
РУКОВОДСТВО
К ПРАКТИЧЕСКИМ
ЗАНЯТИЯМ
ПО МИКРОБИОЛОГИИ
3-е издание, переработанное и дополненное
Под редакцией Н. С. Егорова
Рекомендовано Госкомитетом Российской Федера-
ции по высшему образованию в качестве учебного
пособия для студентов высших учебных заведений,
обучающихся по направлению «Биология» н специ-
альностям «Биология» и «Микробиология»
ИЗДАТЕЛЬСТВО
МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
1995
ББК 28.4
Р 85
УДК 576.8 (075.8)
Авторы:
М. Н. Пименова, Н. Н. Гречушкина, Л. Г. Азова,
А. И. Нетрусов, Е. В. Семенова, Н. Н. Колотилова,
Л. М. Захарчук, В. В. Зинченко, С. И. Мыльникова,
М. В. Нефедова, И. В. Ботвинко
Рецензенты:
кафедра микробиологии ТСХА (зав. кафедрой В. К. Шильникова)
Федеральная программа книгоиздания России
Руководство к практическим занятиям по микробиологии:
Р 85 Учеб, пособие / Под ред. Н. С. Егорова. — 3-е изд., перераб.
и доп. — М.: Изд-во МГУ, 1995. — 224 с.: ил.
ISBN 5-211-03358—2
В «Руководстве к практическим занятиям по микробиологии» сохра-
нена общая структура предыдущего издания (1-е изд. вышло в 1971 г.,
второе — в 1983). Существенно переработаны главы об общей характе-
ристике микроорганизмов, их морфологии; включены новые главы о гене-
тике, химическом составе клеток, систематике и идентификации микроор-
ганизмов; с учетом последних достижений в области микробиологии пе-
ресмотрены и другие разделы учебного пособия. В книге приведены обоб-
щенные данные отличительных признаков эукариотических н прока-
риотических организмов, типы энергетического и конструктивного метабо-
лизма.
р 1905000000 (4309000000)—015 75_95
077(02)-95
ББК 28.4
ISBN 5-211-03358—2
© Коллектив авторов, 1995 г.
ИЗ ПРЕДИСЛОВИЯ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ
Идея создания руководства к практическим занятиям по микро-
биологии принадлежит академику В. Н. Шапошникову, возглав-
лявшему в течение 29 лет кафедру микробиологии Московского
государственного университета имени М. В. Ломоносова, и доценту
А. Я. Мантейфель, которая длительное время работала на той же
кафедре и была автором первых программ малого практикума для
студентов. Однако при их жизни этот замысел не был осуществлен.
Авторы настоящего пособия — ученики В. Н. Шапошникова и
А. Я. Мантейфель — сочли своим долгом создать такое руковод-
ство, отразив в нем присущий школе академика В. Н. Шапошнико-
ва физиологический подход к изучению микроорганизмов.
В процессе подготовки книги был использован многолетний
педагогический опыт кафедры микробиологии МГУ, где слушают
теоретический курс и выполняют практические занятия по микро-
биологии все студенты-биологи 3-го года обучения. Различие в
объеме и содержании лекционных курсов для студентов разных
специальностей потребовало создания отдельных программ прак-
тических занятий. Для студентов-микробиологов малый практикум
по микробиологии — это лишь первый этап знакомства с миром
микроорганизмов, после чего они на 4-м курсе выполняют задачи
большого практикума. Студентам других специальностей практи-
ческие занятия по микробиологии послужат основой для получения
навыков работы с микроорганизмами.
При составлении руководства авторы исходили также из приня-
того на кафедре микробиологии МГУ метода проведения практи-
ческих занятий, в основе которого лежит принцип самостоятельной
работы студентов.
Авторы выражают надежду, что предлагаемое руководство мо-
жет быть полезным не только студентам университетов, но и сту-
дентам других учебных заведений, изучающим микробиологию, а
также специалистам смежных областей, которым приходится рабо-
тать с микроорганизмами.
ПРЕДИСЛОВИЕ К ТРЕТЬЕМУ ИЗДАНИЮ
Современное развитие биологии и биотехнологии, в которых
существенную роль играет микробиология, ставит задачу познания
микроорганизмов и методов работы с ними перед специалистами,
занимающимися не только микробиологией, но и генетикой, моле-
кулярной биологией, биохимией, а также занятыми в других об-
3
ластях науки. За двенадцать лет после выхода в свет второго
издания книги «Руководство к практическим занятиям по микро-
биологии» (Изд-во МГУ, 1983) появились новые данные о микро-
организмах и методах работы с ними, что и отражено в 1-й главе
книги. Включена глава по генетике микроорганизмов, изменения и
дополнения внесены в другие главы.
Из коллектива авторов 1-го и 2-го изданий ушла из жизни
Л. Г. Азова, не работают на кафедре микробиологии МГУ М. И. Пи-
менова и И. И. Гречушкина, однако их вклад в написание книги и
их основные идеи сохранены в новом издании. Над подготовкой 3-го
издания руководства работали сотрудники кафедры микробиологии
МГУ: И. В. Ботвинко, Л. М. Захарчук, В. В. Зинченко, Н. Н. Коло-
тилова, С. И. Мыльникова, А. И. Нетрусов, М. В. Нефедова,
Е./В. Семенова. Большую помощь в разработке отдельных задач
практикума оказали И. Б. Наумова, В. В. Асеев, М, В. Гусев,
М. Б. Куплетская, Е. Н. Красильникова, за что авторы им очень
признательны.
Коллектив авторов, работавших над 3-м изданием руководства,
выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой микро-
биологии МГУ академику РАН профессору Е н Кондратьевой
за поддержку инициативы в переиздании этого учебного пособия и
ценные советы и замечания при его подготовке.
Н. С. Егоров.
ГЛАВА 1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
Микроорганизмы — это мельчайшие живые существа, величина
которых в большинстве случаев не превышает 0,1—0,2 мм, что
делает их невидимыми для человеческого глаза без увеличения.
Мир микробов, населяющих нашу планету, велик и разнообразен.
Они различаются между собой морфологически, а также физиоло-
гическими и биохимическими свойствами. По принципу клеточной
организации все микроорганизмы могут быть разделены на два
типа — прокариоты и эукариоты. У прокариот ядерный аппарат,
называемый часто нуклеоидом, представлен кольцевой молекулой
ДНК, соответствующей одной хромосоме. У эукариот ядро содер-
жит набор хромосом и отделено от цитоплазмы мембраной. Разли-
чия в организации ядерного аппарата коррелируют с рядом других
особенностей эу- и прокариот (табл. 1). Первоначально к микроор-
ганизмам относили и вирусы, однако в настоящее время их чаще
рассматривают как особые формы жизни, не имеющие клеточного
строения и содержащие, в отличие от про- и эукариот, лишь один
тип нуклеиновых кислот (ДНК или РНК).
Таблица 1
Некоторые отличительные признаки эукариот и прокариот
Характеристика Прокариоты Эукариоты
1 2 3
Цитологические признаки Наименьший размер клетки — 0,2 мкм +
Наличие оформленного ядра +
Наличие автономных органелл (митохондрии, хлоропласты) — +
Локализация рибосом: распределены в цитоплазме + —
прикреплены иа эндоплазматическом ретикулуме +
Жгутики (если присутствуют): диаметр 0,01—0,02 мкм, формула среза 8+1 + —
диаметр около 0,2 мкм, формула среза 9+2 — +
Молекулярно-биологические особенности Число хромосом 1 >1
Кольцевая хромосома + —
5
1
2
3
Линейные хромосомы Константы седиментации рибосом 70S 80S Константы седиментации рибосомной РНК 5S, 16S, 23S 5S. 5,85S, 18S, 28S 1+ 1 + 1 +1 +1 +
Признаки, основанные на химических анализах Присутствие пептидогликана + (-)
Особенности размножения Клеточное деление происходит в результате мнтоза +
Возможность мейоза — +
Перенос генов и рекомбинация включают гаметогенез н образование зигот, — +
Питание Диффузия или транспорт через мембрану + +
Эндоцитоз — +
Метаболитические особенности Дыхательный и фотосинтезирующий аппарат ассоциирован с плазматической мембраной или ее выростами + —
Возможность хемолитотрофиого метаболизма + —
Способность к фиксации молекулярного азота + —
Способность к метаногенезу + —
Способность к аноксигенному фотосинтезу + —
1.1. ПРОКАРИОТЫ
Среди прокариот различают бактерии (или эубактерии) и
археи (или архебактерии). Основанием для выделения этих групп,
рассматриваемых некоторыми исследователями как отдельные
царства, послужили результаты сравнения олигонуклеотидных
последовательностей 16S рибосомных РНК, а также выявления
различий в составах клеточных стенок, липидов и ряда других
особенностей. Большинство известных прокариот составляют раз-
личные группы бактерий (эубактерий). Известные архебактерии
включают метаногенов, отдельных сульфатредукторов, экстремаль-
ных галофилов, термоплазм, лишенных клеточной стенки, а также
экстремально термофильных бактерий, окисляющих и восстанавли-
вающих молекулярную серу. За последние годы обнаружено
значительное число новых представителей археи.
6
1.1.1. Размеры и форма клеток
Большинство прокариот — одноклеточные формы. Величина
клеток многих прокариот находится в пределах 0,2—10,0 мкм. Од-
нако среди них есть «карлики» (примерно 0,1 мкм — трепонемы,
микоплазмы) и «гиганты» (длиной до 100 мкм — Achromatism,
Macromonas). Формы клеток бактерий не отличаются большим
разнообразием. Это чаще всего палочки разной длины, сферические
клетки (кокки), а также извитые формы — вибрионы, спириллы и
спирохеты. Обнаружены виды с треугольными, квадратными и
плоскими (тарелкообразными) клетками, некоторые имеют отроет-,
ки-простеки (рис. 1—7).
Тип группирования клеток иногда помогает определить систе-
матическую принадлежность бактерий. Они могут быть одиночны-
ми, объединяться в пары, короткие и длинные цепочки правильной
(стрептококки) и неправильной (стафилококки) формы, образовы-
вать пакеты из 4, 8 и более клеток (сардины) , формировать ро-
зетки и сети. Значительное число бактерий из актиномицетной
группы образуют мицелий. Известны также многоклеточные про-
кариоты, образующие трихомы, прямые и ветвящиеся (рис. 8—
13).
1.1.2. Строение клеток
Большинство прокариот имеет ригидную клеточную стенку, под
которой расположена цитоплазматическая мембрана. Состав и
строение клеточной стенки — важный систематический признак, по
которому прокариоты подразделяют на следующие группы: грам-
положительные, грамотрицательные и не имеющие клеточной
стенки. Своеобразным строением и составом клеточной стенки
характеризуются археи. Грамположительные бактерии отличаются
от .грамотрицательных большим (до 40 раз) содержанием муреина
(пептидогликана) в клеточной стенке и отсутствием внешней мем-
браны. Археи муреина не синтезируют, но некоторые образуют
псевдомуреин.
У многих бактерий на поверхности находят ворсинки (фимбрии,
пили), а подвижные формы часто имеют жгутики. На поверхности
клеточных стенок многих прокариот можно обнаружить слизистые
капсулы различной толщины. Они чаще всего полисахаридной, но
бывают и гликопротеидной или полипептидной природы.
Прокариоты характеризуются сравнительно простой внутрикле-
точной организацией и не содержат автономных органелл, хотя
многие бактерии имеют включения. Среди них в первую очередь
следует отметить различного рода внутриклеточные мембранные
пузырьки, образованные в результате инвагинации цитоплазмати-
ческой мембраны. Развитая сеть внутрицитоплазматических мем-
бран характерна для фототрофных прокариот (хроматофоры, тила-
коиды), нитрифицирующих и метанокисляющих бактерий. Некото-
рые клетки образуют газовые вакуоли (аэросомы), окруженные
7
t ’ "
1
Рис. 1. Сочетания сферических клеток:
1 — диплококки; 2 — стрептококки; 3 — тетракокки
й сардины; 4 — стафилококки и микрококки
Рис. 2. Палочковидные
бактерии:
1 г— Pseudomonas aeruginosa;
2 •— Bacillus mycoides; 3 — Ba-
cillus megaterium; 4 — Cyto-
phaga sp.
Рис. 3. Azotobacter vinelandii:
1 — суточная культура; 2—16-суточиая;
3—10-суточная
Рис. 4. Клубеньковые
бактерии:
1 — палочки и кокки в
молодой культуре; 2 —
бактероиды
Рнс. 5. Миксобактерии:
1 — вегетативные клепки;
2 — формы, переходные к
микроцистам; 3 — микро-
цисты; 4 г- делящиеся клет-
ки
8
Рис. 6. Извитые клетки:
1 — вибрионы; 2 ,— спириллы; 3 —
спирохеты
Рис. 7. Бактерии, образующие
выросты:
1 — Caulobacter; 2 — Hypho—
microbium; 3 — Ancalomiapo—
bium; 4 — (jallionella
Рис. 8. Нитчатые бактерии:
1 — Beggiatoa; 2 '— Thiothrix; 3 — Saprospira; 4 — Sitnon-
siella; 5 — Caryophanon; 6 — цианобактерии рода Microco-
leus; 7 — Leptotrix; 8 — Sphaerotilus-, 9 — Crenothrix
$
Рис. 9. Мицелий актиномицета (7) и гриба (2) при одинаковом
увеличении
Рис. НО. Нокардии:
1 <— 2-суточная культура; 2 — 4—5-суточная; 3 — 7—8-суточная
1
Рис. И. Микобактерии:
1 — суточная культура; 2 — 2-суточная; 3 — 3—4-суточная; 4 —
10-суточная
1
Рис, 12. Arthrobacter (1) и Corynebacterium (2)
10
Рис 13 Микоплазмы.
Схема электронной
микрофотографии

Рис. 14. Типы жгутикования у бактерий:
1 ।— монотрихиальиое; 2 — лофотрихи-
альное; 3 — латеральное; 4 — амфитри-
хиальное; 5 — перитрихиальное; 6 —
«смешанное» полярно-перитрихиальное
белковой мембраной, выполняющие у водных организмов роль ре-
гуляторов плавучей плотности. Многие бактерии откладывают
внутриклеточно запасные вещества (полисахариды, поли-0-оксибу-
тират, полифосфаты, серу). Отдельные виды спорообразующих
бактерий иногда имеют параспоральные тельца белковой природы.
1.1.3. Движение клеток
Среди прокариот есть подвижные и неподвижные виды. Движе-
ние клеток чаще всего осуществляется за счет вращения жгутиков
(рис. 14). Еще одним способом движения является скольжение
клеток, механизм которого изучен недостаточно. Описано «прыгаю-
щее» движение, природа которого также не выяснена. Подвижные
бактерии способны осуществлять реакции таксиса: аэро- и фото-
таксис, хемо- и магнитотаксис.
1.1.4. Размножение и развитие прокариот
Большинство бактерий размножаются в результате бинарного
деления, реже — почкованием, а некоторые (например, актиноми-
цеты) — с помощью экзоспор или обрывков мицелия (рис. 15—18).
Известен также способ (множественного деления (у ряда цианобак-
терий). Многоклеточные про-
кариоты могут размножаться
отделением от трихома нес-
кольких или одной клетки. У
ряда бактерий обнаружена
конъюгация, однако она не
обеспечивает полной передачи
генетического материала из
одной клетки в другую.
Некоторые прокариоты ха-
рактеризуются сложным цик-
лом развития, в процессе ко-
торого может меняться морфо-
Рис. 15. Схема роста н деления
клеток Caulobacter
11
Рис. 17. Формы воздушных спороносцев у ак-
тиномицетов
Рис. 16. Гони-
дии (/) и гор-
могонии (2)
нитчатых бак-
терий
логия клеток и образуются покоящиеся формы: цисты, эндо-
споры, акинеты (рис. 19—20). Известны бактерии, образующие
плодовые тела, часто причудливых конфигураций и расцветок.
Отличительной особенностью бактерий является их способность
к быстрому размножению. «Чемпионами» в этом отношении явля-
ются фотобактерии, время генерации которых примерно 8 мин. Для
Рнс. 18. Спорангии акгиномнцетов:
1 — Actinoplanes; 2 — Amor phosporangium-,
3 — Spirillospora
Escherichia coli (время уд-
воения — 20 мин) подсчи-
тано, что потомство одной
клетки в случае неограни-
ченного роста бактерий уже
через 48 ч могло бы дать
биомассу, в 4000 раз пре-
вышающую массу Земли.
Рнс. 19. Типы образования эндоспор у бак-
терий:
1 — бациллярный; 2 — клостридиальный;
3 — плектридиальный
Рис. 2,0 Акинеты (А) и
гетероцисты (Г) нитчатой
цианобактерии Cylindro-
spermum
12
1.2. ЭУКАРИОТЫ
В отличие от прокариот, к эукариотам относятся как микро, так
и макроорганизмы. Эукариотные микроорганизмы представлены
грибами, рядом групп водорослей и простейшими.
1.2.1. Грибы
Грибы — обширная группа гетеротрофных микроорганизмов,
широко распространенных в природе. Большинство из них являются
сапрофитами, однако есть и па-
разитические виды. Грибы под-
разделяют на два отдела: Еи-
mycota и Oomycota. Характер-
ной особенностью большинства
грибов является образование ми-
целия. Мицелиальные грибы,
предмет изучения микробиоло-
гов, объединяют представителей
в основном трех классов: Zygo-
mycetes, Ascomycetes и Deutero-
mycetes (все из отдела Eumyco-
ta)._______________________________
Рис. 21. Спорангии и спорангие-
носцы некоторых знгомицетов
Absidia (a), Rhizopus (б), Мисог
(в), Actinomucor (г); 1 ,— плодо-
носящий мицелий; 2 — спорангие-
носцы; 3 — спорангий со спорами
Рис 22. Способы вегетативного размножения дрожжей:
1 — почкование; 2 — деление; 3 >— почкующееся деление
Рис. 23. Баллистоспоры иа отдельных клетках и гифах мицелия:
1 •— Sporobolamyces; 2 — Sporidiobolus
13
Аск с гаплоидными
аскоспорами
оО
Мелкие гаплоидные
нлетки
Гаплоидные
клетки
. Аскоспоры,
\ освободившиеся
' сумки
Вегетативные
cP л почкующиеся
О клетки
*т2) Копуляция
Диплоидная
(раза
Рнс. 24. Мицелиальные формы
дрожжей:
I — псевдомицелий, 2 — ис-
тинный мицелий; а — артро-
споры, б — эндоспоры
Зигомицеты, имеют не
разделенный на отдель-
ные клетки многоядер-
ный мицелий (ценоцит-
ный). Они характеризу-
ются особым типом по-
лового размножения, ко-
торое включает стадию
образования зигоспоры
из двух родительских
гиф (рис. 21). К числу
зигомицетов относятся
мукоровые грибы Rhizo-
pus, Phycomyces, Absidia
и ряд других.
Аскомицеты (сумча-
тые грибы) образуют ги-
фы, которые, в отличие
от зигомицетов, разделе-
ны поперечными перего-
родками. Особенностью
этих грибов является ха-
рактерный орган споро-
ношения — аск, в кото-
ром формируются аскос-
поры. Значительная часть
аскомицетов способна
ВегетатиВ- п О
ныв делящиеся и п
метки й “
$
Аскоспоры,
освободившиеся
из сумки
(*%£)Аск с гаплоидны-
'-'ми аскоспорами
г
Рис. 25. Жизненные циклы
некоторых дрожжей:
1 — Saccharomyces cerevisiae-,
2 — Schizosaccharomyces (Ос-
tosporomyces) ociosporus
Рис. 26. Копуляция между
аскоспорами одной сумкн
(1) и разных сумок (2)
Рис. 27. Хламидоспоры дрожжей:
1 I— на гифах мицелия; 2 — без ми-
целия. В хламидоспорах видны капли
жира
14
Рис. 28. Конидиеиосцы н конидии несовершенных грибов:
1 — Trichoderma; 2 — Cladosporium; 3 — Altenaria; 4 — Fusarium-
5 — Stachybotris; 6 — Stemphylium-, 7 — Verticillium; 8 — О osрога;
9 — Cephalosporium; 10 — Botrytis; 11 —Phoma (пикннда с конидия-
ми); 12 — Mycogone-, a — конидин
a S
/Рис. 29. Конидиеносцы у грибов рода
Aspergillus (а) н Penicillium (б); 1 —
«вегетативный мицелий; 2 — конидиофор;
3 — стеригмы; 4 — конидии
размножаться неполовым пу-
тем с помощью конидий
(рис. 22—23, 24). К аскомице-
там относятся многие дрожжи,
которые существуют в виде от-
дельных неподвижных клеток
и размножаются почкованием
или, реже, делением. Аскоми-
цетные дрожжи могут размно-
жаться и половым путем,
образуя аски с 2—8 спорами
(рис. 25—26). На определен-
ных стадиях развития некото-
рые дрожжи образуют мице-
лий или псевдомицелий, на
концах которого можно обна-
ружить споры (рис. 23—24).
Отдельные представители
дрожжей (Lipomyces, Crypto-
coccus) в качестве покоящейся стадии образуют хламидоспоры
(рис. 27). К числу широко используемых в различных микробио-
логических исследованиях дрожжей относятся представители рода
Saccharomyces, например S. cerevisiae.
Дейтеромицеты (несовершенные грибы) — разнообразная
группа микроорганизмов с отсутствующей (или не обнаруженной)
половой стадией (рис. 28). Многие несовершенные грибы могут
осуществлять парасексуальный процесс, при котором слияние и
последующее деление ядер происходят непосредственно в мицелии.
К дейтеромицетам относят представителей родов Penicillum,
Aspergillus (рис. 29), некоторые дрожжи (Candida, Kloeckera,
Rhodotorula). Многие дейтеромицеты патогенны для животных и
человека.
1.2.2. Водоросли
Водоросли включают фототрофные организмы, среди которых
есть макро- и микроформы. Обладая двумя фотосистемами, водо-
росли осуществляют оксигенный фотосинтез. Состав пигментов
обусловливает их цвет, который может быть зеленым, бурым,
красным, золотистым. Все водоросли образуют каротиноиды и
хлорофилл а, а некоторые в дополнение к ним, хлорофилл b и/или
с, а также фикобилины. В клетках водорослей могут накапливаться
различные запасные вещества — крахмал, парамилон, ламинарии.
Классификация водорослей основана на их морфологии, под-
вижности, наборе пигментов, природе запасных веществ, составе
клеточной стенки. Они подразделены на ряд групп, из которых
объектами (микробиологов в основном служат представители сле-
дующих отделов.
16
Зеленые водоросли — обитатели пресных и морских вод, почв и
стволов деревьев, — представлены одноклеточными и многокле-
точными формами, которые размножаются как бесполым, так и
половым путем.
Диатомовые водоросли, составляющие основную массу фито-
планктона (более 10 тыс. видов), — одноклеточные микроорганиз-
мы, многие из которых заключены в кремниевые панцири различной
величины и формы. Панцирь, состоящий из двух створок, напоми-
нает чашку Петри, он раскрывается в процессе бесполого размно-
жения, расходится после деления на две части, каждая из которых
достраивает себе недостающие половинки. Диатомеи размножаются
и половым путем. Многие представители этой группы обладают
билатеральной симметрией и осуществляют скользящее движение
за счет выделения слизи из специальных отверстий в створках.
Динофлагелляты — одноклеточные микроорганизмы с 2 боко-
выми жгутиками. Наряду с диатомеями они составляют существен-
ную часть фитопланктона. Некоторые динофлагелляты образуют
токсины, летальные для человека, поэтому в период их массового
развития («красное цветение» водоемов) запрещается отлов мор-
ских организмов, в мясе которых концентрируется токсин.
Эвгленовые — небольшая группа пресноводных водорослей,
лишенная клеточной стенки и имеющая сходство с простейшими.
Помимо роста на свету они способны расти в темноте, получая
энергию при окислении органических веществ. Некоторые виды
эвгленовых передвигаются амебовидным движением, в то время как
другие — с помощью жгутиков. Интересной особенностью некото-
рых видов является наличие светочувствительного органа, стигмы,
которая ориентирует клетки на источник света.
1.2.3. Простейшие
Простейшие составляют большую группу одноклеточных гете-
ротрофных микроорганизмов, широко распространенных в природе.
Они лишены клеточной стенки (хотя некоторые имеют панцирь) и
поглощают питательные вещества абсорбцией через клеточную
мембрану или путем эндоцитоза. Размножение этих микроорганиз-
мов осуществляется половым и бесполым путями, иногда оба спо-
соба воспроизводства составляют стадии единого жизненного цикла,
организма. Простейших, представляющих интерес для микробиоло-
гов, находят в 4 классах: амеб, жгутиконосцев, реснитчатых и спо-
розоа. По некоторым классификационным схемам к простейшим
относят и слизевиков (Myxomycota), которых раньше включали в
число грибов.
Амебы (Rhizopoda) обитают преимущественно в воде. Они под-
вижны благодаря псевдоподиям, которые также способствуют за-
хвату пищи с последующим фагоцитозом. Жизненный цикл амеб
относительно прост. Одной из его характерных стадий является
фаза инцистирования, образования покоящихся цист из активно
питающихся клеток, трофозоитов. Как правило, амебы — свобод-
17
ноживущие организмы, однако некоторые виды являются парази-
тами и вызывают различные заболевания человека, например
кариес зубов и амебную дизентерию.
Жгутиконосцы (Mastigophora) — организмы, включающие и
паразитирующие, и свободноживущие формы. Некоторые их пред-
ставители вызывают тяжелые болезни человека и животных.
Реснитчатые (Ciliata) — в основном свободно.живующие виды,
играющие активную роль в разложении органических загрязнений
при очистке воды. Некоторые реснитчатые образуют симбиозы и
растут в рубце жвачных животных.
Спорозоа (Sporozoa) — класс простейших, образующих споры
на определенных стадиях развития. Эти паразитирующие формы
простейших имеют сложный жизненный цикл, который включает в
себя половую и бесполую стадии размножения. Среди спорозоа
много возбудителей заболеваний человека и животных.
1.3. ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РОСТ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Среди физических факторов, определяющих рост микроорга-
низмов, следует прежде всего выделить температуру. Оптимальная
температура для мезофильных форм составляет 25—40°. Среди
обитателей глубин океанов, почв и болот тундры находят психро-
филов, которые растут при более низкой температуре (оптимумы
роста при 5—15°). Известны экстремальные термофилы, способ-
ные расти при 70—110°. Споры отдельных микроорганизмов могут
выдерживать кратковременное нагревание до 160—180° и дли-
тельное охлаждение до —196° и ниже.
Некоторые виды микроорганизмов хорошо переносят гидроста-
тическое давление до 1000 ати. Выделены облигатные барофилы,
которые не способны расти при давлении ниже 500 ати. Но есть
виды, не выдерживающие даже незначительного превышения дав-
ления над атмосферным.
Отдельные представители микроорганизмов чрезвычайно ус-
тойчивы к ионизирующей радиации и способны расти даже в воде
охлаждающих контуров атомных реакторов (Deitiococcus radiodu-
rans, некоторые дрожжи).
Важным фактором, от которого зависит рост микроорганизмов,
является осмотическое давление. В то время как большинство
организмов не размножаются при концентрации соли (NaCl) в
среде более 0,5 М, экстремальные галофилы нуждаются в содержа-
нии в среде от 2,5 М и выше до насыщенного раствора NaCl.
Микроорганизмы чувствительны к кислотности окружающей
среды. Экстремальные ацидофилы могут расти от pH 0,5—1,0, а
алкалофилы — при pH до 10,0—11,0. Однако большинство, микро-
организмов растут в средах с pH близким 7,0.
По отношению к молекулярному кислороду микроорганизмы
делятся на облигатных аэробов и анаэробов (факультативных,
аэротолерантных и строгих). Подавляющая часть известных мик-
18
роорганизмов являются аэробами, способными расти лишь в при-
сутствии молекулярного кислорода, но некоторых угнетает его
обычная концентрация в воздухе, и они могут расти лишь при не-
значительном его содержании в газовой фазе (до 1,0—5,0%).
Последних называют микроаэрофилами. Факультативные анаэробы
могут расти как в присутствии (молекулярного кислорода, так и в
его отсутствие, изменяя свой метаболизм, например с дыхания на
брожение (некоторые дрожжи). Рост аэротолерантных анаэробов
не угнетается из-за небольшого содержания молекулярного кисло-
рода, однако эти микроорганизмы кислород не используют (нап-
ример, молочнокислые бактерии). Строгие же анаэробы не выдер-
живают даже следов молекулярного кислорода в среде, где они
растут, он является для них ядом (метаногены, ацетогены, боль-
шинство сульфатредукторов, некоторые грибы, а также отдельные
виды простейших).
1.4. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ
Энергетические и конструктивные процессы, осуществляемые
микроорганизмами, отличаются большим разнообразием (табл. 2).
В зависимости от соединений углерода, которые используются
в конструктивном обмене, микроорганизмы подразделены на авто-
трофов, осуществляющих синтез углеродсодержащих клеточных
компонентов из СО2, и гетеротрофов, которые нуждаются для этих
целей в готовых органических веществах. Среди гетеротрофов ос-
новная часть микроорганизмов представлена сапрофитами (сапро-
трофами), которые используют органические соединения, образуе-
мые в процессе жизнедеятельности или распада других организ-
мов. Гетеротрофные микроорганизмы включают виды, способные
расти при наличии простых органических веществ в среде, и обли-
гатных паразитов (паратрофов), которые полностью зависят от
Таблица 2
Типы энергетического и конструктивного обмена микроорганизмов
Источник энергии Доноры электронов Источники углерода
органические углекислота
Свет органические фотооргано- гетеротрофия фотооргано- автотрофия
Свет неорганические фотолито- гетеротрофия фотолито- автотрофия
Органический органические хемооргано- гетеротрофия хемооргано- автотрофия
Неорганический неорганические хемолито- гетеротрофия хемолнто- автотрофия
19
метаболизма хозяина, используя синтезируемые им различные
сложные органические вещества.
Широкие возможности микроорганизмы проявляют при утили-
зации соединений азота. Большинство про- и эукариот использует
восстановленные соединения азота (чаще всего соли аммония),
некоторые нуждаются в готовых аминокислотах, а другие усваива-
ют и окисленные его формы (прежде всего нитраты). Значитель-
ное число прокариот, свободноживущих и симбиотических, обла-
дают способностью фиксировать молекулярный азот. Это свой-
ство отмечено только для прокариот и обнаружено у аэробов и
анаэробов.
Фосфор, входящий в состав нуклеиновых кислот и других сое-
динений клетки, извлекается микроорганизмами преимущественно
из фосфатов. Источником серы, которая необходима для биосин-
теза аминокислот и некоторых кофакторов, чаще всего является
сульфат. Лишь некоторые виды микроорганизмов, не способные к
ассимиляционной сульфатредукции, нуждаются в восстановлен-
ных соединениях серы.
Энергетические процессы, осуществляемые микроорганизмами,
включают фотосинтез, брожения, аэробное и анаэробные дыха-
ния. Все они приводят в конечном итоге к запасанию энергии
главным образом в АТФ, которая расходуется на различные энер-
гопотребляющие процессы.
Синтез АТФ у микроорганизмов может происходить различны-
ми путями. При окислительном и фотосинтетическом фосфорили-
ровании, которые связаны с мембранами и поэтому объединены
под общим названием мембранного фосфорилирования, преобра-
зование энергии происходит вначале в форме трансмембранного
электрохимического потенциала ионов водорода или Na+, в то
время как субстратное фосфорилирование приводит к запасанию
энергии непосредственно в макроэргических связях АТФ и других
химических соединений.
1.5. МИКРООРГАНИЗМЫ В ПРИРОДЕ И БИОТЕХНОЛОГИИ
Сообщество микроорганизмов в естественных местах обитания
является важнейшим фактором, определяющим целостность эко-
логических систем в природе. В особых условиях микроорганиз-
мы могут представлять единственную форму жизни. В процессе
эволюции выработались различные типы взаимоотношения меж-
ду микроорганизмами. Тесная связь между ними (симбиоз) стро-
ится на различных характерах зависимости партнеров: взаимовы-
года (мутуализм), неблагоприятное влияние на одного из парт-
неров (паразитизм), реже — индифферентные отношения друг с
другом (нейтрализм).
Изучение микробного мира расширяет рамки наших представ-
лений о границах живой природы и свидетельствует об активном
участии микроорганизмов в кругообороте веществ на Земле. Ис-
пользуя и образуя метан, поглощая СО и СОг, трансформируя
20
всевозможные органические соединения в разных, в том числе экс-
тремальных, условиях, микроорганизмы активно участвуют в цик-
ле превращения углерода. Фиксируя молекулярный азот, окисляя
аммиак и нитриты, осуществляя денитрификацию, микроорганиз-
мы обеспечивают азотный круговорот в природе, а способность
окислять восстановленные серосодержащие соединения и восста-
навливать окисленные определяет их роль в круговороте серы.
Влияние микроорганизмов не всегда позитивно: некоторые из
них вызывают тяжелые заболевания у человека, животных и рас-
тений. Нередки случаи, когда микроорганизмы приводят к порче
сельскохозяйственной продукции, разрушению подземных частей
зданий, трубопроводов и металлических конструкций шахт. Изу-
чение свойств таких микроорганизмов позволяет разработать эф-
фективные способы защиты от вызываемых ими повреждений. С
другой стороны, положительное значение микроорганизмов для
практики невозможно переоценить. С помощью грибов и бактерий
готовят хлеб, вино, пиво, квас, молочнокислые продукты, заквас-
ки. При участии микробов получают ацетон и бутанол, уксус, ли-
монную кислоту, некоторые витамины, ряд ферментов, антибиоти-
ки и каротиноиды. Микробы участвуют в трансформации стероид-
ных гормонов и других соединений. Их используют для получе-
ния белка и ряда аминокислот. Реализуется идея использования
микробных ферментов в диагностических целях. Применение мик-
робных комплексов для превращения сельскохозяйственных от-
ходов в биогаз (смесь метана и углекислоты) или этанол откры-
вает возможность создания принципиально новых систем воспол-
нения энергетических ресурсов. В последние годы микроорганиз-
мы, особенно прокариоты, широко применяют в качестве объектов
генной инженерии для клонирования генов и создания векторов.
Потенциал микроорганизмов в практическом отношении неис-
черпаем. Углубление знаний о жизнедеятельности этих микроско-
пических, но макрозначимых существ открывает новые направле-
ния их эффективного использования в биотехнологии.
ГЛАВА 2
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ И
ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕИ
Микробиологи имеют дело с популяциями (культурами) мик-
роорганизмов, состоящими из миллионов особей. Культуру, со-
держащую микроорганизмы одного вида, называют чистой. Если
в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она
носит название смешанной. В микробиологической практике ис-
пользуют главным образом чистые культуры микроорганизмов.
Ввиду того что в воздухе и на поверхности предметов (на столах,
инструментах, одежде), а также на руках, волосах и т. д. всегда
имеется большое количество разнообразных микроорганизмов, сле-
дует постоянно заботиться о сохранении чистоты изучаемых куль-
тур. Требование чистоты культур в значительной степени опреде-
ляет специфику устройства микробиологической лаборатории и
правила работы микробиолога.
Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений,
где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней.
Под лабораторные комнаты отводят наиболее светлые, просторные
помещения, естественное освещение которых должно составлять
не менее НО лк. Поверхность столов и пол всех лабораторных
помещений покрывают легко моющимся материалом — пласти-
ком или линолеумом, а стены на высоту 170 см от пола окраши-
вают в светлые тона масляной краской. Основное рабочее поме-
щение оборудовано столами лабораторного типа, шкафами и пол-
ками для хранения аппаратуры, посуды и реактивов. Столы име-
ют подводку электроэнергии и снабжены газовыми горелками.
Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет сте-
рилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы,
бокс, моечную, холодильную комнату, термостаты или термоста-
тированные комнаты для выращивания микроорганизмов, поме-
щение для хранения культур и т. д. Бокс служит для пересевов
микроорганизмов и представляет собой небольшую изолирован-
ную комнату, разделенную перегородкой на две части. Входят в
рабочее помещение бокса через тамбур с раздвижной дверью, что
исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесе-
ние извне посторонних микроорганизмов. Оборудование бокса сос-
тоит из стола, стула, газовой горелки и бактерицидной лампы, ук-
репленной в специальном штативе или смонтированной на потол-
ке бокса. Удобно иметь в боксе подсобный стол, на котором раз-
мещают необходимые во время работы предметы.
22
Широко используют настольные боксы разных конструкций —
от камер с полностью открытой передней панелью до герметичес-
ки закрытых камер, работа в которых осуществляется под отри-
цательным воздушным давлением с помощью прикрепленных к
передней панели резиновых перчаток. В некоторых боксах («лами-
нарах») чистота атмосферы рабочего пространства обеспечивает-
ся циркуляцией стерильного воздушного потока внутри камеры.
2.1. ПОДГОТОВКА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
К РАБОТЕ
Микробиологическую лабораторию необходимо содержать в
чистоте. В ней не должно находиться никаких лишних предметов.
Следует регулярно проводить гигиеническую уборку лаборатор-
ных помещений. Обеспечить полную стерильность лаборатории
очень трудно и это не всегда необходимо, но значительно снизить
количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверх-
ностях в лабораторных помещениях возможно. Для этого приме-
няют различные способы дезинфекции. Слово «дезинфекция» оз-
начает обеззараживание, т. е. уничтожение возбудителей инфек-
ционных болезней на объектах внешней среды. Однако при дезин-
фекционной обработке погибают не только патогенные, но и сап-
рофитные бактерии. Иногда процесс дезинфекции оказывает сте-
рилизующее действие.
Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории
обрабатывают пылесосом и протирают растворами различных де-
зинфицирующих веществ. Обработка пылесосом обеспечивает осво-
бождение предметов от пыли и удаление с них значительного ко-
личества микроорганизмов. Установлено, что при 4-кратном про-
ведении щеткой пылесоса по поверхности предмета с него удаля-
ется примерно 47% микроорганизмов, а при 12-кратном— до97%.
В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего пользуются
2—3%-ным раствором соды (бикарбоната натрия), 3—5%-ным
раствором фенола (карболовой кислоты) или лизола (препарат
фенола с добавлением зеленого мыла), 0,5—3%-ным водным раст-
вором хлорамина и некоторыми другими дезинфектантами.
Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать
проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через
форточку (не менее 30—-60 мин) приводит к резкому снижению
количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной
разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом по-
мещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый спо-
соб дезинфекции воздуха — облучение ультрафиолетовыми луча-
ми с длиной волны от 200 до 400 нм. Эти лучи обладают высокой
антимикробной активностью и могут вызвать гибель не только
вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов.
Воздействие ультрафиолетовых лучей должно быть непосред-
ственным и длительным. Это связано прежде всего с тем, что уль-
трафиолетовые лучи обладают слабой проникающей способ-
23
ностью. Они не проходят, например, через обычное стекло, легко
поглощаются частицами пыли. Кроме того, некоторые предметы,
такие как белая бумага, пластины из полированного алюминия или
хрома, могут заметно отражать ультрафиолетовые лучи. Поэтому
в зависимости от степени загрязненности воздуха для его стери-
лизации требуется облучение от 30 мин до нескольких часов.
В качестве источника ультрафиолетового излучения использу-
ются бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электри-
ческая дуга, возникающая в парах ртути низдого давления. Бо-
лее 80% испускаемого ими спектра приходится на волны длиной
254 нм. Обычно бактерицидные лампы представляют собой трубки
различного диаметра и длины, изготовленные из специального
стекла, пропускающего излучение с длиной волны 254 нм. Каждая
трубка вмонтирована в корпус-держатель и может быть снабже-
на отражателем. Необходимо иметь в виду, что ультрафиолетовые
лучи могут вызвать тяжелые поражения глаз. Поэтому при ра-
боте с бактерицидными лампами нужно строго следить за тем,
чтобы ни прямые, ни отраженные ультрафиолетовые лучи не попа-
дали в глаза. В небольших помещениях при включенной бактери-
цидной лампе находиться нельзя. Следует также учитывать, что
при длительной непрерывной работе бактерицидной лампы интен-
сивность излучения снижается. В этих случаях облучение целесо-
образно вести с перерывами.
Рабочее место, где непосредственно проводится работа с
культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обра-
ботки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до на-
чала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхнос-
ти стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а
также 70%-ные (по объему) растворы изопропилового или эти-
лового спиртов. Спирты весьма эффективны в отношении вегета-
тивных форм микроорганизмов. Названные спирты можно также
применять для дезинфекции рук. В тех случаях, когда поверхность
стола имеет водооталкивающее покрытие, особенно удобен лизол.
Поверхность рабочего стола можно дезинфицировать и ультра-
фиолетовыми лучами. При этом следует учитывать, что бактери-
цидное действие лучей тем выше, чем ближе облучаемая поверх-
ность к источнику излучения.
В лаборатории не разрешается курить, хранить и употреблять
еду, напитки, жевательную резинку. Работать следует в халатах.
2.2. ПРАВИЛА РАБОТЫ С КУЛЬТУРАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ
В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных в в
жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, кол-
бы, матрацы и чашки Петри (рис. 30). Посуду и питательные
среды предварительно стерилизуют. Способы приготовления пита-
тельных сред и стерилизации подробно описаны ниже (см. главы
3—4).
24
Рис. 30. Посуда для культивирования микроорганизмов
1 — качалочная колба; 2 — качалочиая колба с отбойниками; 3 — ко-
ническая колба; 4 — чашка Петри, 5 — пробирка, 6 — матрац
Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется
посевом, или инокуляцией. Посев микроорганизмов требует соб-
людения определенных правил, которые необходимо выполнять,
чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посто-
ронними микроорганизмами. Перед посевом следует тщательно
надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название мик-
роорганизма и дату посева. Надпись делают чернилами по стеклу
или на наклеенной этикетке.
Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препа-
ратов берут бактериологической петлей или иглой (рис. 31), если
микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, ког-
да нужно приготовить препарат или пересеять культуры микроор-
ганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, лучше пользо-
ваться не петлей, а стерильной пипеткой. Бактериологические пет-
ли и иглы делают, используя тонкую проволоку из вольфрама или
нихрома, которую закрепляют в металлическом или стеклянном
держателе. Диаметр бактериологической петли — 4—5 мм.
Бактериологическую петлю (иглу) перед взятием клеток микро-
организмов стерилизуют. Для этого проволоку накаливают до-
красна в пламени горелки и одновременно обжигают примыкаю-
щую к петле часть держателя, которую будут вводить внутрь со-
суда, содержащего микроорганизмы. Петлю рекомендуется дер-
жать в пламени горелки почти вертикально, чтобы проволока бы-
25
Рис 31 Бактерио-
логическая петля
(/) и бактериоло-
гическая игла (2)
ла равномерно раскалена на всем протяже-
нии. При прокаливании необходимо помнить,
что наивысшая температура развивается в
верхней и периферической частях пламени
(рис. 32), поэтому не следует опускать петлю
непосредственно к горелке. Сразу же после
стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с
микроорганизмами. Чтобы не повредить клет-
ки микроорганизмов, петлю (иглу) вначале
охлаждают, прикасаясь ею к внутренней по-
верхности сосуда или к питательной среде,
свободной от клеток микроорганизмов, и толь-
ко после этого захватывают небольшое коли-
чество микробной массы.
Отбор клеток микроорганизмов, выращен-
ных на плотной среде в пробирке, осущест-
вляют следующим образом. Пробирку с куль-
турой берут в левую руку так, чтобы поверх-
ность питательной среды с налетом микроор-
ганизмов была обращена кверху и хорошо вид-
на. Пробирку держат в горизонтальном или
несколько наклонном положении. В правую
руку берут петлю так, как держат карандаш,
и прокаливают в пламени горелки Затем,
не выпуская петли, мизинцем и безымянным
пальцем правой руки прижимают ватную
пробку к ладони, вынимают ее из пробирки и
держат так во время последующих манипу-
ляций. Края открытой пробирки с культурой
микроорганизмов обжигают в пламени горел-
ки и после этого вводят в побирку стериль-
ную петлю Взяв небольшое количество мик-
робной массы с поверхности субстрата, вы-
нимают петлю из пробирки, следя за тем,
чтобы переносимый материал не касался сте-
нок или краев пробирки. Горлышко пробир-
ки снова обжигают в пламени горелки, затем
обжигают ватную пробку и закрывают ею прсбирку. Если конец
ватной пробки загорится, то не следует бросать пробку. Ее
нужно быстро ввести в пробирку, где вата сама потухнет. Ни в
коем случае нельзя дуть на загоревшуюся пробку, так как это
только усилит горение. Если в момент пересева ватная пробка
упадет на стол или на пол, то не следует снова вставлять еев про-
бирку. Нужно взять новую стерильную пробку и начать всю опе-
рацию заново. Закрытую ватной пробкой пробирку с культурой
ставят в штатив, а извлеченный материал используют для приго-
товления препарата или для пересева культуры в свежую среду.
26
1570
1540
-520
1550
1560
1540
-350
-300
Рис 32 Значение темпера-
туры (в градусах Цельсия)
в разных участках пламени
газовой горелки
влажной мик-
Если культуру пересевают на ско-
шенную агаризованную среду, то
петлю вводят в пробирку до конца и,
слепка касаясь ею поверхности агара,
проводят снизу вверх либо зигзагооб-
разную, либо прямую черту-штрих.
При этом стараются не повредить по-
верхность плотной среды. В случае
пересева в жидкую среду (в колбы или
пробирки) петлю с микробной массой
погружают непосредственно в среду
Оставшиеся на петле после пересева
или приготовления препарата клетки
микроорганизмов тщательно сжигают
в пламени горелки. Прокаливание
петли в этом случае начинают с уча-
стка проволоки, примыкающего к
кольцу, для того, чтобы микробная
масса, оставшаяся на петле, подсохла
Затем петлю переводят в вертикаль-
ное положение и прокаливают докрас-
на. Такой порядок стерилизации пет-
ли необходим потому, что при быстром
робной массы происходит ее разбрызгивание и образуется аэро-
золь, загрязняющий воздух. Только после прокаливания петлю
можно положить на место.
Из жидкой среды клетки берут следующим образом: пипетку
за верхний конец вынимают из бумаги или пенала, в которых ее
стерилизовали, и вводят в пробирку или колбу с культурой, соб-
людая все правила предосторожности, описанные выше. Отбирать
жидкую культуру пипеткой можно с помощью резиновой груши.
Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезин-
фицирующий раствор, например 3—5%-ный водный раствор фено-
ла или 2%-ный раствор хлорамина, не касаясь ею окружающих
предметов.
Когда необходимо провести рассев микроорганизмов из жидкой
питательной среды на поверхность плотной среды в чашке Петри,
поступают следующим образом. Расплавленную на кипящей водя-
ной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или
желатину, разливают в стерильные чашки Петри. Для этого со-
суд со средой берут в правую руку, вынимают из него пробку, за-
жимая ее мизинцем и безымянным пальцем левой руки, обжига-
ют горло сосуда в пламени горелки и, приоткрыв большим и сред-
ним пальцами левой руки крышку чашки Петри, быстро налива-
ют в чашку расплавленную среду в таком количестве (20—30 мл),
чтобы дно чашки было полностью покрыто. Крышку тотчас зак-
рывают и чашку оставляют на горизонтальной поверхности до тех
пор, пока не застынет среда. Для посева приоткрывают крышку
чашки Петри и на поверхность плотной среды наносят каплю или
27
«петлю» жидкой культуры, которую осторожно распределяют стек-
лянным стерильным шпателем (шпатель Дригальского) либо пет-
лей.
Все описанные манипуляции следует проводить около пламе-
ни горелки (но не в пламени), по возможности быстро, чтобы не
загрязнить культуру посторонними микроорганизмами. Не реко-
мендуется делать резкие движения и ходить около лица, рабо-
тающего с чистой культурой, так как движение воздуха увеличи-
вает вероятность случайного ее загрязнения. После пересева про-
бирку или другие сосуды, в которых выращивают микроорганизмы,
помещают в термостаты, где с помощью терморегуляторов под-
держивается постоянная температура (см. гл. 4). Посуду с куль-
турами микроорганизмов, подлежащими выбрасыванию, следует
автоклавировать, чтобы убить клетки, и только после этого мыть.
Культуры на плотных питательных средах можно заливать на
сутки дезинфицирующим раствором, после чего их выбрасывают и
посуду моют. Неаккуратное обращение с культурами микроорга-
низмов приводит к возникновению бактериального аэрозоля.
ВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЗАПИСЕЙ
Журнал лабораторных работ является документом, позволяю-
щим контролировать правильность полученных результатов. В нем
должны быть записаны сведения, имеющие отношение к выпол-
нению данной работы. Запись необходимо вести аккуратно, четко
и в определенном порядке, например:
1. Название опыта и его цель, дата его постановки и окончания.
2. Объект исследования.
3. Условия проведения опыта.
4. Основной принцип используемого метода анализа.
5. Полученные результаты.
Цифровой материал приводят в таблицах. Если необходимо,де-
лают графики, диаграммы, рисунки. Каждая лабораторная рабо-
та должна заканчиваться собственными наблюдениями и вывода-
ми, записанными в журнале.
ГЛАВА 3
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ
Стерилизация является одним из важнейших и необходимых
приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в
переводе с латинского означает обеспложивание. В практической
работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для
уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри
стерилизуемых объектов. Микробиологи стерилизуют питательные
среды, посуду, различные инструменты и другие необходимые
предметы с целью не допустить развития посторонних микроорга-
низмов в исследуемых культурах. Термин «стерильность» имеет
абсолютное значение. Можно говорить только либо о стерильнос-
ти, либо о нестерильное™, но не может быть состояния «частич-
ной» или «неполной стерильности», «близкого к стерильному»,
«почти стерильного».
Различают термическую и холодную стерилизацию. В микро-
биологии находят применение следующие способы термической сте-
рилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая
стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным па-
ром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация
(тиндализация), кипячение. Из методов холодной стерилизации
микробиологи используют стерилизацию фильтрованием, газооб-
разными средствами, ультрафиолетовыми лучами и другими вида-
ми излучений.
Возможность и целесообразность применения того или иного
способа определяются в первую очередь физико-химическими свой-
ствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью
исследования.
3.1. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
3.1.1. Стерилизация насыщенным паром под давлением
(автоклавирование)
Это наиболее надежный и чаще всего применяемый способ сте-
рилизации питательных сред. Он основан на нагревании материа-
ла насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного.
Известно, что температура пара возрастает при повышении его
давления (табл. 3).
Совместное действие высокой температуры и пара обеспечи-
вает особую эффективность данного способа. При этом погибают
29
и вегетативные клетки, и спо-
ры микроорганизмов. Установ-
лено, что споры большинства
Таблица 3
Температура насыщенного пара
при разных давлениях
Давление Темпера- тура, °C
атм ати(из- быточное) кПА
1,0 0,0 101,32 100
1,5 0,5 151,98 111
2,0 1,0 202,65 121
2,5 1,5 251,20 128
3,0 2,0 299,75 134
микроорганизмов не выдержи-
вают и 5-минутную экспози-
цию в насыщенном паре при
121°. Лишь споры некоторых
почвенных микробов погибают
при 1 атм только через 30 мин.
Стерилизацию паром под дав-
лением осуществляют в специ-
альных герметически закры-
вающихся толстостенных ап-
паратах — автоклавах.
Рис. 33. Схема /автоклава:
1 — стерилизационная ка-
мера; 2 — кран для выхода
воздуха; 3 — манометр; 4 —
предохранительный клапан;
5 — водопаровая камера;
6 — воронка для заполне-
ния автоклава водой; 7 —
водомерная трубка; 8 — от-
верстия для поступления па-
ра в стерилизационную ка-
меру; 9 — защитный кожух;
10 — крышка автоклава;
11—подставка для разме-
щения стерилизуемых пред-
метов
Устройство автоклавов. Автоклавы
разнообразны по форме, размерам, ра-
бочему давлению, конструкции и дру-
гим показателям; они могут быть с руч-
ным уцравлением, полуавтоматические и
автоматические. Но поскольку все авто-
клавы предназначены для выполнения
одной и той же задачи — стерилизации,
основной принцип их устройства один и
тот же. Разберем его на примере верти-
кального автоклава с ручным управле-
нием (рис. 33).
Автоклав представляет собой метал-
лический двухстениый резервуар, спо-
собный выдерживать высокое давление.
Его внутренняя часть является стерили-
зационной камерой (1). В нее поме-
щают стерилизуемый материал. Стери-
лизационная камера снабжена краном
(2) для выхода воздуха, манометром
(3) для определения давления пара и
предохранительным клапаном (4) для
выхода пара при повышении давления
сверх необходимого и для предотвраще-
ния разрыва автоклава. Пространство
между стенками (5), называемое водо-
паровой камерой, заполняется через во-
ронку (6) водой (лучше дистиллирован-
ной, чтобы не образовывалась накипь)
до определенного уровня, который отме-
чен на специальной водомерной трубке автоклава (7). Выше это-
го уровня воду наливать не следует, так как при бурном кипении
вода может попасть в трубку, ведущую к манометру, и исказить
его показания. В верхней части внутренней стенки водопаровой
30
камеры имеются отверстия (8), через которые пар поступает в
стерилизационную камеру. Паровой котел сверху покрыт защит-
ным кожухом (9). Он предохраняет котел от механических по-
вреждений, а работающих около автоклава — от ожогов. Для
создания герметичности автоклав плотно закрывается массивной
крышкой (10) с резиновой прокладкой. Стерилизуемые предметы
помещают на специальную подставку (11).
Автоклавирование. Отдельные операции процесса стерилиза-
ции в автоклавах разных типов могут быть несколько различны-
ми. Соответственно немного различается и техника работы с ними.
Однако общий принцип проведения стерилизации в разных авто-
клавах один и тот же.
Перед работой осматривают автоклав и контрольно-измери-
тельную аппаратуру. При наличии любой неисправности (смеще-
ние стрелки манометра с нуля, трещина на водомерной трубке и
др.) работать с автоклавом нельзя. После осмотра автоклава в
водопаровую камеру наливают воду до верхней отметки на водо-
мерной трубке. В некоторых автоклавах предельный уровень за-
полнения водой контролируется воронкой. В стерилизационную
камеру на специальную подставку помещают стерилизуемый ма-
териал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как
пар должен свободно проходить между ними, иначе они не нагре-
ваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными.
Загрузив стерилизационную камеру, устанавливают и плотно за-
винчивают крышку (дверь) автоклава. Затем открывают кран,
соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и
включают нагрев.
После начала парообразования удаляют воздух из стерилиза-
ционной камеры. Это необходимое условие стерилизации, так как
при одном и том же давлении температура чистого пара выше
температуры смеси пара и воздуха. Поэтому если в автоклаве ос-
танется воздух, материал может не простерилизоваться. Наиболее
простой и очень распространенный способ освобождения автоклава
от воздуха — вытеснение воздуха паром. Пар и конденсат отво-
дят либо в сосуд с водой, либо в специальное устройство, соеди-
ненное с канализацией. В первом случае на кран (2) надевают ре-
зиновый шланг, который опускают в воду. Началом продувания
считают появление устойчивой непрерывной струи чистого пара.
Пока в автоклаве еще имеется воздух, смесь воздуха и пара, про-
ходя через воду, издает сильный треск. Чистый пар выходит с рав-
номерным шипящим звуком. Его пропускают в течение 10 мин. В
целом вся операция с момента появления пара с воздухом долж-
на занимать не более 15—20 мин, иначе в автоклаве останется ма-
ло воды и он может испортиться. Чтобы уменьшить расходы пара
(воды), кран открывают не полностью. Степень открывания кра-
на устанавливают на практике при эксплуатации автоклава. В
наиболее совершенных автоклавах воздух из стерилизационной
камеры удаляют с помощью вакуумного насоса.
61
Когда воздух вытеснен, закрывают пароотводный кран, и дав-
ление пара доводят до показания, соответствующего режиму сте-
рилизации. Режим автоклавирования часто выражают в единицах
избыточного давления, указывая при этом продолжительность его
поддержания. Например: стерилизация при 1 ати в течение 20
мин. На манометре автоклава обозначается именно то дополни-
тельное давление, которое создается в автоклаве сверх нормаль-
ного. Нередко режим автоклавирования характеризуют темпера-
турой и временем. Как только стрелка манометра дойдет до ука-
зателя определенного дополнительного давления и, следователь-
но, температура пара достигнет соответствующего значения, под-
держивают давление на этом уровне необходимое время путем
ручного нли автоматического регулирования подачи пара. В авто-
клавах с огневым обогревом подачу пара регулируют интенсив-
ностью горения, в автоматических автоклавах — электроконтакт-
ным манометром.
По окончании времени стерилизации выключают нагрев авто-
клава. Давление в автоклаве постепенно падает и сравнивается с
атмосферным. Лишь после этого открывают кран, выводящий пар.
Преждевременное открывание крана недопустимо, так как пере-
гретые среды при резком снижении давления сразу же бурно за-
кипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки,
что нарушает впоследствии стерильность материала. Когда пар
выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом
осторожность во избежание ожога паром лица и рук. Удаление
пара из стерилизационной камеры автоклавов, оснащенных ваку-
умным насосом, осуществляют с помощью насоса. Одновременно
происходит подсушивание стерильного материала.
Поскольку автоклав является аппаратом, работающим при вы-
соких давлениях и температурах, неправильное обращение с ним
может быть причиной несчастных случаев. Установка автоклава и
работа с ним производятся при строгом и точном выполнении пра-
вил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К рабо-
те допускаются только подготовленные лица.
При необходимости проконтролировать температуру в автокла-
ве пользуются различными веществами, плавящимися при опре-
деленной температуре. Эти вещества предварительно смешивают с
нейтральными красителями и помещают в автоклав до начала
стерилизации. В качестве индикаторов температуры используют
фенантрен (температура плавления 98—100°), бензаурин (115°),
серу (119°), бензойную кислоту (121—122°), мочевину (132°),
глюкозу (146°), тиомочевину (180°), аскорбиновую кислоту
(187—192°). На 100 г этих веществ берут 0,01 г красителя (фук-
син, метиленовый синий), тщательно смешивают, рассыпают в
стеклянные трубочки с одинаковым диаметром и толщиной стенок,
запаивают и в вертикальном положении раскладывают между
стерилизуемым материалом в автоклаве. По достижении в сосуде
соответствующей температуры эти вещества расплавляются и ок-
рашиваются в Цвет добавленного в них красителя.
32
Подготовка сред к стерилиза-
ции. При автоклавировании
3^5% жидкости теряется в ре-
зультате испарения, поэтому ре-
комендуется в приготавливаемые
среды добавлять сверх объема
примерно 5% дистиллированной
воды. Тогда после стерилизации
среда (раствор) будет иметь
требуемую концентрацию.
Среды обычно стерилизуют в
пробирках, колбах, бутылях. Ем-
кости заполняют средой не бо-
лее чем на половину их высоты,
чтобы предотвратить смачивание
Рис. 34. Ватные пробки:
А — приготовлена правильно; Б и
В — приготовлены неправильно
пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они
предохраняют среду от заражения микроорганизмами, находящи-
мися в окружающем воздухе. Пробки должны быть достаточно
плотными, чтобы выполнить эту функцию, но с равномерным рас-
пределением волокон ваты, так как через них происходит газооб-
мен культуры с окружающей средой. Слишком плотные пробки
затрудняют снабжение культур воздухом.
Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль
волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность,
ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на
столе. Длина пробки для обычной пробирки примерно 4 см. Проб-
ка должна входить в пробирку на 1,5—2,0 см (рис. 34). Для сох-
ранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая.
Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.
Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными
колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут
стерилизоваться в автоклаве, целлофаном, фольгой или другими
материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обя-
зательно проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагре-
ются до нужной температуры и не простерилизуются. При исполь-
зовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их за-
вертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют при-
вязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Пробки в сосуде
меняют стерильно около пламени горелки.
Выбор режима автоклавирования. В микробиологической прак-
тике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в
пределах 111—138°, т. е. 0,5 до 2,5 ати. Температура ниже 111°
не может считаться надежной; температура выше 138°, как пра-
вило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление
пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. При исполь-
зовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными
считаются следующие режимы стерилизации: 15—45 мин при 121 °
(1 ати) и 10—30 мин при 128° (1,5 ати). Микробиологи чаще все-
го стерилизуют среды при 0,5 и 1 ати.
33
Температура и длительность автоклавирования питательные
сред определяются прежде всего их составом, термоустойчивостью
или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся
субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстра-
ты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожже-
вой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 ати в течение
15—30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0
ати 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, по-
тому что стерилизация начинается фактически после того, как агар
расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации
вдвое больше времени, чем тот же объем воды. С трудом подда-
ются стерилизации в автоклаве различные порошки (например,
тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), пос-
кольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются.
Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 ° в течение
2 ч или 1 ч при 170 °. В этом случае слой масла или порошка в
сосуде не должен превышать 1,5 см.
Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающие-
ся особой термостабильностью. К ним относится почва, причем
она, кроме того, и нагревается с замедленной скоростью. Ее обыч-
но стерилизуют при 1 ати, либо один раз 2 ч, либо два дня подряд
по 1 ч, а иногда — при 2 ати 2 ч.
Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать pH среды.
При кислой реакции многие вещества, входящие в ее состав, могут
подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение pH, чем выше темпе-
ратура и продолжительнее время стерилизации, тем интенсивнее
происходит гидролиз. В результате после стерилизации переста-
ют застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если реакция
среды щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли же-
леза, карамелизуются и становятся непригодными для использо-
вания бактериями сахара. В некоторых случаях в процессе стери-
лизации изменяется pH среды. Так, если pH среды с углеводами
выше 7,0, то может произойти ее подкисление до pH 6,0. Особенно
часто это наблюдается в присутствии ксилозы. Чтобы избежать
таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа
автоклавировать отдельно в виде более или менее концентриро-
ванных растворов в дистиллированной воде при том значении pH,
которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации
растворы стерильно объединяют в нужном соотношении. Таким
приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются
довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стери-
лизовать одним и тем же способом.
Режим автоклавирования в значительной степени зависит от
объема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше
времени при одной и той же температуре (давлении) требуется
для обеспечения надежности стерилизации. Имеет значение тол-
щина стенок и форма емкостей (табл. 4). Это нужно учитывать в
практической работе. Например, не следует стерилизовать термо-
чувствительный субстрат одновременно в пробирках и больших
34
бутылях. Если среда стерили-
зуется пю режимам, рекомен-
дованным для малых объе-
мов, содержимое бутыли мо-
Таблица 4
Зависимость продолжительности
стерилизации жидкостей
от объема сосудов
жет не простерилизоваться. Если же стерилизация прово- дится с расчетом на большой объем, среда В пробирке прог- Емкость ревается значительно дольше, чем требуется, и может испор- титься. Объем Время стерили- зации при 121 — 123° МИИ
ММ МЛ
После автоклавирования „ , Пробир- среды для проверки стериль- кин н ности выдерживают 2—3 су- ток в термостате при 30°. Ес- ^олбы ли в средах обнаруживается тонко- рост микроорганизмов, их го- стенные товят заново. 3.1.2. Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация Колбы ТОЛС10- Тиндализация, или дроб- стенные ная стерилизация, была пред- Матрацы ложена в 1877 г. Тиндалем. Бутылки Она применяется для сред, портящихся под действием температур выше 100°. Тин- 18X150 32X200 38X200 50 125 200 500 900 1000 1800 2000 500 1000 2000 1000 9000 100 12—14 13—17 15—20 12—14 12—14 12—15 17—22 19—24 20-25 25—30 30—35 24—28 25—30 40—45 30—35 50—55 13—17
дализацию осуществляют текучим паром в автоклаве с незавин-
ченной крышкой или в кипятильнике Коха. Среды прогревают не-
сколько раз по 10—15 мин. Между прогреваниями среды ставят в
термостат при температуре 30° на 8—12 ч для прорастания жиз-
неспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при
100°, прогревают более осторожно при 60—80° через каждые 8—
12 ч 4—5 дней подряд.
Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 °
известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный
Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых
форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большин-
стве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию про-
водят при 60—80° 10—30 мин. Пастеризацию используют в пище-
вой промышленности для обработки молока, фруктовых соков,
вина, пива и др.
3.1.3. Стерилизация фильтрованием
Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго оп-
ределенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или
35
летучие компоненты — витамины, аминокислоты (цистеин и цис-
тин), белки, ароматические углеводороды, антибиотики и др.
Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые ма-
териалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест,
целлюлозу, фарфор, каолин и т. д.
Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, раз-
мер пор которых не превышает 0,7 мкм. В практике же пригод-
ность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной
фильтрации через них суспензии какого-либо мелкого микроор-
ганизма, например Serratia marcescens. Для проверки на стериль-
ность фильтрат в большом количестве высевают на питательную
среду. Если в течение 5 суток тест-организм не вырастет, филь-
тры могут быть использованы для стерилизации.
Наиболее широкое (распространение в микробиологической
практике получили мембранные фильтры. Это диски разного
размера, диаметра, напоминающие бумажные. Их готовят на ос-
нове нитроцеллюлозы. Мембранные фильтры в зависимости от
величины пор применяются для фильтрования и стерилизации.
Для стерилизации используют отечественные фильтры N 1—4,
фильтры N 5—10 фирмы «СИНИОР» и марок VF, VM, VC,
SLGS, SLHA, DA фирмы «МИЛЛИПОР».
Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой,
называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор
они обозначаются разными индексами: ЕК — поры диаметром
1,5—1,8; EKS — 1,2—1,5; EKS-1 — 1,0—1,2; ЕКП — 0,8—1,0 мкм.
В России выпускают асбестовые фильтры марок Ф2 и СФ. Стери-
лизующими являются СФ-3 и СФ-4.
Асбестовую пластинку помещают в специальный держатель,
который обычно изготавливают из нержавеющей стали, и крепко
зажимают винтами между
верхней (цилиндрической) и
нижней (воронкообразной)
частями держателя. Трубка
нижней части держателя через
резиновую пробку проходит в
колбу Бунзена. Нередко весь
этот прибор в собранном виде
называют фильтром Зейтца.
Для стерилизации исполь-
зуют также стеклянные по-
ристые фильтры, изготовлен-
ные из каолина с приместью
кварцевого песка — «свечи»
Шамберлана и из инфузорной
земли — «свечи» Беркефель-
да. Пористость первых обоз-
начается буквой L с цифрами
от 1 до 13 соответственно
уменьшению диаметра пор
Рис. 35. Приборы для стерилизации
фильтрованием:
А — со стеклянным держателем; Б —
с металлическим держателем
36
фильтра от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые свечи обозначаются так-
же маркой «В», крупнопористые — «F». Фильтры Беркефельда
обозначают буквами V, N, W, что соответствует следующим раз-
мерам пор (мкм): 8—12, 5—7, 3—4.
«Свечи» и специальные держатели с закрепленными в них ас-
бестовыми фильтрами герметически соединяют с колбой Бунзена
для фильтрации в вакууме (рис. 35). Перед употреблением филь-
тры, их держатели и приемник фильтрата должны быть просте-
рилизованы.
Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при
1 ати 15 мин или длительным кипячением. Держатель вместе с
резиновой пробкой заворачивают в бумагу и автоклавируют при
1 ати 20—30 мин. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном
виде. «Свечи» стерилизуют вместе с резиновыми пробками в ав-
токлаве. Колбу Бунзена закрывают ватной пробкой, в отводную
трубку вставляют ватный тампон и стерилизуют горячим возду-
хом.
3.2. СТЕРИЛИЗАЦИЯ СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ
Основным способом стерилизации стеклянной посуды являет-
ся обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не вы-
ше 180° в течение 1—3 ч (табл. 5). При этом погибают и вегета-
тивные клетки, и споры микроорганиз-
мов. Стерилизацию осуществляют в спе-
циальных суховоздушных (сухожаро-
вых) стерилизаторах и сушильных шка-
фах, приспособленных для стерилиза-
ции. Они различаются по форме и спо-
собам обогрева, но имеют сходное уст-
ройство. Их делают из термостойких ма-
териалов — обычно из металла и асбес-
та. Внутри стерилизатора имеются полки
для размещения посуды, а наверху от-
верстие, в котором с помощью пробки
укрепляют термометр. У стенки стерили-
затора (шкафа) или вблизи греющей
поверхности температура всегда значи-
Таблица 5
Время, необходимое для
стерилизации стеклянной
посуды сухим жаром
Темпера- тура, °C Время, мин
140 180
150 150
160 120
170 60
тельно выше, чем внутри, поэтому ртутный шарик термометра
должен находиться внутри шкафа на расстоянии 6—8 см от верх-
ней стенки. В верхней части сушильных шкафов имеется также
отверстие для вентиляции, которое при стерилизации закрывают.
Стерилизаторы и шкафы с электрическим обогревом снабжены
терморегулятором, обеспечивающим автоматическое поддержание
необходимой температуры.
Подготовка посуды к стерилизации. Посуда перед стерилиза-
цией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для
сохранения стерильности после прогревания. Посуду развертыва-
37
ют непосредственно перед употреблением. В верхние концы пи-
петок вставляют ватные тампоны. Торчащие из пипеток волокна
ваты сжигают в пламени горелки. Пипетки заворачивают в длин-
ные полоски бумаги шириной 4—5 см. Обмотку начинают с оття-
нутого конца и постепенным движение^ бумаги по спирали за-
канчивают у конца с ватным тампоном. Завернутые пипетки для
предохранения бумаги от загрязнения и разрывов перед стерили-
зацией упаковывают по нескольку штук вместе или помещают в
специальные металлические или картонные пеналы. Чашки Петри
обычно заворачивают в пакеты по 2—4 штуки, шпатели — обяза-
тельно по отдельности, но затем, как и пипетки, их объединяют
в общий сверток. Колбы, пробирки и трубки Бурри закрывают
ватными пробками. На пробки можно надеть бумажные колпач-
ки, предохраняющие горлышко от пыли.
Стерилизация. Посуду, подготовленную для стерилизации, за-
гружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком
плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный,
надежный прогрев стерилизуемого материала. Стерилизатор
(сушильный шкаф) во время работы должен быть плотно закрыт.
При отсутствии терморегулятора, необходимо строго следить за
температурой, так как при понижении ее не осуществится стери-
лизация, а при нагреве выше 180° бумага и пробки начинают
обугливаться. По окончании стерилизации шкаф не открывают до
тех пор, пока температура в нем не упадет до 80°, так как при
резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а
сильно нагретое стекло может растрескаться. Лучше всего .выгру-
жать посуду только после того, как температура в стерилизаторе
сравняется с комнатной.
Посуду можно стерилизовать и в автоклаве. Режим стерилиза-
ции в этом случае существенно зависит от объема сосудов и тол-
щины стекла (см. табл. 4). Для автоклавирования посуду готовят,
как и для сухожаровой стерилизации. Следует иметь в виду, что
в автоклаве посуда увлажняется.
3.3. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИНСТРУМЕНТОВ И ПРИБОРОВ
Мелкие металлические инструменты: петли, иглы, пинцеты,
ножницы, шпатели стерилизуют прокаливанием в пламени (т. е.
нагреванием докрасна) непосредственно перед использованием.
На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные
стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пес-
тики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки
при пересевах культур и разливе сред. В пламени погибают и ве-
гетативные клетки, и споры микроорганизмов.
Шприцы лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160°
либо в собранном, либо в разобранном виде. В первом случае
38
длительность стерилизации 75 мин, во втором — 60 мин. Собран-
ные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой
ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань.
Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 ати в течение
15—20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе
они повреждаются. Прокаливать шприцы нельзя, так как от это-
го они портятся.
Термостойкие приборы для культивирования микроорганизмов,
а также детали к этим приборам, резиновые пробки и шланги
стерилизуют в автоклаве. При этом емкости закрывают в бумагу.
Режим автоклавирования выбирают в соответствии с термостой-
костью материала, из которого сделан прибор.
Некоторые предметы (металлические инструменты, мелкие
стеклянные детали, мембранные фильтры) иногда стерилизуют
длительным (в течение 30—60 мин) кипячением в дистиллирован-
ной воде. Металлические и стеклянные предметы лучше всего ки-
пятить в специальных закрытых сосудах — стерилизаторах. Мож-
но использовать для этой цели и металлическую посуду. Мем-
бранные фильтры обычно кипятят в колбе или химическом стака-
не, закрытых ватными пробками. Однако этим способом с целью
стерилизации в микробиологической практике пользуются редко
в связи с тем, что длительное кипячение может повредить обраба-
тываемый материал, а сокращение времени кипячения может не
обеспечить стерильность, так как споры некоторых анаэробных
микроорганизмов сохраняют жизнеспособность даже после ки-
пячения в течение нескольких часов. Надежность стерилизации
при кипячении может быть увеличена внесением в воду какого-
либо бактерицидного средства: 2%-ного формальдегида, 0,1%-ной
сулемы или 1%-ной бриллиантовой зелени. Но в этом случае
возможно загрязнение биоцидами стерилизуемых предметов.
3.3.1. Стерилизация газообразными веществами
Аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлек-
тронное оборудование, а также изделия из термолабильных
пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют газо-
вым методом. Для газовой стерилизации применяются только те
соединения, которые обладают спороцидными свойствами. Это ок-
сид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глю-
таральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Особенно эффективна
смесь оксида этилена и бромистого метила в массовом соотноше-
нии 1:1,44 (смесь «ОБ»).
Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически
закрывающихся аппаратах. Стерилизуемые объекты, помещаемые
в камеру, упаковывают, как при стерилизации в автоклаве или
сушильном шкафу. Для упаковки используют материалы, не пор-
39
тящиеся в газовой среде и пропускающие газ и влагу: оберточную
бумагу, муслин, хлорвиниловые и нейлоновые пленки. Перед вве-
дением в камеру биоцида из нее как можно полнее удаляют воз-
дух, чтобы обеспечить тесный контакт активно действующего ве-
щества со стерилизуемым объектом. При стерилизации строга
контролируют концентрацию газа, давление, влажность, темпера-
туру и длительность экспозиции. В большинстве случаев процесс
проводят в сочетании с некоторым повышением температуры
(до 45—70°). Режимы стерилизации разными газами неодинако-
вы. Они определяются прежде всего свойствами биоцида. Имеет
значение и конструкция стерилизационного аппарата. Оптималь-
ный режим стерилизации смесью «ОБ» при 50° в аппарате емко-
стью 100 л и более следующий: концентрация смеси 3,36 г/л (дав-
ление 1,2 ати), относительная влажность 80—100%, продолжи-
тельность 24 ч. По окончании стерилизации удаляют газы из ка-
меры с помощью вакуумного насоса и на некоторое время каме-
ру оставляют под вакуумом для десорбции газов из стерилизо-
ванных предметов. После этого камеру заполняют стерильным
воздухом. Предметами, простерилизованными газами, рекоменду-
ется пользоваться не ранее чем через 24 ч после стерилизации.
Это необходимо для полного удаления из них газа. Целесообраз-
но на этот период поместить их в вытяжной шкаф или оставить в
хорошо проветриваемом помещении. Некоторые изделия из пласт-
масс требуют дополнительной аэрации до 9 суток. При проведе-
нии газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с
ядовитыми газообразными веществами.
3.3.2. Стерилизация облучением
Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых меди-
цинских принадлежностей, пищевых продуктов используют раз-
личные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентге-
новские лучи, a-, [J- и "f-лучи радиоактивных элементов. Чаще
других в микробиологической практике используется ультрафио-
летовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах.
Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроор-
ганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см2.
Основные способы стерилизации питательных сред, посуды и
других лабораторных материалов обобщены в табл. 6.
Следует отметить, что все большее распространение получают
посуда и инструменты одноразового использования.
40
Таблица 6
Способы стерилизации питательных сред, посуды и других
лабораторных материалов
Стерилизуемый материал Метод стерили- зации Режим стерили- зации Примечание
1 2 3 4
Питательные среды с почвенной вытяжкой; картофельные и иеко торые другие натуральные среды автоклави- рование 1,5—2 атн, 30 мин в колбах, про- бирках, бутылях и т д, закрытых ватными проб- ками
Жидкие и агаризоваиные среды не содержащие сахаров и дру- гих веществ, разлагающихся при 120° автоклави- рование 1 атн, 20 мии то же
Жидкие и агаризоваиные среды, с сахарами и другими соедине- ниями, не выдерживающими нагревания прн 120° автоклави- рование 0,5 атн, 15—30 мин то же
Среды нли компоненты среды, не выдерживающие нагревания выше 100° дробная стерилиза- ция текучий пар, 3 раза по 30—40 мин через сутки то же
Среды или компоненты сред, не выдерживающие нагревания, например, белки, некоторые ви- тамины и аминокислоты фильтро- вание через бак- териальные фильтры — —•
Вазелиновое масло, глицерин, тальк горячим воздухом 160°, 2 ч или 170°, 1 ч слой вещества в сосуде не должен превышать 1,5 си
Чашки Петрн, пнпетки, шпатели горячим воздухом 160—170°, 2 ч завернуты в бу- магу (отверстия пипеток закрыты ватными тампо- нами)
Колбы, пробирки, химические ста- каны, флаконы, стеклянные центрифужные пробирки, трубки Бурри горячим воздухом 160—170°, 2 ч закрыты ватными проб- ками
41
Окончание табл. 6
1 2 3 4
Шприцы горячим воздухом 160°, 1 ч разобраны и за- вернуты в бума- гу или ткань
автоклави- рование 160°, 75 мин 1 ати, 15—20 мип в собранном виде, в пробирке, за- крытой ватной пробкой разобраны и завернуты
Мембранные фильтры автоклави- рование 1 ати, 15 мин в сосуде с дистиллирован- ной водой
кипячение 30 мин то же
•Фильтры Зейтца автоклави- рование горячим воздухом 1—1,5 ати, 20—30 мин 160°, 1 ч цилиндр держа- теля закрыт ватной пробкой, в отводной труб- ке ватный там- пон. Верхняя часть за- вернута в бумагу
Свети Шамберлана я Беркефельда автоклави- рование 0,5—1 ати, 15 мин можно вместе с держателем
горячим воздухом 160—170°, 2 ч закрыты ватными пробками, завер- нуты в бумагу и т. д., не долж- ны быдь соеди- нены с новыми дет алями
Стеклянные фильтры с держателем или отдельно автоклави- рование 1 ати, 30 мин закрыты ватными пробками, завер- нуты в пергамент и алюминиевую фольгу
Стеклянные фильтры без резиновых пробок горячим воздухом 1 ати, 20—30 мин заверну- ты в бумагу
Центрифужные пробирки, изготовленные из тер- молабильных пластмасс газовая стерилиза- ция зависит ог применяе- мого био- цида —
ультрафио- летовыми лучами время экс- позиции устанавли- вают экс- перимен- тально пробирки после облучения хранят в стерильной посуде
42
ГЛАВА 4
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Культивирование микроорганизмов является одним из основных
методов микробиологии. От умения культивировать микроорга-
низмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят
успехи их изучения и практического применения. Культивирова-
ние основано на знании физиолого-биохимических особенностей
микроорганизмов и понимании значения физико-химических усло-
вий среды, необходимых для их жизнедеятельности.
4.1. ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на
питательных средах, поэтому питательная среда должна содер-
жать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сот-
ни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав
которых определяется потребностями микроорганизмов в соедине-
ниях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конст-
руктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне
разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в
питательных веществах. Из этого следует, что универсальных
сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микро-
организмов, не существует.
Основными компонентами любой питательной среды для куль-
тивирования микроорганизмов являются соединения углерода и
азота. И именно эти соединения определяют специфичность по-
давляющего большинства питательных сред.
По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить
на две большие группы — автотрофы и гетеротрофы. Автотроф-
ные микроорганизмы способны в качестве единственного источни-
ка углерода использовать углекислоту — соединение, содержащее
углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при
культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки угле-
кислотой, так как концентрация углекислоты в воздухе не превы-
шает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недоста-
точно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды
для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия
(NaHCOs) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций
(СаСОз). В некоторых случаях через среду продувают воздух,
обогащенный 1—5% углекислоты.
43
Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть
удовлетворены только углекислотой. Для их развития среда дол-
жна содержать органические соединения. В зависимости от инди-
видуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны
использовать различные соединения углерода — кислоты, спирты,
углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом по-
требности некоторых микроорганизмов, например ряда бактерий
из семейства Pseudomonadaceae, могут быть удовлетворены ши-
роким набором различных органических веществ, тогда как дру-
гие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и
способностью использовать лишь немногие соединения углерода.
Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только
метан и метанол.
Вторым основным компонентом питательной среды является
источник азота. Азот входит в состав органических веществ клет-
ки главным образом в восстановленной форме — в виде амино
(—NH2)- или имино (—NH)-групп. Тем не менее потребности
микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены
различными азотсодержащими соединениями, в которых азот име-
ет разную степень восстановленности. Для очень многих микроор-
ганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды
вносят NH4CI или (NH4)2SO4. Следует, однако, помнить, что ам-
монийные соли — физиологически кислые соли, так как по мере
использования иона аммония в среде накапливается анион соот-
ветствующей кислоты, что приводит к заметному возрастанию кис-
лотности среды и может отрицательно повлиять на развитие мик-
роорганизмов.
Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте
Могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для
культивирования таких микроорганизмов содержат K.NO3, или
NaNO3. В отличие от солей аммония нитраты — физиологичес-
ки щелочные соли, так как при использовании аниона NOF в сре-
де накапливаются катионы К+ или Na+. Нитриты в кислых усло-
виях для многих микроорганизмов токсичны, поэтому в качестве
источника азота почти не используются.
Питательные среды для культивирования некоторых микроор-
ганизмов должны включать одну, несколько или полный набор
аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL-форме до-
бавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на
100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для
этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в кото-
рых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде
в 100 раз. Глицин, аланин, иролин, лизин и орнитин растворяют в
дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан — в дистил-
лированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокисло-
ты — в дистиллированной воде, подкисленной НС1. Аминокисло-
ты — цистин и цистеин, а также амиды — глутамин и аспарагин
неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрова-
44
нием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 ати
в течение 15 мин.
Потребности микроорганизов в некоторых аминокислотах час-
то удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для полу-
чения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу,
желатину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечни-
ка) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи,
водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолити-
ческих ферментов или кипячением с минеральными кислотами ли-
бо с крепкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и за-
висит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще
других используют гидролизат казеина, который готовят в лабо-
ратории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г ка-
зеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентрирован-
ной H2SO4 и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 ати. Однако
при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому
чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина до-
бавляют 280 мл 6 н. раствора НС1 и смесь кипятят с обратным
холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют
50%-ным раствором NaOH до pH 7, фильтруют через бумажный
фидьтр и стерилизуют при 0,5 ати 30 мин. Содержание аминного
азота в гидролизате, полученном таким способом, составляет
700—1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в таком количе-
стве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10—30 мг
на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе
полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени
цистеин и незначительно серин и треонин. Имеется готовый пре-
парат гидролизата казеинй. Его вносят в среды от 1,0 до 0,1 г на
100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов.
Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на
питательных средах, содержащих белки или продукты их непол-
ного расщепления — пептоны, представляющие собой смесь поли-
и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований,
солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздей-
ствия протеолитических ферментов на белки животного (мышеч-
ной белок, казеин) или растительного (белок соевой муки) проис-
хождения. В отечественных лабораториях чаще всего используют
ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом.
Это гигроскопический порошок светло-желтого цвета, полностью
растворимый ,в воде; 1%-ный раствор пептона имеет нейтральную
или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавля-
ют от 1—2 до 20 г на 1 л.
Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микро-
организмы могут использовать не только как источник азота, но
и как источник углерода и энергии.
Некоторые бактерии способны использовать в качестве един-
ственного источника азота молекулярный азот N2. Это азотфикса-
торы. В среды для культивирования таких микроорганизмов сое-
динений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов га-
45
зообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению
среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.
Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называ-
емых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пи-
римидины и аминокислоты. Чтобы подчеркнуть потребность
микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термин
«прототрофы» и ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в фак-
торах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в
среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами
особенно широко пользуются в литературе по генетике. Если пот-
ребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним
или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в
культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин
(витамин Bi), пантотенат Са, рибофлавин (витамин Вг), никоти-
новая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, ко-
баламин (витамин В12) — по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кис-
лота и n-аминобензойная кислота — по 0,05 мкг на 1 мл среды;
биотин —0,005 мкг на 1 мл среды.
Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно
перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать раство-
ры, в которых концентрация витамина превышает его содержание
в питательной среде в 100 раз. Растворы готовят в стерильной
посуде и используют стерильную дистиллированную воду. Исклю-
чение составляют рибофлавин и фолиевая кислота. Рибофлавин
растворяют в 0,02 й. уксусной кислоте, а фолиевую кислоту — в
0,01 н. NaOH, доводя затем концентрацию NaOH в растворе до
0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипя-
щей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина рекомендуется стери-
лизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разру-
шается. При температуре -|-4о растворы витаминов сохраняются не
менее месяца. Растворы фолиевой кислоты, пиридоксина и рибо-
флавина сохраняют в темноте, так как они светочувствительны.
Примерами смесей, содержащих различные факторы роста,
могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а так-
же кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для
культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автоли-
зат — в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота
составляла 5—30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт име-
ется в продаже. Дрожжевой автолизат готовят следующим обра-
зом: 40 г свежих прессованных или 10 г сухих дрожжей залива-
ют водой и перемешивают до получения гомогенной массы, затем
добавляют несколько кристаллов тимола или 1—2 мл хлороформа
и выдерживают в термостате при 50—55° 3 суток. За это время
клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и
гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Через 3 суток
полученный автолизат после тщательного перемешивания кипятят
на слабом огне 20 мин и фильтруют через бумажную пульпу, ис-
пользуя воронку Бюхнера. Содержание аминного азота определя-
46
ют формольным титрованием. Дрожжевой автолизат стерилизуют
при 0,5 ати 15 мин и сохраняют в холодильнике.
Кукурузный экстракт — готовый продукт заводов крахмало-
паточной промышленности. Он содержит аминокислоты, витами-
ны, большое количество органических кислот (молочной, уксус-
ной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт
вносят в среды от 0,2 до 5%; стерилизуют при 0,5 ати.
Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроор-
ганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фос-
фор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в пи-
тательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Пот-
ребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и дру-
гих зольных элементах удовлетворяются обычно за счет мине-
ральных солей. Поэтому «.минеральный фон» сред для культиви-
рования многих микроорганизмов может быть близким по составу.
Так, потребности значительного числа микроорганизмов в сере
удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в ос-
новном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп.
Значительно реже встречаются микроорганизмы, требующие на-
личия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вно-
сят сульфиды, чаще всего Na2S, или органические соединения,
содержащие сульфгидрильные группы, например цистеин.
Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микро-
организмов в фосфоре. Все необходимые металлы — К, Na, Са,
Mg, Fe, Мп, Со, Си — и другие элементы микроорганизмы полу-
чают в форме катионов или анионов неорганических солей. На-
пример, источником магния служит MgSO4, источником натрия и
хлора — NaCl, кальция — СаСО3 или СаС12. Железо добавляют
к средам в виде хлорида, сульфата или цитрата.
Чтобы избежать выпадения осадка в результате образования
нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, осо-
бенно с железом и кальцием, к средам рекомендуется добавлять от
0,001 до 1 г/л этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) или гексамета-
фосфата натрия в концентрации 4 г/л. Комплексы, образуемые эти-
ми соединениями с катионами, служат резервом, из которого в
результате диссоциации в раствор поступают свободные катионы.
Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно
больших количествах, поэтому их соли, как правило, включают в
состав питательных сред. Потребности микроорганизмов в мар-
ганце, молибдене, цинке, меди, кобальте очень малы. Эти элемен-
ты, часто называемые микроэлементами, вносят в среды от 1 мг
до 1 мкг на 1 л; более высокие концентрации могут быть токсич-
ны. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожже-
вым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые
микроэлементы. В состав синтетических сред, которые готовятся
на дистиллированной воде, их следует вносить. Об оптимальных
концентрациях микроэлементов для разных микроорганизмов из-
вестно мало, поэтому предложены различные по составу смеси
микроэлементов. Растворы микроэлементов рекомендуется стери-
47
лизовать отдельно и вносить в среду непосредственно перед ее
засевом.
Питательные среды для культивирования микроорганизмов
кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, дол-
жны включать и энергетический материал. По способу получения
энергии все микроорганизмы принято делить на две основные
группы: хемотрофы и фототрофы.
Хемотрофы используют энергию окисления различных соедине-
ний. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода)
среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемо-
органотрофы. Первые окисляют неорганические соединения, такие
как H2S, S° или другие не вполне окисленные соединения серы,
Н2, NH4+, NO7 или Fe2+.
Для хемоорганотрофов энерегетическим субстратом служат ор-
ганические вещества, которые обычно играют двоякую роль, яв-
ляясь одновременно и источником углерода и источником энергии.
Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и
энергетических процессов нуждаются в разных соединениях. На-
пример, гомоферментативные молочнокислые бактерии получают
энергию при сбраживании сахаров, но почти не используют их в
процессах биосинтеза. Для конструктивных целей им необходимы
готовые аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания,
витамины.
Фототрофы используют энергию света. Чтобы удовлетворить
потребности этих бактерий в энергии, их культивируют при есте-
ственном или искусственном освещении.
По составу принято выделять естественные, или натуральные,
среды и синтетические среды.
Натуральными называют среды, в состав которых входят про-
дукты животного или растительного происхождения. К таким сре-
дам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани,
разведенная кровь, молоко, воды морей, озер и минеральных ис-
точников, отвары или экстракты, полученные из природных суб-
стратов, таких как мясо, почва, навоз, различные части растений,
клетки микроорганизмов.
На натуральных средах хорошо растут многие микроорганиз-
мы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходи-
мые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный,
непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения
обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть
потребление ряда компонентов и образование продуктов метабо-
лизма. Натуральные среды используются главным образом для
поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и
для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко
применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный
бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная
среды, почвенный экстракт.
48
Мясо-пептонный бульон (МПБ). Основой для его при-
готовления служит мясная вода, которую готовят следующим об-
разом: 500 г мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий,
мелко нарезают или пропускают через мясорубку, заливают 1 л
водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на
12 ч или в термостате при 30° на 6 ч, а при 37° — на 2 ч. За это
время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе
водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю,
и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются
белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доли-
вают водой до первоначального объема. К мясной воде добавля-
ют 1% пептона и 0,5% NaCl.
МПБ — богатая питательная среда, но она почти не содержит
углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще
всего в количестве 1—2 г на 100 мл. МПБ стерилизуют при
1 ати.
Солодовое (н ео х м е л е н н о е пивное) сусло —
хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых
бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов и других представите-
лей гетеротрофных микроорганизмов. Основные компоненты сус-
ла — углеводы (до 90 % от общей массы сухого остатка) и азот-
содержащие соединения (до 6—7% от общей массы сухого остат-
ка). Из углеводов в наибольшем количестве содержатся мальто-
за и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимуществен-
но группы В, органические кислоты и минеральные соли.
Сусло готовят следующим образом. 250 г размолотого солода
заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48—50° и под-
держивают эту температуру в течение получаса, непрерывно поме-
шивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последую-
щие полчаса температуру поднимают до 55—58° и поддерживают
на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т. е. до тех
пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной.
При указанном режиме происходит также гидролиз белков до
аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через
бумажную пульпу или вату. В фильтрате определяют концентра-
цию сахара, пользуясь ареометром Баллинга, Градусы (°Б) ко-
торого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в
сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой.
Для культивирования микроскопических грибов чаще всего ис-
пользуют 3—4° Б сусло, для дрожжей — 6—8° Б, а для наибо-
лее требовательных молочнокислых бактерий — 8—12 °Б сусло.
Сусло стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.
Дрожжевая среда используется для культивирования ря-
да гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды —
дрожжевая вода. Для ее приготовления 70—100 г свежих прессо-
ванных или 7—10 г сухих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л воды и
после осаждения клеток дрожжей жидкость декантируют или
фильтруют через вату. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз
30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожже-
49
вой воды добавляют 1—2 г углеводов и минеральные соли, чаще
всего К2НРО4 (0,1 г) и NaCl (0,5 г). Доводят pH среды до
6,8—7,2. Среду стерилизуют при 0,5 ати 20—30 мин.
Картофельная среда используется в основном для
культивирования спорообразующих бактерий, представителей
рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бакте-
рий. Для приготовления этой среды 200 г тщательно вымытого и
очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими
ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 20—
30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до
1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизу-
ют 1 ч при 1 ати или 30 мин при 1,5 ати.
Почвенный экстракт используют главным образом
для культивирования разнообразных представителей почвенных
микроорганизмов. Для его приготовления 500 г плодородной поч-
вы заливают 1,5 л водопроводной воды и автоклавируют при 1 ати
30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр,
добавляют к горячему фильтрату 0,5 г СаСО3, тщательно переме-
шивают и через 5—7 мин фильтруют вновь. К экстракту, как пра-
вило, добавляют 0,2 г К2НРО4.
Синтетические среды — это среды, в которые входят лишь
соединения определенного химического состава, взятые в точно
указанных количествах. Синтетические среды широко используют
при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии мик-
роорганизмов. Для разработки состава синтетических сред, обес-
печивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез ка-
кого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особен-
ности обмена веществ данного организма и потребности его в ис-
точниках питания. В распоряжении микробиологов имеется доста-
точное количество синтетических сред, не уступающих по своим
качествам натуральным стредам неопределенного состава. Синте-
тические среды могут иметь относительно большой набор компо-
нентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Рецепты
некоторых синтетических сред приведены в .приложении.
Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют
так называемые полусинтетические среды. Главными компонента-
ми полусинтетических сред являются соединения известного хими-
ческого состава — углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты
и т. д. Однако в их состав всегда включаются вещества неопреде-
ленного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный эк-
стракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое при-
менение в промышленной микробиологии для получения амино-
кислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов
жизнедеятельности микроорганизмов.
Следует иметь в виду, что среды, обеспечивающие хорошее
развитие микроорганизмов, не всегда подходят для решения дру-
гих исследовательских и практических задач, так как далеко не
во всех случаях накопление какого-либо продукта жизнедеятель-
50
ности — фермента, витамина, антибиотика и т. д. — идет парал-
лельно накоплению биомассы. Нередко при обильном росте мик-
роорганизмов желаемый продукт метаболизма почти не образует-
ся или образуется в недостаточном количестве. Чтобы обеспечить
образование необходимого соединения в максимально возможных
количествах, применяют специальные среды. Подбор концентра-
ции и соотношения компонентов среды осуществляют, используя
методы математического планирования эксперимента, которые до-
статочно подробно изложены в книге В. Н. Максимова (1980).
Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды да*
ют возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от
других или выявить некоторые их особенности. Примером инди-
каторной среды для выявления бактерий из группы кишечной .па-
лочки в естественных субстратах может служить агаризованная
среда Эндо следующего состава, г: пептон — 10; лактоза — 10;
К2НРО4 — 3,5; NaHSO3 — 2,5; агар — 150; вода дистиллирован-
ная — 1000 мл; pH 7,4. К среде добавляется 4 мл 10%-ного спир-
тового раствора основного фуксина. Среду стерилизуют при 1 ати
15 мин и сохраняют в темноте. Бактерии из рода Escherichia на
этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блес-
ком.
При определении видовой принадлежности бактерий использу-
ют pH-индикаторные среды, в состав которых входит один из ин-
дикаторов — нейтральный красный (0,0005%), феноловый крас-
ный (0,005%) или бромтимоловый синий (0,0005%). Если разви-
тие микроорганизмов сопровождается образованием кислоты или
щелочи, цвет индикатора изменяется. Дифференциально-диагно-
стические среды особенно широко применяются в санитарной и
медицинской микробиологии для быстрой идентификации опреде-
ленных групп микроорганизмов.
По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и
плотные среды.
Жидкие среды широко применяют для накопления биомассы
или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии
микроорганизмов, а также для поддержания и сохранения в кол-
лекции культур микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной
микробиологии для культивирования некоторых продуцентов фи-
зиологически активных соединений, а также в коллекциях для со-
хранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся,
например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропи-
танный питательным раствором.
Плотные среды используют для выделения чистых культур, в
диагностических целях для описания колоний, для определения
количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для
хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. С целью
уплотнения сред применяют агар или желатину. Плотной основой
51
могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают пи»
тательной средой.
Агар используют для уплотнения сред особенно часто. Он
представляет собой сложный полисахарид, в состав которого
входит агароза и агаропектин. Кроме того, агар включает неболь-
шое количество легко ассимилируемых веществ и различные соли.
Агар получают из некоторых морских водорослей и выпускают в
виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что
большинство микроорганизмов не используют его в качестве суб-
страта для роста. В воде он образует гель, который плавится при-
мерно при 100° и затвердевает при температуре 40°. Поэтому на
агаризованных средах можно культивировать значительную часть
известных микроорганизмов.
Чаще всего агар добавляют ,к средам в количестве 1,5%. Если
необходимо получить более влажную среду, вносят 1,0%, а более
плотную и сухую — 2—3% агара. Среду с агаром нагревают на
кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если пред-
полагают выращивать микроорганизмы на скошенной агаризован-
ной среде в пробирках, то каждую пробирку заполняют средой
не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают
после стерилизации, перед посевом. Для этого пробирки с рас-
плавленной в кипящей водяной бане средой устанавливают в на-
клонном положении (рис. 36) и дают среде застыть. Скошенная
агаризованная среда не должна доходить до ватной пробки на
4—6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий
в чашках Петри, разливают по 20—25 мл в пробирки большего
объема, чем для скошенной агаризованной среды, или стерилизуют
в колбах. В последнем случае до стерилизации агар не расплав-
ляют.
Агар имеет слабощелочную реакцию, поэтому его добавление
может привести к незначительному повышению pH среды. В сла-
бокислых, нейтральных или слабощелочных средах агар сохраня-
ет способность образовывать гель после нескольких циклов плав-
ления и затвердевания и даже после повторной стерилизации.
Однако необходимо помнить, что при pH среды ниже 5,5 агар при
стерилизации частично гидролизуется и поэтому теряет способ-
ность образовывать гель, т. е. не застывает. В этом случае его
стерилизуют отдельно от среды
Рис. 36. Приготовление скошенной
агаризованной среды в пробирках
в определенном объеме воды, рас-
плавляют на водяной бане и
приливают при постоянном пере-
мешивании к стерильной, пред-
варительно подогретой среде.
Агар, как указывалось выше,
содержит примеси органических
и минеральных веществ, которые
иногда нежелательны. Чтобы из-
бавиться от большинства из них,
поступают следующим образом.
Агар заливают водопроводной
52
водой и ставят в термостат на 30—37°. Примеси вымываются в
воду и разлагаются под действием развивающихся в ией микро-
организмов. Через день-два жидкость сливают, агар промывают
несколько раз свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят
в термостат. Когда и эта вода помутнеет, то ее опять заменяют
новой, и так делают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода
не перестанет мутнеть. Обычно через 2—3 недели, получают агар»
почти лишенный растворимых органических и минеральных ве-
ществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый ме-
шок и 2—3 суток промывают проточной водопроводной водой, за-
тем раскладывают его тонким слоем и просушивают на воздухе
или в сушильном шкафу при 40—50°.
Эффективно заменять агар может более дешевый каррагенан,
экстрагируемый из определенных видов красных морских водо-
рослей. Каррагенан не разрушается большинством видов микро-
организмов. Из него можно готовить гели, устойчивые к темпе-
ратурам до 60°. Среды с каррагенаном готовят, как и среды с ага-
ром. После добавления каррагенана к основной жидкой среде
ее кипятят, чтобы полностью растворить его, а затем стерилизуют
автоклавированием. Стерильную среду охлаждают до 55—60°,
разливают в чашки и дают застыть. Для гелей, устойчивых при
60°, добавляют 2,4% каррагенана, при 45° — 2,0%.
Иногда для экономии агара используют его смесь с полиак-
риламидами (Separan NP-10, пластагар) в соотношении 1:1.
Желатина — это экстракт, получаемый из субстратов, бо-
гатых коллагеном — белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи.
Образуемый желатиной гель плавится при температуре 25°, кото-
рая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганиз-
мов (30—37°). Кроме того, желатина разжижается протеолити-
ческими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют
в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в
качестве уплотняющего средства. Желатину используют главным
образом в диагностических целях — для выявления протеолити-
ческой активности микроорганизмов, а также для получения ги-
гантских и глубинных колоний дрожжей. В первом случае упот-
ребляют мясо-пептонную, во втором — сусловую желатину.
К жидким средам добавляют 10—20% желатины, оставляют на-
бухать 5—10 мин и нагревают на водяной бане до растворения.
Доводят pH среды до 6,8—7,0. Желатина имеет кислую реакцию
и обладает большой буферностью, поэтому на ее нейтрализацию
идет больше щелочи, чем, например, на нейтрализацию МПА.
Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 ати 15 мин или дроб-
но — 3 раза по 20 мин в кипятильнике Коха. Повторная стерили-
зация желатиновых сред, особенно при pH сред ниже 6,0 или вы-
ше 7,3 не рекомендуется, поскольку желатина частично гидроли-
зуется и теряет гелеобразующие свойства.
Кремнекислый гель (силикагель) используют иногда
как твердую основу для синтетических сред. Гель готовят следу-
ющим образом. К соляной кислоте плотностью 1,1 добавляют при
53
перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (Na2SiO3
или Кг$10з) той же плотности. Смесь разливают в чашки Петри
по 20—30 мл в каждую и оставляют чашки на горизонтальной по-
верхности на несколько часов до образования кремнекислого геля.
Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стек-
лянный или эмалированный сосуд, промывают 2—3 суток проточ-
ной водой для удаления хлоридов, а затем несколько раз горячей
дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качест-
венной пробе промывных вод с 1—5%-ным раствором азотнокис-
лого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок.
Отмытые от хлора пластинки пропитывают 2—3 мл концентриро-
ванной среды, содержание компонентов в которой в 5—10 раз вы-
ше, чем в соответствующей среде. Затем чашки с гелевыми плас-
тинками помещают открытыми в сушильный шкаф и подсушива-
ют при 50—60°, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его
поверхность осталась влажной. Если необходимо, чашки заверты-
вают в бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при
0,5 ати 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и
культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать.
Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Чашки с
силикагелевыми пластинками до употребления сохраняют под во-
дой.
Некоторые особенности агара, желатины и кремнекислого геля
суммированы в табл. 7.
Таблица 7
Основные особенности веществ, употребляемых для уплотнения
питательных сред
Показатели Агар Желатина Кремнекислый гель
Исходный материал для получения морские водорос- ли кожа, кости, хрящи кремнекислый калий или натрий и соляная кислота
Основные компо- ненты полисахариды белки кремневая кислота
Температура плав- ления, °C 100 22—25 —
Температура засты- вания, °C 40 22—25 —
Действие протеаз не действуют действуют не действуют
Конденсационная вода выделяется не выделяется не ваделяется
Употребляемая концентрация, % 1,0-3,0 10—20 —
54
Осветление сред. Осветленные агаризованные или желатино-
вые среды необходимы для некоторых специальных исследований,
например для получения хорошо видимых изолированных коло-
ний анаэробных микроорганизмов.
В ряде случаев прозрачную среду можно получить, отфиль-
тровав ее от осадка через гигроскопическую вату. Когда этого
бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков кури-
ного яйца. Для осветленця 500 мл среды достаточно белка одного
яйца. Белок отделяют от желтка и встряхивают с равным объе-
мом воды до образования сплошной пены. Взбитый белок выли-
вают в предварительно расплавленную и остуженную до 45—50°
среду. Перед внесением белка проверяют pH и, если необходимо,
подщелачивают среду до pH 7,0—7,3. Среду с белком тщательно
перемешивают и прогревают при 100° в автоклаве или кипятиль-
нике Коха в течение часа. Белок свертывается и адсорбирует все
взвешенные в среде частицы. Когда свернувшийся белок подни-
мается на поверхность или опустится вниз, среду быстро отфиль-
тровывают в горячем виде через вату. При этом удобно пользо-
ваться специально подогреваемыми подставками для воронок,
благодаря которым предотвращается застывание среды во время
фильтрования.
Синтетические агаризованные среды, в которые вносить белок
нежелательно, осветляют следующим образом. Среду наливают в
химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилиза-
ции в закрытом автоклаве на 10—12 ч, обычно на ночь. При та-
ком медленном остывании все взвешенные частицы оседают на
дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана,
верхнюю (прозрачную часть) срезают, помещают в колбу и вновь
стерилизуют
* *
*
Посуда, предназначенная для приготовления сред и культиви-
рования микроорганизмов, не должна содержать посторонних
веществ. Лучше всего пользоваться стеклянной посудой. Новую
стеклянную посуду моют и погружают на ночь в 1—2°/р-ный раст-
вор соляной или серной кислоты, затем многократно промывают во-
дой и высушивают. Иногда для работы с микроэлементами, вита-
минами, синтетическими и другими средами требуется особо тща-
тельная очистка посуды. Натуральные среды неопределенного со-
става можно готовить в эмалированной посуде.
Не следует готовить впрок больших запасов сред, так как они
высыхают, концентрируются и становятся непригодными. Сохра-
няют среды в прохладном, защищенном от света и не слишком
влажном помещении. В сырости ватные пробки пропитываются
влагой и через них может прорасти мицелий микроскопических
55
грибов. Каждый сосуд со средой должен иметь этикетку с обоз-
начением состава (названия) среды и времени ее приготовления.
4.2. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не
только состав питательной среды, но и такие факторы, как кис-
лотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие
микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каж-
дого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти
пределы часто неодинаковы.
4.2.1. Активная кислотность среды
Активная кислотность (pH) среды имеет решающее значение
для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше
всего растут при pH, близком к 7,0, напротив, микроскопические
грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовлен-
ных средах всегда следует определить значение pH. Измеряют
pH электрометрическим методом на потенциометре. В лаборатор-
ной практике удобно использовать различные жидкие или бумаж-
ные индикаторы (см. Приложение). Широко применяется, напри-
мер, жидкий двухцветный индикатор, бромтимоловый синий
(бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при
сдвиге pH от 6,0 до 7,6. При pH 7,3 индикатор имеет сине-зеленую
окраску. Используют также универсальный индикатор, который
изменяет окраску в интервале pH от 2 до 10.
В случае необходимости pH сред доводят до нужного значения
растворами кислот (НС1, H2SO4), щелочей (NaOH, КОН) или со-
лей, имеющих щелочную реакцию (Иа2СОз, NaHCOs). Для кор-
ректировки pH целесообразно иметь растворы разной концентра-
ции. Значение pH сред может измениться в процессе стерилизации,
поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до
нужного, если это требуется, стерильными растворами кислоты
или щелочи.
Активная кислотность питательной среды, благоприятная для
начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе куль-
тивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть резуль-
татом образования продуктов метаболизма или неравномерного
потребления отдельных компонентов среды. Например, при сбра-
живании углеводов в среде накапливаются органические кислоты,
снижающие pH среды. В средах с KNO3 pH возрастает, как уже
отмечалось, благодаря более интенсивному потреблению нитрат-
иона и накоплению ионов калия.
Чтобы не допустить чрезмерного изменения pH в культурах
микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, исполь-
зуют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные
растворы (см. Приложение). В микробиологической практике ча-
56
ще других применяют фосфатные буферы. Однако если рост мик-
роорганизмов сопровождается образованием большого количества
кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно до-
бавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказыва-
ется недостаточно, так как противодействие любого буфера изме-
нению pH не беспредельно. Поэтому для микроорганизмов, актив-
но изменяющих кислотность среды, применение буферов, неэф-
фективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды
вводят избыточное количество мела, который нейтрализует обра-
зующиеся кислоты. Можно нейтрализовать образующиеся кисло-
ты по ходу развития культуры 10%-ным стерильным раствором
NaHCO3.
Поддержание определенного значения pH во время роста осо-
бенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в про-
цессе жизнедеятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к
ним. К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также мно-
гие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нуж-
но поддерживать pH в слабощелочных средах, так как для диапа-
зона pH от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. Поэтому
иногда приходится периодически или непрерывно доводить pH до
нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты
или щелочи при постоянном контроле значения pH. В современ-
ных ферментерах это достигается с помощью специальных авто-
матических устройств.
4 2.2. Аэрация
Кислород входит в состав всфы и многих соединений, поэтому
поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значи-
тельная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке
молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объ-
единять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом,
у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород игра-
ет роль терминального окислителя. Среди облигатных аэробов вы-
деляют группу микроаэрофильных микроорганизмов, которые
нуждаются в кислороде, но лучше растут при парциальном давле-
нии Ог< меньшем, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов,
напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение
энергии у этих микроорганизмов не связано с использованием
молекулярного кислорода. Для многих из них кислород токси-
чен — он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие мик-
роорганизмы называют облигатными анаэробами. Среди микроор-
ганизмов выделяют также группу факультативных анаэробов,
представители которой способны расти как в присутствии, так и в
отсутствие молекулярного кислорода. Например, некоторые дрож-
жи иди энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осу-
ществляют аэробное дыхание или брожение.
Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кис-
лороде определяют различия и в способах их культивирования.
57
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Культивирование на поверхности плотных и жидких сред. В
этом случае микроорганизмы выращивают на поверхности плот-
ной среды или в тонком слое жидкой среды, и кислород поступает
к ним непосредственно из воздуха. При поверхностном культи-
вировании важно увеличить площадь соприкосновения среды с
воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с
широким дном — чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы
(см. рис. 30). В жидких средах аэробные микроорганизмы часто
растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэро-
бы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой
среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. По-
верхностное культивирование микроорганизмов применяется как
в лабораторных условиях, так и в промышленности.
Глубинное культивирование в жидких средах. Все способы
глубинного культивирования аэробных микроорганизмов сводятся
к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с
кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном
культивировании в жидких средах микроорганизмы используют
растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в
воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микро-
организмов в толще среды,- ее необходимо постоянно аэрировать.
При аэрировании среды учитывают два показателя: интенсивность
аэрации и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризу-
ется скоростью растворения кислорода в единице объема культу-
ральной среды за единицу времени. Степень аэрации — это объем
воздуха, продуваемый через определенный объем среды за едини-
цу времени.
Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной
практике способ глубинного культивирования — выращивание на
качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или
пробирок со скоростью 100—200 и более оборотов в минуту. Чем
больше скорость вращения, тем больше соприкосновение среды с
воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию
среды при работе на одной и той же качалке можно уменьшени-
ем объема среды или применением колб с отбойниками — вдавли-
ваниями внутрь в виде 4—8 отростков 2—3 см длиной
(см. рис. 30). При вращении колб с отбойниками поверхность со-
прикосновения среды с воздухом заметно увеличивается благода-
ря разбрызгиванию жидкости Чем больше отбойников, тем силь-
нее разбрызгивание жидкости, тем выше аэрация.
Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов на
качалках характеризуют, как правило, скоростью поглощения
кислорода водным раствором сульфита. Раствор сульфита налива-
ют в сосуды для культивирования вместо питательной среды и че-
рез определенные промежутки времени .измеряют количество окис-
ленного сульфита в тех же условиях аэрации, при которых выращи-
ваются исследуемые микроорганизмы. Метод подробно описан в
58
«Практикуме по микробиологии» (1976).
Сульфитный метод не дает возможности
определить концентрацию кислорода в
культуре. Концентрацию кислорода, рас-
творенного в культуральной жидкости,
определяют полярографически.
Помимо перемешивания аэрировать
культуру микроорганизмов можно про-
дуванием через толщу среды стерильно-
го воздуха. Этот способ часто использу-
ют в лабораторных исследованиях, но
особенно широкое применение он нашел
в промышленной микробиологии при по-
лучении биомассы и различных продук-
тов жизнедеятельности микроорганиз-
мов — антибиотиков, ферментов, кислот.
Скорость протекания воздуха через сре-
ду необходимо контролировать. Для это-
го используют различные приборы: га-
зовые часы, ратодоетры и др. В ферменте-
рах количество пропускаемого воздуха
поддерживают на заданном уровне авто-
матически. Воздух стерилизуют путем
прохождения через активированный дре-
весный уголь, стеклянную вату, пропи-
танную антисептиком, или специальные
ткани из полимеров. В лабораторных
опытах, когда объем и скорость постуг
используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для
возможно более сильного распыления воздух пропускают через
мелкопористые пластинки — барботеры; в лабораторных опытах
с этой целью применяют стеклянные фильтры.
Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, исполь-
зуют обычный воздух. Продувание сред кислородом в лаборатор-
ных условиях не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение
среды кислородом (до 40 мг/л) может привести к угнетению роста
микроорганизмов. В ферментерах принудительную аэрацию обыч-
но совмещают с механическим перемешиванием среды мешалка-
ми, скорость вращения которых может достигать сотен и даже
тысяч оборотов в минуту. Схема ферментера для глубинного
культивирования аэробных микроорганизмов приведена на рис. 37.
37 Схема ферментера
2
Рис
для глубинного культивиро-
вания аэробных микроорга-
низмов
вход воздуха, 2 — вы-
воздуха, 3 — барбо-
4 — отбойники, 5 —
мешалка
1 ~
ход
тер,
воздуха невелики,
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Выращивание анаэробных микроорганизмов более сложно, чем
культивирование аэробов, так как соприкосновение клеток ана-
эробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму
или даже полностью исключено. Для этого используют разные
приемы, нередко комбинируя их друг с другом.
59
Выращивание в высоком слое среды. Это наиболее простой,
способ ограничения доступа воздуха к клеткам микроорганизмов.
Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким
слоем. Так как нельзя стерилизовать среды, если они занимают бо-
лее половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно
и стерильно доливают ею сосуд для культивирования сразу же
после посева. Непосредственно перед посевом среду кипятят иди
прогревают на кипящей водяной бане 30—40 мин, затем быстро
охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха,
и вносят на дно посевной материал.
Культивирование в вязких средах. Диффузия кислорода в
жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости. Поэтому в
вязких средах, таких .как картофельная или среды с кукурузной
либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные
анаэробы, например, возбудители маслянокислого или ацетонобу-
тилового брожения. Вязкость жидких сред легко увеличить, если
добавить к ним 0,2—0,3% агара.
Выращивание в толще плотной среды. Этим приемом пользу-
ются для получения изолированных колоний при выделении чис-
тых культур или определении численности анаэробных микроор-
ганизмов. Посевной материал вносят в расплавленную и остужен-
ную до 48—50° агаризованную, желательно осветленную среду,
тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или перелива-
ют стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки
Бурри или чашки Петри. Поверхность среды в пробирках зали-
вают парафином. Трубки Бурри — это стеклянные трубки длиной
20—25 см, диаметром 1,0—1,5 см. Трубки стерилизуют, зркрыв
оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у од-
ного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец
трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также
резиновой пробкой (рис. 38).
При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов
засеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки и, по-
сле того как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхно-
сти дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда
соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином
Рис. 38. Трубка Бурри:
А — трубка, подготовленная к.
стерилизации; Б — колонии ана-
эробных микроорганизмов в толще
агаризованной среды
Рис 39. Культивирование анаэробов,
в чашке Петри:
1 — агаризованная среда; 2 — пара-
фин
60
Выращивание в анаэростатах. Анаэробные микроорганизмы
можно выращивать в анаэростатах — вакуумных металлических
камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить
обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата от-
качивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой
смесью, состоящей из азота (90—80%) и углекислоты (10—20%),
до давления порядка 67-103 Па (500 мм рт. ст.). Избыточное дав-
ление исключает возможность диффузии кислорода воздуха.
Некоторые строгие анаэробы, например, метанобразующие
бактерии, ацетогены, некоторые грибы, расщепляющие целлюлозу,
микроорганизмы рубца жвачных животных, погибают даже при
кратковременном контакте с кислородом воздуха. Работа с таки-
ми микроорганизмами представляет большие трудности и требует
специального оборудования. Для культивирования строгих (обли-
гатных, экстремальных) анаэробов необходимо применять мето-
ды, позволяющие исключать молекулярный кислород из сред
культивирования, создавать и поддерживать в них низкий окисли-
тельно-восстановительный потенциал (ОВП). С этой целью ис-
пользуют технику, разработанную профессором Хайгейтом (Hun-
gate): 1) среды для выращивания микроорганизмов и все добавки
в них готовят перед автоклавированием с максимальной защищен-
ностью от контакта с кислородом (кипячение и т. д.); 2) после авто-
клавирования среды и добавки для них немедленно охлаждают в
токе стерильного газа, освобожденного от следов кислорода про-
пусканием над медными стружками, нагретыми до 350—400 °C;
3) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители
(цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для хи-
мического поглощения следов кислорода, диффундирующего в со-
суды для культивирования даже через резиновые пробки; 4) по-
севы, разлив сред, в том числе агаризованных, проводят в трке
стерильного газа, не содержащего кислорода; 5) микроорганизмы
выращивают и поддерживают в герметически закрытых сосудах,
в атмосфере бескислородного газа, часто под давлением для ис-
ключения проникновения воздуха; 6) все шланги, по которым
идут газы для продувки сосудов, должны быть из специальной ре-
зины, со слабой степенью диффузии кислорода воздуха, или за-
менены на металлические трубки; 7) все пересевы и добавки в
среды проводят с помощью шприцев, продутых газом, не содер-
жащим кислорода.
Степень поглощения кислорода и восстановленности среды оп-
ределяется окислительно-восстановительным потенциалом Eh, ко-
торый может быть измерен электрометрически на потенциометре
или с помощью индикаторных красителей, например, резазурина,
феносафранина, нейтрального красного и т. д., изменяющих ок-
раску при изменении Eh. Особенно удобен резазурин, который
добавляют к средам в концентрации 0,0001 % и стерилизуют вме-
сте с минеральными компонентами среды. В окисленной форме он
окрашен в голубой цвет, при восстановлении цвет меняется на
61
слабо-розовый, полностью восстановленная форма бесцветна. Ре-
зазурин изменяет окрраску при значениях ОВП, близких к—420'
мВ, феносафранин — в области —252 мВ.
Для культивирования анаэробов предложены специальные ка-
меры и система ГазПак (GasPak), образующая газы (водород и
СОг) в замкнутом пространстве и эффективно поглощающая кис-
лород. В качестве поглотителя кислорода в лабораторной практи-
ке используют щелочной раствор пирогаллола, дитионита натрия,
металлическое железо и некоторые другие реактивы. При этом
необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и
объем замкнутого пространства, в котором выращивают микроор-
ганизм. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пи-
рогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия. Поскольку
многие анаэробы нуждаются в углекислоте, пирогаллол часто
растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната
датрия. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором,
содержащим окислительно-восстановительный индикатор. Для
приготовления раствора смешивают равные объемы 0,024% -ного
NaOH, 0,015%-ного водного метиленового синего и 6%-ной глю-
козы; в качестве антисептика к раствору добавляют тимол. Перед
использованием в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают на
кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и
помещают в анаэростат. В анаэробных условиях раствор остается
бесцветным.
В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и
тиогликолат натрия. Обычно готовят 1%-ные растворы этих вос-
становителей в 5%-ном растворе бикарбоната натрия, стерилизу-
ют автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия из
расчета 250—500 мг/л, а тиогликолат — до 250 мг/л среды. Вос-
становители используют в концентрациях, не влияющих иа рост
микроорганизмов.
Для культивирования строгих анаэробов предложены специ-
альные камеры, заполненные газовыми смесями (чаще всего 90%'
N2, 5% СО2 и 5% Н2), которые содержат внутри все необходимое
для выполнения микробиологических работ, включая термостат.
Это оборудование сложно и дорого, но оно имеет одно неоспори-
мое преимущество —• контакт клеток с кислородом воздуха оста-
ется минимальным почти на всех этапах работы.
4.2.3. Температура
Интервалы температур, в которых возможен рост различных
микроорганизмов, заметно варьируются. У мезофилов, к которым
относится большинство известных нам форм, температурный оп-
тимум лежит в интервале от 25 до 37°. У термофилов он значи-
тельно выше — от 45 до 80—90°. Психрофилы хорошо развива-
ются в интервале температур 5—10°. Отклонения температуры от
оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганиз-
мов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или
62
специальных термостатированных комнатах, где с помощью тер-
морегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная
температура. Мезофильные бактерии, естественным местом оби-
тания которых являются вода и почва, выращивают в интервале
от 20 до 30°, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или
кишечника человека и животных культивируют при более высо-
кой температуре — 35—37°.
Для выращивания психрофилов используют холодильные ка-
меры.
4.2.4. Свет
Для роста подавляющего большинства микроорганизмов осве-
щение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрица-
тельно влияют на их развитие. Поэтому такие микроорганизмы
выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных
микроорганизмов. Однако естественное освещение используют ред-
ко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило,
фототрофов выращивают в люминостатах, т. е. в камерах, осве-
щенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами
дневного света. Необходимая температура в люминостатах созда-
ется благодаря вентиляции или холодильному устройству.
Выбор источника освещения определяется спектром его излу-
чения и длинами волн, при которых осуществляют фотосинтез
культивируемые микроорганизмы. Для выращивания пурпурных и
зеленых бактерий лучше использовать лампы накаливания; для
культивирования цианобактерий и микроводорослей можно при-
менять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спект-
рального .состава света обращают внимание на освещенность, ко-
торую измеряют с помощью люксметра.
4.2.5. Вода
Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружа-
ющей среде воды, причем вода должна находиться в доступной
для клетки форме, т. е. жидкой фазе. Однако в природных суб-
стратах и питательных средах часть воды ассоциирована с моле-
кулами растворенных веществ и не может быть использована
микроорганизмами. Доступность воды в субстрате для роста мик-
роорганизмов выражают величиной активности воды (а®):
где Р — давление пара раствора (мм рт. ст.); Ро — давление па-
ра чистой воды (мм рт. ст.) при данной температуре. Значение
aw для дистиллированной воды равно 1,00. При растворении раз-
личных веществ в воде эта величина уменьшается и соответствен-
но падает доступность для клетки воды.
63
Микроорганизмы могут расти на средах со значением aw от
0,99 до 0,63. Потребности в доступной воде у бактерий, как пра-
вило, выше, чем у дрожжей и мицелиальных грибов. Так, боль-
шинство бактерий, за исключением галофилов, хорошо растут на
средах с величиной aw от 0,99 до 0,95, минимальная величина
aw, обеспечивающая рост дрожжей, лежит в пределах от 0,91 до
0,88.
Активность воды в среде можно определить по формуле
аи,=А/100, где А — относительная влажность (%) атмосферы,
которую измеряют при равновесии в закрытом сосуде, содержа-
щем среду. Различную активность воды в питательной среде или
субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как
NaCl, КС1, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.
4.2.6. Периодическое и непрерывное культивирование
Существуют две принципиально разные системы выращивания
микроорганизмов в жидкой среде. В одном случае после инокуля-
ции среды не происходит ни добавления в нее, ни удаления ка-
ких-либо компонентов, кроме газовой фазы. Такая закрытая сис-
тема культивирования носит название периодической и может
поддерживать размножение клеток только в течение ограниченно-
го времени, на протяжении которого меняется состав исходной
среды и окружающие условия.
Непрерывное (проточное) культивирование в отличие от пе-
риодического характеризуется постоянной подачей питательной
среды со скоростью, равной скорости удаления культуры. При
этом объем культуры в ферментере во времени не меняется. Одно
из основных условий непрерывного культивирования — хорошее
перемешивание культуры в ферментере. Система непрерывного
культивирования может быть реализована по принципу турбидо-
стата или хемостата. Турбидостат — наиболее простой режим
проточного культивирования, концентрация клеток в нем выбира-
ется исследователем, а поступление питательных компонентов ав-
томатически реализуется в соответствии с плотностью популяции.
Меняя скорость подачи питательной среды («скорость разбавле-
ния»), экспериментатор может получать разные значения скоро-
сти роста популяции — от близких к нулю до максимальной, та-
ким образом воспроизводя разные состояния культуры от стацио-
нарной фазы до стадии .экспоненциального роста.
Для непрерывного культивирования микроорганизмов может
быть использован слегка модифицированный ферментер, применя-
емый при периодическом культивировании (рис. 37). В первом
случае требуется система двойного насоса (для добавления
свежей среды и удаления культуральной жидкости), используе-
мая вместе с регулятором уровня среды; при этом культуральная
жидкость удаляется через отверстия для отбора проб. Такие на-
сосы необходимы при проточном культивировании в больших ем-
костях. В малых ферментерах удаление жидкости может происхо-
64
дить через боковую отводную трубку, расположенную на уровне,
позволяющем поддерживать определенный объем культуры. Ма-
лые ферментеры с боковым отводом жидкости можно изготовить
из стандартных стеклянных или стальных сосудов.
4.3. ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами
является правильное поддержание их с целью сохранения не
только жизнеспособности клеток, но и таксономических, а также
любых других, важных для исследователя .свойств. Общего ме-
тода, одинаково пригодного для хранения многочисленных и
разнообразных групп микроорганизмов, пока не существует. Поэ-
тому в крупных коллекциях разные группы микроорганизмов со-
храняются различными методами. Кроме того, чтобы исключить
возможность потери микроорганизма, каждый штамм сохраняется
не одним, а несколькими способами.
К числу наиболее распространенных способов хранения микро-
организмов относятся периодические пересевы на свежие пита-
тельные среды, сохранение культур на питательной среде под ва-
зелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном со-
стоянии. Значительно реже микроорганизмы сохраняют при низ-
ких или сверхнизких температурах, в дистиллированной воде или
1%-ном растворе хлористого натрия, на адсорбентах в высушен-
ном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от це-
лей, для которых используются микроорганизмы, а также от
имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.
Периодические пересевы на питательные среды. Этот способ
был одним из первых приемов длительного сохранения микроор-
ганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени ши-
роко используется в практике микробиологических работ. Аэроб-
ные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхность ско-
шенной агаризованной среды, микроаэрофилы — в полужидкую
среду, содержащую 0,2—0,3% агара, анаэробы — в толщу плот-
ной среды или в жидкую среду. Культуры пересевают на свежие
среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем из одной пробирки
микроорганизмы используют для работы, культуру во второй про-
бирке оставляют для сохранения и последующего пересева.
Частота пересева на свежую среду различных микроорганиз-
мов неодинакова и в большой степени определяется их свойства-
ми. Многие микроорганизмы можно пересевать один раз в 1—2
месяца, хотя есть микроорганизмы, например молочнокислые бак-
терии, которые нуждаются в более частых пересевах. Допусти-
мые сроки пересевов некоторых микроорганизмов приведены в
Приложении. Хранение культур в холодильнике при 4—6° позво-
ляет увеличить время между пересевами.
Поддержание культур микроорганизмов регулярными пересе-
вами имеет ряд существенных недостатков1. Основной из них —
возможная утрата некоторых морфологических и физиологичес-
65
них признаков. Кроме того, частые пересевы нередко снижают
биохимическую активность культур, повышают опасность инфици-
рования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересе-
вах, особенно на жидкие среды, велика вероятность возникнове-
ния спонтанных мутантов и их селекция.
Хранение под минеральным маслом. Хранение под минераль-
ным маслом широко используется для бактерий и микроскопичес-
ких грибов. Этот метод обеспечивает довольно длительное сохра-
нение жизнеспособности и стабильности таксономических и дру-
гих признаков у микроорганизмов различных систематических
групп. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет про-
цессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересе-
вами,
Микроорганизмы выращивают на благоприятной агаризован-
ной питательной среде; аэробные микроорганизмы — на поверх-
ности коротко скошенной (под углом 45°) среды, микроаэрофилы
и факультативные анаэробы — в полужидкой среде, анаэробы —
в толще среды (посев уколом или в расплавленную среду с пере-
мешиванием). После того как культуры хорошо разовьются, их
заливают маслом. Как правило, аспорогенные бактерии заливают
через 2—7 суток после посева в зависимости от скорости роста
микроорганизма, бациллы и актинонимицеты — в стадии сформи-
ровавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать
маслом через 4—10, мицелиальные грибы — через 7—12 суток.
Наиболее пригодно для заливки культур микроорганизмов вы-
сокоочищенное медицинское вазелиновое масло с плотностью
0,8—0,9. Предварительно масло стерилизуют 1 ч в автоклаве при
121° (1 ати), а затем для удаления влаги прогревают в течение
1 ч в сушильном шкафу при температуре не выше 150° или ос-
тавляют на двое—трое суток при комнатной температуре. Куль-
туры заливают маслом так, чтобы слой его не превышал 1 см над
средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при
комнатной температуре либо в холодильнике при 4—6°.
Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив
излишек масла проведением петли по стенке пробирки, перено-
сят на свежую питательную среду,
среду того же состава, на которой
микроорганизмы в первом пассаже
развиваются медленнее, однако при
рость роста их восстанавливается.
Рекомендуется использовать
культуру хранили. Многие
после хранения под маслом
последующих пересевах ско-
Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым маслом
прост, удобен в обращении, может быть использован в любой ла-
боратории. К недостаткам его можно отнести возможность инфи-
цирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания
масла при обжигании петли, а также необходимость специальной
очистки посуды от масла.
Хранение в лиофилизированном состоянии. Хранение лиофиль-
но-высушенных клеток — широко распространенный метод дли-
66
тельного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют
процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Лио-
фильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под
вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение 10—20 и
более лет сохранить без заметных изменений жизнеспособность,
морфологические, культуральные, физиологические свойства, а
также биохимическую активность клеток.
Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращивают в
оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или
окончания формирования покоящихся форм. Затем клетки или
соответственно покоящиеся формы суспендируют в специальных
жидкостях, получивших название защитных сред. В состав защит-
ных сред входят различные вещества, которые предохраняют
клетки от повреждений в период замораживания и высушивания.
Ниже приведены рецепты некоторых защитных сред, используе-
мых для лиофилизации клеток различных микроорганизмов:
1. Желатина — 1 г;
сахароза — 10 г;
вода дистиллированная — 100 мл.
2. Молоко обезжиренное — 100 мл;
глюкоза — 7 г.
3. Молоко обезжиренное — 100 мл;
NH4C1 — 0,5 г;
аскорбиновая кислота — 0,5 г;
тиомочевина — 0,5 г.
4. Лошадиная сыворотка — 75 мл;
доясной бульон — 25 мл;
глюкоза — 7,5 г.
Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде дол-
жна быть как можно более высокой — 109—1010 клеток в 1 мл.
Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального
стекла по 0,5—1,0 мл, замораживают при температуре от —20 до
—70°, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная
влажность лиофилизированных клеток колеблется от 1 до 6% и
определяется составом защитной среды и режимом высушивания.
В различных лабораториях режимы замораживания и высушива-
ния заметно варьируются и во многом зависят от имеющегося
оборудования. Ампулы с лиофильно-высушенными клетками реко-
мендуется сохранять в темноте при температуре 4—6°. Хранение
при более высокой температуре, особенно превышающей 25—30°,
заметно снижает выживаемость клеток.
Для реактивации к лиофилизированным клеткам добавляют по
каплям стерильную дистиллированную или водопроводную воду в
количестве 0,5—1,0 мл. После регидратации клетки высевают на
богатые питательные среды.
Лиофилизацию широко применяют для длительного хранения
различных микроорганизмов. Тем не менее этот метод нельзя
67
считать универсальным. Следует отметить, что к лиофилизации
•более устойчивы грамположительные, чем грамотрицательные бак-
терии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные
бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы. Выживае-
мость спор после лиофилизации заметно выше, чем вегетативных
клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов
Pichia и Hansenula выдерживают лиофилизацию лучше, чем сла-
боспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрож-
жей родов Saccharomyces, KJ.uyverom.yces, Rhodotorula.
Хранение при низких и сверхнизких температурах. Хранение
микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверх-
низких температурах по сравнению с другими методами характе-
ризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод тре-
бует специального оборудования и большой осторожности в рабо-
те с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения
микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию.
Клетки замораживают при разных температурах (от —10 до
—196°) и различных скоростях замораживания. Для защиты от
повреждающего действия низких температур клетки предвари-
тельно суспендируют в растворах криопротекторов. Чаще других
применяют 10—20%-ный раствор глицерина, 7—10%-ный раствор
диметилсульфоксида (СН3—S—СН3) или 20%-ный раст-
II
О
вор сахарозы. Суспензию клеток с высокой плотностью (109—1010
клеток в 1 мл) разливают в ампулы или флаконы с завинчиваю-
щейся крышкой. Ампулы запаивают и помещают в холодильник с
температурой —70°, а затем переносят в жидкий азот, где и со-
храняют при —196°. Оттаивание замороженных клеток должно
быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружают на
2 мин в водяную баню с температурой 35—45°. Клетки из ампул
высеивают на богатые питательные среды.
При температуре хранения от —20 до —40° хорошо выживают
немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение
при —70° в твердой углекислоте и особенно в условиях сверхниз-
ких температур: при —196° (жидкий азот) или при —210° (газо-
вая фаза жидкого азота).
Хранение в глицероле. Одним из самых удобных методов хра-
нения микроорганизмов является их содержание при низких тем-
пературах (—20°) в растворах глицерола, который служит крио;
протектором. Данный способ широко распространен, однако не все
микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому счита-
ется, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле,
необходимы предварительные эксперименты по определению сте-
пени выживаемости их. Наибольшее распространение этот способ
консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий
различных спор.
68
Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%-ный
раствор глицерола в дистиллированной воде и стерилизуют его
при 1 ати в течение 30 мин. Клетки из выросших культур (обыч-
но из середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные
для хранения, смешивают в пропорции 1:1 с 50%-ным глицеро-
лом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии
удобно в стерильных пробирках Эппендорф, а для их приготовле-
ния использовать автоматические пипетки со стерильными нако-
нечниками и готовить смеси в ламинарном шкафу. Из сохраняе-
мых клеток периодически (2—6 раз в год) отбирают пробы для
проверки на выживаемость. В зависимости от результатов провер-
ки рассчитывают схемы консервации той или иной культуры и
периодичности их пересева.
Для культур микроорганизмов с твердых сред перед смеши-
ванием с глицеролом готовят суспензии в жидкой среде или в оп-
тимальном для хранения буферном растворе (проверяется экспе-
риментально). Можно также суспендировать клетки с твердых
сред непосредственно в 25%-ном стерильном глицероле.
Хранение в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хло-
рида натрия. Хранение микроорганизмов в дистиллированной воде
или в 1%-ном растворе NaCl не требует специального оборудова-
ния и доступно любому экспериментатору. Допустимые сроки
хранения некоторых микроорганизмов этими методами приведены
в табл. 8.
Микроорганизмы предварительно выращивают в оптимальных
условиях, после чего клетки суспендируют в дистиллированной
воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Успешному сохране-
нию клеток способствует высокая плотность суспензии — не ме-
нее 108—109 клеток
В 1 МЛ. Суспензию Таблица 8 разливают В сте- Допустимые сроки хранения (месяцы) г микроорганизмов в дистиллированной воде рильные Пробирки и 1%-ном растворе NaCl
или флаконы и со- храняют в холо- ,« г Микроорганизмы дильнике или при Дистилли- рованная вода* 1 %-ный раствор NaCl
туре. Оставлять на Achromobacter хранение рекомен- liquefaciens r Escherichia coll Дуется клетки на- Gluconobacter oxydans чала стационарной Bacillus subtilis г Micrococcus aurantiacus фазы роста куль- Pseudomonas aeruginosa туры или сформи- Micrococcus luteus r Serratia marcescens ровавшиеся покоя- щиеся формы — ... т * Микроорганизмы со споры, ЦИСТЫ. при 4—6 °C. 6 12 12 12 12 6 6 12 храняют в > 6 12 6 12 12 6 6 12 [олодильнике
69
Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах. Этот метод
применяют главным образом для актиномицетов, микроскопичес-
ких грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качест-
ве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагель,
вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техни-
ки этот способ не имеет. В самом общем виде он сводится к то-
му, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают
с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при
комнатной температуре. Затем ампулы запаивают и хранят при
комнатной температуре или в холодильнике. Имеются данные, что
у актиномицетов после хранения в почве или в кварцевом песке
восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окрас-
ка воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены
в процессе длительного культивирования в лаборатории.
Оценка жизнеспособности микроорганизмов после длительного
хранения. Жизнеспособность микроорганизмов после различных
сроков хранения определяют путем высева их на богатые пита-
тельные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Про-
цент выживаемости микроорганизмов определяют по отношению
числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспо-
собных клеток (до начала хранения), принятому за 100%.
ГЛАВА 5
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
МИКРООРГАНИЗМОВ
Физиологию, биохимические свойства, циклы развития микро-
организмов исследуют, как правило, при работе с чистыми куль-
турами. Чистой, или аксенической, культурой называют такую
культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Уме-
ние выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популя-
ции, существующей в природе, и поддерживать чистоту культу-
ры — необходимое условие работы с микроорганизмами. Выделе-
ние чистой культуры обычно включает три этапа: получение на-
копительной культуры; выделение чистой культуры; определение
чистоты выделенной культуры.
5.1. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ
Накопительной называют такую культуру, в которой преобла-
дают представители одной физиологической группы или даже од-
ного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был
введен в практику микробиологических исследований С. Н. Вино-
градским и М. Бейеринком. Сущность его заключается в создании
элективных, т. е. избирательных условий, которые обеспечивают
преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или груп-
пы микроорганизмов из смешанной популяции.
При создании элективных условий необходимо знать физиоло-
гию или четко представлять те особенности, которыми должны
обладать выделяемые микроорганизмы. Элективные условия соз-
дают чаще всего, подбирая соответствующие среды, поскольку
различные микроорганизмы для своего развития предъявляют не-
одинаковые требования к источникам питания. Например, микро-
организмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут
расти в среде, из состава которой исключены связанные формы
азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного раз-
нообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь
будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры ав-
тотрофных микроорганизмов получают на средах, где единствен-
ным источником углерода служит углекислота. Отсутствие в среде
других соединений углерода задерживает развитие гетеротрофов.
Такие специфические питательные среды, удовлетворяющие пот-
ребности преимущественно одной группы микроорганизмов, носят
название элективных. В зарубежной литературе большее распро-
странение получили термины «накопительные» или «селективные»
среды.
71
Накопительные культуры микроорганизмов, обладающих высо-
кой требовательностью к составу питательных сред, получают
иначе. При их выделении используется неодинаковая чувстви-
тельность клеток смешанной популяции к продуктам обмена ве-
ществ, накапливающимся в среде. Примером могут служить мо-
лочнокислые бактерии, для накопления которых используют соло-
довое сусло без мела, т. е. среду, первоначально не обладающую
элективностью. После внесения природного материала, содержа-
щего молочнокислые бактерии, в среде вначале наряду с молоч-
нокислыми бактериями хорошо развиваются представители родов
Enterobacter и Escherichia. Однако по мере накопления в среде
молочной кислоты и этилового спирта, образуемого гетерофер-
ментативными видами, условия для развития энтеробактерий и
эшерихий постепенно ухудшаются, тогда как молочнокислые бак-
терии, которым свойственна высокая кислото- и спиртоустойчи-
вость, продолжают расти. Таким образом, в результате развития
молочнокислых бактерий среда приобретает необходимую степень,
элективности, что и обеспечивает получение накопительной куль-
туры этих бактерий. Другим примером могут служить уксусно-
кислые бактерии, которые характеризуются высокой устойчиво-
стью к этиловому спирту. Накопление этих бактерий осуществля-
ют на сусле, к которому добавляют 4—5% этанола.
Иногда при выделении микроорганизмов из природных попу-
ляций в среду включают антибиотики, которые отличаются спе-
цифичностью действия и позволяют избирательно подавить рост
определенной группы микроорганизмов. Так, элективные условия
для развития грамотрицательных бактерий можно создавать вне-
сением в среду пенициллина в концентрации от 0,2 до 100 мг/л,
поскольку многие виды грамположительных бактерий при этом
или совсем не развиваются, или развиваются медленно. Чтобы
создать благоприятные условия для развития бактерий и, напро-
тив, подавить рост мицелиальных грибов, к средам рекомендуют
добавлять нистатин в концентрации от 0,1 до 20 мг/л или гризео-
фульвин в концентрации от 1 до 20 мг/л.
При создании элективных условий следует учитывать неодина-
ковое отношение различных микроорганизмов к аэрации, темпе-
ратуре, кислотности среды и т. д. Поэтому при получении накопи-
тельной культуры аэробных микроорганизмов обеспечивают боль-
шую поверхность контакта среды с воздухом, а для обогащения
среды анаэробными микроорганизмами тем или иным способом
создают анаэробные условия. Культивирование при высокой тем-
пературе (50° и выше) исключает развитие мезофильных микро-
организмов и обеспечивает рост термофилов. Селективным факто-
ром может служить также неодинаковая скорость роста различ-
ных микроорганизмов при данной температуре. Например, на ми-
неральной среде при освещении и температуре 35° удается почти
полностью подавить рост зеленых водорослей и получить культу-
ру, обогащенную цианобактериями.
72
При получении накопительных культур следует учитывать и та-
кие особенности микроорганизмов, как способность к образованию
эндоспор. Для накопления спорообразующих бактерий среды ино-
кулируют, как правило, субстратом, который предварительно пас-
теризуют, т. е. кратковременно прогревают при высокой темпера-
туре (10 мин при 75° или 2—5 мин при 80°). Таким образом
можно полностью или почти полностью исключить развитие бак-
терий, не образующих споры.
Следует иметь в виду, что элективные условия далеко не всег-
да оптимальны для роста выделяемых микроорганизмов, однако
они лучше переносятся ими, чем сопутствующими формами.
О получении накопительной культуры судят по появлению ха-
рактерных признаков развития выделяемых микроорганизмов —
помутнение среды, иногда сопровождаемое пигментацией, появле-
ние пленки, осадка, выделение газов. Помимо визуального наблю-
дения накопительную культуру микроскоцируют и выявляют при-
сутствие желаемых форм. Иногда необходимо определить продук-
ты метаболизма, образование которых свойственно выделяемым
микроорганизмам. Например, о развитии нитрифицирующих бак-
терий свидетельствует появление в среде нитрит- и нитрат-ионов
и уменьшение или даже полное исчезновение иона аммония.
Основные условия элективности, позволяющие получить нако-
пительные культуры микроорганизмов с разным типом обмена ве-
ществ, суммированы в табл. 9.
5.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
После того как получена накопительная, приступают к выделе-
нию чистой культуры. Чистая культура может быть получена из
отдельной колонии или одной клетки.
5.2.1. Выделение чистой культуры из отдельной колонии
Основным методом выделения чистых культур микроорганиз-
мов является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его за-
ключается в получении чистой культуры из отдельной колонии.
Однако этот метод неприменим для выделения микроорганизмов,
которые не растут или плохо растут на плотных средах. К числу
таких микроорганизмов относятся некоторые бактерии, многие
водоросли и простейшие.
При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов
накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды.
Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной
бане стерильную питательную среду, содержащую агар или жела-
тину, разливают в стерильные чашки Петри. После того как сре-
да застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю нако-
пительной культуры или ее разведения в стерильной воде и сте-
рильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют кап-
лю сначала по одной половине поверхности среды в чашке Петри,
73
м Та 6лиц а 9
Основные факторы, определяющие получение накопительных культур
некоторых групп бактерий (по Стейниеру Р. и др., 1979)
Хемогетеротрофные бактерии
предпочтительно
> несбраживаемый
субстрат
N2 — единственный
источник азота
—> аэробные азогфик-
саторы, например
Azotobacter
—► соединения азота
—> аэробы, например
Pseudomonas
-> аэробные условия
-> NO3 как
Органические суб-
страты, отсутствие
света
предпочтительно
—> несбраживаемый
субстрат
SO^ акцепторы
—> СО2 электронов
денитрифицирующие
бактерии
—> десульфат ирующие
бактерии
_> метаиобразующие
бактерии
—> анаэробные условия
—> сбраживаемый
сахар
—>N2 — единственный
источник азота
—►соединения азота
Clostridium
—► pasteunanum
и родственные виды
бактерии, осуще-
—> ствляющие броже-
ние, например
Enterobacter
V»
Окончание табл. 9
Хемоавтотрофные бактерии
окисляемые
субстраты
Отсутствие в среде органичес- ких соединений у аэробные условия (кислород как акцептор электронов) cl-п +* 1« Q Зм О V5 сч Z 2 с/) X t t t t
? анаэробные условия (NO^“ как акцептор электронов) -» s,s2o|-
Фототрофные микроорганизмы
-> аэробные условия ~’’„вует^
Свет как
источник —
энергии
СО2 — единствен- —
ный источник
углерода
. анаэробные усло-
вия
> Nitrosomonas
* Nltrobacter
Thiobacillus
+ водородные бактерии
+ Thiobacillus denitrificans
N2 — единственный цианобактерии
источник азота
—> связанный азот
—> водоросли
—> низкая концепт- зеленые серобакте-
> сульфид присут-___ рация рии
ствует
—> высокая концентра- —> пурпурные серобак-
ция терии
-* органические соединения *** анаэробные условия —* пурпурные несерные бактерии
Рис 40. Рассев культуры микроорганизмов на поверхность плот-
ной среды шпателем:
Л — шпатель Дригальского; Б — рассев; В — рост микроор-
ганизмов после рассева
затем по второй половине, после чего этим же шпателем протира-
ют поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й
чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюда-
ют сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих —
изолированные колонии (рис. 40). Рассевать накопительную куль-
туру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае
накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей ина
поверхности .плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как
указано на рис. 41. Перед каждым новым штрихом петлю стери-
лизуют в пламени горелки.
После посева чашки помещают в термостат крышками вниз,
чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки
Петри при застывании агара, не помешала получить изолирован-
ные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1—7
суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Вырос-
Рис. 41. Схема рассева культуры микроорганизмов на поверхность
плотной среды петлей
76
щие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность ско-
шенной плотной среды в пробирки или в жидкую среду.
Изолированные колонии аэротолерантных микроорганизмов и
факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного
досева. Для этого плотную питательную среду предварительно
разливают в пробирки по 15—20 мл и стерилизуют. Непосредст-
венно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную ба-
ню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений на-
копительной культуры в стерильной водопроводной воде. Разведе-
ния готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5—1,0 мл раз-
ведения получить изолированные колонии. Степень разведения оп-
ределяется плотностью накопительной культуры. Высевы делают,
как правило, из трех-четырех последних разведений. Для этого в
пробирку с расплавленной и остуженной до 48—50°агаризованной
средой вносят 0,5—1,0 мл одного из разведений накопительной
культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая
пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки выни-
мают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени го-
релки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри.
После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри по-
мещают в термостат. Колонии, выросшие в ,толще среды, выреза-
ют стерильным скальпелем или извлекают стерильными капил-
лярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую сре-
ду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.
Особые трудности возникают при выделении чистых культур
облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом
не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на по-
верхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас
помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом раз-
ведения. Сущность его заключается в том, что разведения накопи-
тельной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до
45—50° агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последо-
вательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаж-
дают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина
и вазелинового масла (соотношение 3:1), что препятствует про-
никновению воздуха в толщу агаризованной среды.
Иногда агаризованную питательную среду после посева и тща-
тельного перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри.
Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые
набирают соответствующее разведение накопительной культуры в
расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилля-
ра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной
культуры в одной из пробирок (пипеток Пастера, трубок Бурри)
вырастают изолированные колонии. Чтобы извлечь образовавши-
77
еся колонии, поступают следующим образом. Удаляют стериль-
ной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик ага-
ризованной среды осторожно выдувают из пробирки в стериль-
ную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислорода, че-
рез капилляр, который помещают между стенкой пробирки и ага-
ризованной средой. Агаризованную среду из трубки Бурри выду-
вают, пропуская газ через ватную пробку.
Иногда плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробир-
ку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем
горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке,
плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика лег-
ко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара раз-
резают стерильным ланцетом и извлекают колонии,
их стерильными
также вырезать
3
2
Рис. 42. Изолиро-
ванные колонии об-
лигатных анаэро-
бов в пробирках,
заполненных газом
(по Хангейту):
1 — агаризоваиная
питательная сре-
да; 2 — конденса-
ционная вода; 3 —
смесь газов Н2 н
СО2; 4 — колонии
бактерий
захватывая
капиллярными трубками или петлей. Можно
их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии
переносят в жидкую среду, благоприятную для
развития выделяемых микроорганизмов. Если
изолированные колонии получены в капилляре,
то после тщательной дезинфекции поверхности
его разламывают стерильным пинцетом и уча-
стки капилляра, содержащие изолированные
колонии, переносят в стерильную среду.
Для получения изолированных колоний ме-
тодом глубинного посева и методом разведений
рекомендуется использовать осветленные пита-
тельные среды.
Когда хотят получить изолированные колонии
облигатных анаэробных бактерий, характери-
зующихся особенно высокой чувствительностью
к кислороду (экстремальные анаэробы)', исполь-
зуют метод вращающихся пробирок Хангейта.
Сущность этого метода заключается в следую-
щем. Расплавленную агаризованную среду за-
севают бактериями при постоянном токе через
пробирку инертного газа, освобожденного от
примеси кислорода. Затем пробирку закрывают
резиновой пробкой и помещают горизонтально
в зажим, вращающий пробирку. Агаризоваиная
среда при этом равномерно распределяется по
стенкам пробирки и застывает тонким слоем.
Применение тонкого слоя агаризованной среды в
пробирке, заполненной газовой смесью, позволя-
ет получить изолированные колонии, хорошо
видимые невооруженным глазом (рис. 42).
В некоторых случаях бывает достаточно од-
ного посева в плотную среду, чтобы получить
чистую культуру. Однако чаще посев в плотную
питательную среду повторяют 2—3 раза. В каче-
78
стве посевного материала при этом используют культуру, получен-
ную из отдельной колонии.
5.2.2. Выделение чистой культуры из одной клетки
Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельный
методом, с помощью микроманипулятора или микроселектора.
Капельный метод Линднера используют при работе с крупны-
ми микроорганизмами: дрожжами, мицелиальными грибами, во-
дорослями. Порядок работы следующий. Накопительную культуру
разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в неболь-
шой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Затем на по-
верхность стерильного покровного стекла стерильным стальным
пером наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят
препарат «висячая капля». Нанесенные на покровное стекло кап-
ли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых об-
наружена только одна клетка. После этого препарат помещают в
термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка
Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Черев
12—24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в
которых наблюдается образование микроколоний, осторожно сни-
мают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной
бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.
Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора.
Микроманипулятор — прибор, позволяющий с помощью специ-
альной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку ив
суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. Микро-
манипулятор имеет два операционных штатива, между которыми
расположен обычный микроскоп. На предметном столике микро-
скопа установлена влажная камера, в которую помещают препа-
рат «висячая капля». В держателях операционных штативов за-
креплены микропипетки (микропетли), перемещение которых в
поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью
благодаря системе винтов и рычагов. Микропипетки вводят во
влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в ви-
сячей капле. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает от-
дельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со
стерильной жидкой средой.
Выделение отдельных клеток с помощью микроселектора Пер-
фильева. Наиболее существенной частью микроселектора Пер-
фильева является стеклянный микрокапилляр, имеющий строго
прямоугольное сечение. Благодаря этому канал капилляра хоро-
шо просматривается даже с иммерсионным объективом. Стериль-
ный капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток в агари-
зованной питательной среде и при большом увеличении микроско-
па находят участок с одной клеткой. Специальным приспособле-
нием этот участок капилляра стерильно выбивают в приемник, и»
которого затем переносят в стерильную среду. Микроселектор
7»
Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так
и мелких микроорганизмов.
5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ
Чистота выделенной культуры микроорганизмов должна быть
тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими
способами: визуальным, микроскопическим контролем и высевом
на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматри-
вается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошен-
ной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, куль-
тура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур,
способных расти на поверхности плотных сред.
Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контро-
лировать под микроскопом. Для этого следует приготовить препа-
рат фиксированных окрашенных клеток и просмотреть его с им-
мерсионной системой или препарат живых клеток и просмотреть
его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая культура
многих микроорганизмов, как правило, морфологически однород-
на; допустимо лишь незначительное варьирование размеров кле-
ток. Однако необходимо помнить, что клетки некоторых бактерий,
например, микобактерий, нокардий и др., очень полиморфны, поэ-
тому определение чистоты таких культур при микроскопировании
вызывает некоторые затруднения. Чистоту культур микроорганиз-
мов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Пре-
жде всего выделенную культуру высевают на питательную среду,
благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний —
свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на мясо-пеп-
тонный агар — среду, которая обеспечивает рост многих хемоге-
теротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность
выросших колоний или отсутствие роста, если данные микроорга-
низмы на мясо-пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в
виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганиз-
мов нельзя сделать только по результатам высева на МПА. Осо-
бенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также пред-
ставителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или
несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганиз-
мов проверяют высевом еще на ряд сред — сусло, мясо-пептон-
ный бульон, картофельный агар и др. Набор сред и их состав оп-
ределяются особенностями метаболизма выделенных микроорга-
низмов, а также их возможных спутников.
ГЛАВА 6
МОРФОЛОГИЯ и цитология
МИКРООРГАНИЗМОВ
6 1. микроскопия
Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов,
величина которых измеряется в большинстве случаев микромет-
рами (мкм=0,001 мм=10-6 м), возможно только с помощью
микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов
в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная
микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе форми-
руется вследствие того, что объект и различные элементы его
структуры избирательно поглощают свет с различной длиной
волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы
световой волны при прохождении света через объект (фазовый
контраст). Световая микроскопия включает обычную просвечи-
вающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-кон-
трастную и люминесцентную.
6.1.1. Светлопольная микроскопия
Существуют различные модели учебных и исследовательских
световых микроскопов. Внешний вид и принципиальное устрой-
ство одного из них (микроскоп биологический рабочий, МБР-1)
приведены на рисунке 43. Подобные микроскопы позволяют оп-
ределить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвиж-
ность, степень морфологической гетерогенности, а также харак-
терную для микроорганизмов способность к дифференцирующему
окрашиванию. Рассмотрим некоторые особенности оптической
системы светового микроскопа на примере МБР-1, так как от зна-
ния их зависит успех наблюдения объекта и надежность получа-
емых результатов.
Оптическая часть микроскопа включает осветительный аппарат,
объектив и окуляр.
Осветительный аппарат состоит из зеркала и конден-
сора и предназначен для наилучшего освещения препарата. Регу-
лируемое зеркало укреплено у основания штатива и имеет две
стороны: вогнутую и плоскую. Вогнутое зеркало собирает и кон-
центрирует в плоскости препарата пучок лучей, идущих от источ-
ника света, поэтому им пользуются только в тех случаях, когда
работают без конденсора, т. е. с очень малыми увеличениями.
При работе с конденсором, который рассчитан на использование
81
Рис. 43. Микроскоп МБР-1:
1 — подковообразное основание микроскопа; 2 — предметный
столик; 3 — винты для перемещения предметного столика; 4 —
клеммы, прижимающие препарат; 5 — конденсор; 6 — крон-
штейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор в гиль-
зе; 8 — рукоятка перемещения конденсора; 9 — рукоятка ири-
совой диафрагмы конденсора; 10 — зеркало; И — тубусо-
держагель; 12 — рукоятка макрометрического винта; 13 — ру-
коятка микрометрического винта; 14 — револьвер; 15 — объ-
ективы; 16 — наклонный тубус; 17 — виит для крепления ту-
буса; 18 — окуляр
параллельных лучей, следует пользоваться только плоской сторо-
ной зеркала. Конденсор, укрепленный непосредственно над зер-
калом, состоит из нескольких линз и предназначен для собирания
параллельных лучей света, идущих от источника света и отражен-
ных плоским зеркалом, в одной точке — фокусе, который должен
находиться в плоскости препарата. В конденсор вмонтирована ири-
совая (апертурная) диафрагма, позволяющая задерживать из-
82
лишние лучи света и регулировать апертуру (см. ниже) конденсо-
ра. Под конденсором находится откидная оправа для свето^
фильтра.
Объектив представляет собой наиболее важную часть
микроскопа. Он дает действительное увеличенное и обратное изо-
бражение изучаемого объекта. Объектив состоит из системылинз,
заключенных в металлическую оправу. Самая главная — наруж-
ная (фронтальная) линза, от фокусного расстояния которой зави-
сит увеличение объектива. Чем больше кривизна фронтальной
линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение
объектива. Увеличение объектива всегда обозначено на его опра-
ве. От увеличения объектива зависят еще две его характеристи-
ки — рабочее расстояние, т. е. расстояние от фронтальной линзы
до плоскости препарата при сфокусированном объекте, и пло-
щадь поля зрения. Чем больше увеличение объектива, тем мень-
ше его рабочее расстояние и поле зрения (табл. .10).
Таблица 10
Оптические данные объективов микроскопа МБР-1
Система Собст- венное увели- чение Число- вая апер- тура Фокус- ное рас- стояние, мм Свобод- ное ра- бочее расстоя- ние, мм
Сухая 8Х 0,20 18,2 8,53
Сухая 40Х 0,65 4,3 0,40
Масляная иммерсия 90Х 1,25 1,9 0,10
Микроскопы имеют сухие объективы для наблюдения живых
микроорганизмов, а также для поиска нужного поля зрения, даю-
щие увеличение в 8 (10) и 40 раз, и иммерсионные, увеличиваю-
щие объект в 90 (100 раз) и позволяющие провести более деталь-
ное изучение формы и строения микроорганизмов.
Окуляр содержит две линзы — глазную (верхнюю) и соби-
рательную и служит для рассмотрения изображения предмета,
даваемого объективом, т. е. выполняют роль лупы. Окуляры мо-
гут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано .на
их оправе, например 15Х- Общее увеличение окуляра повышает-
ся с уменьшением фокусного расстояния линз, его составляющих,
поэтому более сильные окуляры будут короткими, а более сла-
бые — длинными.
Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведе-
нием увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, напри-
мер, использование окуляра 15Х и объектива 90Х позволяет уве-
личить объект в 1350 раз. Однако общее увеличение еще не ха-
рактеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изобра-
жение может оказаться как четким, так и нечетким.
83
Отчетливость получаемого изображения определяется разре-
шающей способностью микроскопа, которая зависит от длины
волны используемого света и числовой апертуры оптической сис-
темы микроскопа. Разрешающая способность связана обратной
связью с пределом разрешения — минимальным расстоянием
между двумя точками, при котором еще можно различить каж-
дую из них. Предел разрешения определяется следующим обра-
зом:
d =,
где d — минимальное расстояние между двумя точками; Л1 —
числовая апертура объектива; А2 — числовая апертура конденсо-
ра; X — длина волны используемого света. Числовая аперту-
ра определяется произведением синуса половины (и) отверстного
угла (а) на показатель преломления (п) среды, граничащей с
линзой (рис. 44): А~п- sin и. Иными словами, числовая аперту-
ра — это оптический «охват» линзы, она является мерой количе-
ства света, попадающего в линзу. Использование объективов с
большой апертурой и коротковолнового света позволяет увидеть
структурную организацию клетки и даже крупные вирусы.
Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом, не
может быть больше 1, так кдк показатель преломления воздуха
равен 1, а угол и (см. рис. 44) не может быть больше 90° (т. е.
sinu^l). В микроскопе МБР-1 объектив 40Х имеет апертуру
0,65, а конденсор — примерно 1. Таким образом, при использова-
нии объектива 40Х и зеленого света с длиной волны 550 нм
(0,55 мкм) предел разрешения составляет 0,33 мкм. Повысить
разрешающую способность можно двумя путями: либо освещать
объект более короткими лучами света, например ультрафиолетом,
что требует применения дорогостоящей кварцевой оптики, либо
увеличивать показатель преломления среды, граничащей с лин-
зой, с тем, чтобы приблизить его к показателю преломления стек-
ла, на котором находится объект
(п стекла =1,5). Для этого меж-
ду фронтальной линзой объектива
и исследуемым объектом по-
мещают каплю жидкости с пока-
зателем преломления большим,
чем показатель преломления
воздуха, например, каплю воды
(п — 1,3), глицерина (п = 1,4)
или кедрового (иммерсионного)
масла (п = 1,5). Для каждой
указанной жидкости выпускают
специальные объективы, которые
называются иммерсионными.
Числовая апертура этих объекти-
Рис. 44. Схема хода лучей при разной
величине угла а:
А — объект; О — объектив; а — от-
верстный угол; и — половина отвер-
стного угла
84
bob возрастает благодаря увели-
чению как значения п, так и
sin и (рис. 45).
Числовая апертура объектива
указана на его оправе. Объек-
тивы микроскопа МБР = 18Х и
40Х имеют апептуру соответст-
венно 0,20 и 0,65. У масляного
иммерсионного объектива с уве-
личением 90Х апертура 1,25.
На оправе этого объектива на-
несено также обозначение «МИ»
— масляная иммерсия-—и чер-
ное кольцо. На оправе объектива
водной иммерсии имеется обозпа-
Рис. 45. Влияние иммерсионного
масла на ход лучей в микроскопе:
1 — объектив; 2 — предметное
стекло; 3 — объект; 4 — иммер-
сионное масло; 5 — лучи света;
6 — фронтальная линза объектива
чение «ВИ» — водная иммерсия —
и белое кольцо. Этот объектив увеличивает в 70 раз (70Х)' и
имеет апертуру 1,23.
Апертура конденсора должна соответствовать числовой апер-
туре объектива. Когда она меньше апертуры объектива, оптичес-
кие возможности линзы последнего не будут использованы пол-
ностью из-за слабости попадающего в нее светового потока. Если
апертура конденсора больше апертуры объектива (что, в частно-
сти, бывает при работе с сухими системами), то необходимо нес-
колько прикрыть ирисовую диафрагму конденсора. Это приведет
к устранению рассеянного света и даст нужную контрастность изо-
бражения (рис. 46). Неиммергированный конденсор микроскопа
Рис. 46. Соотношение между увеличением объектива, рабочим рас-
стоянием объектива и степенью раскрытия ирисовой диафрагмы кон-
денсора
85
МБР-1 имеет апертуру не более 0,95. Помещая иммерсионное мас-
ло между верхней линзой конденсора и нижней поверхностью
предметного стекла, повышают апертуру конденсора до 1,2.
В работе со световым микроскопом следует помнить, что чет-
кое изображение получается при хорошем освещении; однако диа-
фрагмирование конденсора дает эффект контрастирования жи-
вых объектов. Препарат должен быть частью однородной опти-
ческой системы, что достигается заливкой объекта водой, маслом
или другой подходящей жидкостью. В случае необходимости на-
блюдения объекта через дно чашки Петри лучше использовать
вогнутое зеркало, устраняя эффекты искажения, вызванные не-
ровностью поверхности чашки, с помощью капли иммерсионного
масла, накрытой покровным стеклом.
ПОРЯДОК РАБОТЫ СО СВЕТЛОПОЛЬНЫМ микроскопом
Установка света по Кёлеру. Хорошие результаты при работе
с микроскопом могут быть получены только при условии правиль-
ного освещения объекта. Лучший способ освещения основан на
системе Кёлера. Установку света выполняют в такой последова-
тельности.
1. Предварительная подготовка. Устанавливают микроскоп и
осветитель на крестовину, что обеспечивает необходимое расстоя-
ние между источником света и зеркалом микроскопа. На пред-
метный столик помещают препарат. Устанавливают объектив 8Х.
Поднимают конденсор вверх до упора. Открывают полностью диа-
фрагму конденсора. Отодвигают матовое стекло. Ставят плоское
зеркало. Закрывают диафрагму осветителя, оставив только не-
большое отверстие.
2. Включают осветитель. Пользуясь реостатом, регулируют
яркость света таким образом, чтобы нить лампы давала слабый
накал (иначе можно повредить глаза!). Корпусу осветителя при-
дают такое положение, при котором свет падал бы в центр зерка-
ла.
3. Закрывают зеркало микроскопа кружком белой бумаги и
фокусируют на него изображение витка нити лампы осветителя.
Это достигается передвижением патрона лампы осветителя.
4. Глядя в окуляр и слегка вращая зеркало, ловят в поле зре-
ния изображение краев диафрагмы осветителя, которое будет
иметь вид светлого пятна с нечеткими краями. Величина пятна
зависит от степени раскрытия диафрагмы и положения объектива.
Чем больше отверстие диафрагмы и чем выше объектив, тем боль-
ше пятно. Если оно занимает значительную часть поля зрения, его
уменьшают, несколько опустив объектив ,или сузив отверстие ди-
афрагмы осветителя, глядя при этом в окуляр. В тех случаях, ког-
да пятно сдвинуто к краю поля зрения, его переводят в центр
осторожным поворотом зеркала. По ряду причин (отсутствие иде-
ального точечного источника света, аберрация) под микроскопом
чаще всего видно не одно пятно, а несколько четких пятен. Уста-
86
новку света осуществляют по центральному пятну. В случае об-
разования по краям диафрагмы осветителя цветной бахромы цен-
трируют конденсор, смещая его регулировочными ручками в сто-
рону красного цвета бахромы и корректируя при этом центровку
зеркалом до момента симметричного распределения цвета бах-
ромы.
5. Используя объектив 8Х, фокусируют объект в области свет-
лого пятна.
6. Слегка опуская конденсор, фокусируют в плоскости препа-
рата изображение краев диафрагмы осветителя, т. е. получают
изображение светлого пятна с четко очерченными краями.
7. С помощью зеркала переводят полученное яркое пятно в
центр поля зрения.
Если все сделано правильно, то это светлое пятно, видимое
одновременно с препаратом, будет равномерно освещено. В про-
тивном случае нужно добиться его равномерного освещения, слег-
ка поворачивая корпус осветителя.
8. Открывают диафрагму осветителя так, чтобы светлое пятно
заняло все поле зрения.
9. Устанавливают объектив 40 X для препарата «раздавленная
капля» или 90Х для фиксированного окрашенного препарата, на
который предварительно наносят иммерсионное масло, и фокуси-
руют объект.
Яркость освещения следует регулировать только изменением
накала лампы осветителя или применением светофильтров. Поло-
жение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не
изменять! Никогда не следует поднимать и опускать конденсор или
необоснованно использовать его ирисовую диафрагму для регули-
ровки яркости поля зрения, так как это снижает разрешающую
способность микроскопа, ухудшает изображение, может даже ис-
казить его. Диафрагмой конденсора пользуются только для изме-
нения контрастности изображения. Необходимость использования
диафрагмы конденсора отпадает, если заранее привести в соот-
ветствие апертуру конденсора с апертурой используемого объек-
тива. Как указывалось, апертура неиммергированного конденсо-
ра близка к 1, а числовая апертура объектива 40Х составляет
0,65. Практически можно воспользоваться следующим приемом:
установив свет по Кёлеру и сфокусировав препарат с объективом
40 X, вынуть окуляр и, глядя в тубус, прикрывать диафрагму кон-
денсора до тех пор, пока края диафрагмы не станут видны у гра-
ницы равномерно освещенной задней линзы объектива. В этот
момент числовая апертура конденсора будет примерно равна
числовой апертуре объектива. При работе с объективом 90Х диа-
фрагму конденсора оставляют открытой, поскольку числовая
апертура этого объектива 1,25.
Правила работы с иммерсионным объективом. Сухо окрашен-
ный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик
87
микроскопа и, пользуясь объективом 8Х, устанавливают свет по
Кёлеру. Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммер-
сионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С по-
мощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до
погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить
очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза
не коснулась предметного стекла и не получила повреждения.
После погружения объектива в масло осторожно, также пользу-
ясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, нахо-
дят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с по-
мощью микрометрического винта.
По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают
препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива
сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же сал-
феткой, но слегка смоченной бензином или бензолом. Оставлять
масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно
способствует фиксированию пыли и может со временем привести
к повреждению оптики микроскопа. Эффективен способ удаления
масла, как жидкого, так и застывшего, свежеотломленным пено-
пластом. В отдельных случаях помогает протирка тканью, смо-
ченной дистиллированной водой. Края линз с выступающей опра-
вой очищают с помощью палочки, обернутой тканью.
6.1.2. Микроскопия в темном поле
Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта
косыми лучами света. Эти лучи не попадают в объектив, поэтому
поле зрения выглядит темным. Если препарат содержит клетки
микроорганизмов, то косые лучи, проходя через такой препарат, в
значительной степени отражаются от поверхности клеток и на-
столько уклоняются от своего первоначального направления, что
попадают в объектив. Тогда наблюдатель видит на черном фоне
интенсивно светящиеся объекты, даже если их диаметр в 10 раз
меньше, чем предел разрешения объектива. Такое освещение пре-
парата достигается примейением специального конденсора
(рис. 47). Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю
часть, поэтому центральные лучи света, идущие от зеркала, задер-
живаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лу-
чи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных
внутри конденсора (рис. 48).
При микроскопировании в темном поле можно увидеть объек-
ты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, т. е.
лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако на-
блюдение объектов в темном поле позволяет различить только их
контуры, но не дает возможности рассмотреть внутреннее строе-
ние.
88
Рис 47. Конденсор тем-
ного поля ОИ-13
Рис 48. Схема хода лучей в конден-
соре темного поля:
1 — линза конденсора; 2 — черная
пластинка, задерживающая централь-
ные лучи, 3 — объектив
УСЛОВИЯ РАБОТЫ С ТЕМНОПОЛЬНЫМ КОНДЕНСОРОМ
Успешная работа с темнопольным конденсором возможна
только при строгом соблюдении ряда условий.
1. Апертура темнопольного конденсора должна быть на 0,2'—
0,4 единицы больше апертуры объектива (см. схему хода лучей в
темнопольном конденсоре, рис. 48). В противном случае часть
боковых лучей попадет в объектив, что вызовет частичное осве-
щение поля зрения и снижение контраста. Поэтому наблюдение в
темном поле ведут обычно с иммергированным конденсором, име-
ющим апертуру около 1,2 и сухими системами с числовой апер-
турой 0,65—0,85. Когда используют объектив с большей аперту-
рой, то для получения четкого изображения объектив обязательно
диафрагмируют, т. е. снижают его апертуру. С этой целью в объ-
ектив, извлеченный из револьвера, вводят специальную вставную
диафрагму, которая входит в комплект выпускаемых темнополь-
ных конденсоров. Еще удобнее пользоваться объективами, снаб-
женными ирисовой диафрагмой, расположенной между линзами.
Вращением специального кольца, имеющегося на оправе, изменя-
ют диаметр отверстия диафрагмы и тем самым снижают число-
вую апертуру объектива.
2. Накал лампы осветителя должен быть максимальным, так
как темнопольный конденсор пропускает лишь незначительную
часть поступающего светового потока. Поэтому особое значение
приобретает правильная установка света, максимальное его ис-
пользование и особенно тщательная центрировка.
3. Толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм,
так как все конденсоры темного поля имеют очень маленькое ра-
бочее расстояние. В противном случае фокус конденсора окажется
в толще предметного стекла, а не в плоскости препарата, и на-
блюдатель ничего не увидит.
89
4. Следует обращать внимание на толщину и чистоту препара-
та. Чем толще препарат и чем больше в нем посторонних частиц,
преломляющих свет (пыль, пузырьки воздуха и т. д.), тем менее
контрастным получается изображение, так как каждая частица,
отражая лучи, освещает поле зрения. Поэтому для приготовления
препарата используют тщательно очищенные предметные и по-
кровные стекла.
ПОРЯДОК РАБОТЫ С ТЕМНОПОЛЬНЫМ КОНДЕНСОРОМ
1. Препарат «раздавленная капля», приготовленный на тонком
и тщательно очищенном предметном стекле, помещают на сто-
лик микроскопа и фокусируют с объективом 8Х- После этого по-
ложение тубуса не меняют до фокусировки препарата с объекти-
вом 40Х-
2. Вынимают светлопольный конденсор и окуляр, вывинчива-
ют один из объективов. Револьвер микроскопа МБР-1 имеет од-
но свободное от объектива отверстие, закрытое специальной за-
глушкой, так что можно воспользоваться этим отверстием, вывин-
тив заглушку.
3. Закрыв диафрагму осветителя, фокусируют изображение
нити лампы на зеркале, прикрытом кружком белой бумаги, как
при установке света по Кёлеру. Предварительно необходимо с по-
мощью реостата уменьшить яркость света.
4. Открывают диафрагму осветителя. Прикрывают верхний
конец тубуса микроскопа матовым стеклом (вместо окуляра) и,
слегка поворачивая зеркало, добиваются равномерного освещения
поля. После этого зеркало перемещать нельзя!
5. Вставляют окуляр и устанавливают объектив 8Х. Осторож-
но, не задевая зеркала, устанавливают темнопольный конденсор
таким образом, чтобы белый винт был обращен в сторону штати-
ва микроскопа, а два регулировочных винта — в сторону освети-
теля. Надевают на регулировочные винты ключи.
6. Препарат сдвигают в сторону, на верхнюю линзу конденсо-
ра наносят каплю иммерсионного масла и, несколько опустив кон-
денсор, снова устанавливают препарат, закрепив его клеммами.
7. Поднимают конденсор вверх до соприкосновения масляной
капли с предметным стеклом. Капля должна равномерно запол-
нить пространство между линзой конденсора н предметным стек-
лом и не содержать пузырьков воздуха.
8. Отключают реостат осветителя, т. е. получают максималь-
ное освещение.
9. Глядя в окуляр, центрируют конденсор. Для этого с по-
мощью регулировочных винтов приводят точно в центр поля зре-
ния изображение светлого кольца с темным пятном в середине
или только светлого пятна.
10. Слегка поднимая или отпуская конденсор, устанавливают
его в таком положении, чтобы в поле зрения исчезло темное пят-
но и осталось только замкнутое светлое пятно.
11. Ставят объектив 40Х и фокусируют препарат.
90
6.1.3. Микроскопия с фазово-контрастным устройством
Микроскопия с фазово-контрастным устройством основана на
том, что с его помощью различия в фазе световых лучей, возни-
кающие при прохождении их через прозрачные объекты, превра-
щаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся
контрастными. Глаз человека выявляет различия в длине волны
света (цвет) и ее амплитуде (интенсивность, яркость), но не в со-
стоянии заметить смещение фазы. Неокрашенные клетки микро-
организмов хорошо видны в проходящем свете обычного светло-
польного микроскопа только в том случае, когда значительная
часть энергии света, прошедшего через них, поглощается. При
этом выхрдящая из объекта (клетки) световая волна имеет мень-
шую амплитуду, т. е. яркость, н этот объект воспринимается гла-
зом наблюдателя как более темный, контрастный по сравнению
с окружающей средой. Однако многие микроорганизмы, размеры
которых лежат в пределах разрешающей способности микроско-
па, мало отличаются по прозрачности (плотности) от окружаю-
щей среды. Амплитуда световой волны, проходящей через клетки
таких микроорганизмов, почти не меняется, поэтому объекты пло-
хо различимы или даже невидимы в обычный светлопольный
микроскоп. Поле зрения кажется наблюдателю почти однород-
ным.
Объект можно сделать более контрастным, либо почти до пре-
дела закрывая диафрагму конденсора, либо окрашивая клетки,
либо применяя фазово-контрастное устройство. Первое нежела-
тельно, так как снижает апертуру конденсора и тем самым замет-
но уменьшает разрешающую способность микроскопа. Окраши-
вание препарата дает хорошие результаты, но в большинстве слу-
чаев оно осуществляется после фиксации микроорганизмов, что не
всегда желательно. Основная ценность метода фазового контраста
состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объек-
ты, не прибегая к их фиксации и окрашиванию. Применение фа-
зово-контрастного устройства не позволяет увеличить разрешаю-
щую способность микроскопа, но дает возможность увидеть
прозрачные объекты более четко и даже выявить некоторые
структуры и включения в клетках крупных бактерий.
Оптическая система, используемая для получения фазового
контраста, состоит из фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы.
Фазовая пластинка расположена в задней фокальной плоскости
объектива и представляет собой прозрачный диск, на котором на-
пылено кольцо из металлов. Кольцевая диафрагма расположена
под конденсором и представляет собой прозрачную щель в виде
кольца на непроницаемой для света пластинке. Световая волна,
проходя через клетки микроорганизмов, отстает по фазе пример-
но на 1/4Х. относительно прямых волн, прошедших только через
окружающую среду. В объективе микроскопа эти две волны ин-
терферируют. Результирующая волна имеет ту же длину и ам-
плитуду, что и прямая, но несколько отличается от нее по фазе.
91
Рис. 49. Схема хода лучей при ис-
пользовании фазово-контрастного
устройства:
1 — кольцевая диафрагма; 2 —
конденсор; 3 — объект; 4 —
объектив; 5 — фазовая пластинка
I
Рис. 50. Схемы, поясняющие
принцип фазового контраста:
1 — сдвиг фаз между диф-
рагированной (£>) и прямой
(S) волнами; 2 — темный
контраст; 3 — светлый конт-
раст
Этого отличия оказывается недостаточным, чтобы частицу можно
было заметить в обычный микроскоп. Для превращения разности
фаз в разность амплитуд служит фазовая пластина, которая до-
полнительно сдвигает дифрагированный луч на 1/4Х (рис. 49).
Фазовый эффект создается в результате интерференции пря-
мых лучей, не отклонившихся при прохождении через препарат, и
боковых, дифрагированных лучей, которые благодаря прохожде-
нию через объект и через фазовую пластинку либо совпадают по
фазе с прямыми, либо сдвинуты относительно них на 1/2Х, т. е.
находятся в противофазе. В первом случае обе волны складыва-
ются и изображение объекта становится более светлым, чем ок-
ружающий фон. Это светлый, негативный, контраст. По принципу
негативного контраста устроен так называемый аноптральный
микроскоп. Во втором случае дифракционная волна вычитается из
прямой и объект выглядит более темным — темный, позитивный,
92
Рис. 51. Фазово-контрастное устройство КФ-4:
/ — конденсор; 2 — револьверный диск с набором кольцевых
диафрагм; 3 — центрировочные винты; 4 — вспомогательный мик-
роскоп; 5 — набор фазовых объективов
контраст (рис. 50). Кроме того, кольцевая диафрагма уменьшает
интенсивность центрального светового пучка, что также усилива-
ет контрастность.
Широкое применение нашли фазово-контрастные устройства,
выполненные по схеме позитивного контраста. Наиболее распро-
страненной моделью является КФ-4 (рис. 51). Фазово-контраст-
ное устройство представляет собой приставку к микроскопу, со-
стоящую из вспомогательного окуляра, специальных фазовых объ-
ективов и конденсора с набором кольцевых диафрагм, каждая из
которых соответствует фазовой пластинке определенного объекти-
ва. Кольцевые диафрагмы установлены в револьверном диске под
конденсором и поворотом диска могут легко меняться, причем в
окне крышки диска появляется цифра, соответствующая увеличе-
нию применяемого объектива. Кроме того, в револьверном диске
имеется свободное отверстие — «нулевая диафрагма» — для на-
блюдений обычным способом. Конденсор снабжен двумя винтами
для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазового
кольца объектива. Все фазовые объективы имеют на оправе обоз-
начение «ф». Ими можно пользоваться и при обычной микроско-
пии, но из-за наличия фазового кольца они дают изображение по-
ниженного качества.
93
ПОРЯДОК РАБОТЫ С ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫМ УСТРОЙСТВОМ
Методика исследования живых микроорганизмов с фазово-
контрастным устройством сводится к следующему.
1. Удаляют из микроскопа обычный конденсор и на его месте
устанавливают фазово-контрастный. Диск револьвера конденсора
поворачивают таким образом, чтобр! в окошке стояла цифра «О».
Ирисовая диафрагма конденсора должна быть полностью откры-
та.
2. Заменяют объектив 40Х на фазовый объектив 40ХФ-
3. На предметный столик помещают препарат «раздавленная
капля». Устанавливают свет по Кёлеру, пользуясь объективом
8Х-
4. Устанавливают объектив 40ХФ-
5. Окуляр заменяют на вспомогательный и, перемещая тубус
последнего, добиваются четкой фокусировки фазовой пластинки
объектива. Она имеет вид темного кольца.
6. Поворотом диска револьвера включают кольцевую диаф-
рагму, соответствующую объективу 40ХФ- Теперь под микроско-
пом видно не только фазовое
Рис 52 Центрировка кольцевой ди-
афрагмы и фазовой пластинки
А — неправильное положение, Б —
правильное положение
кольцо, но и светлое кольцо —
щель диафрагмы.
7. Пользуясь центрировоч-
ными винтами конденсора,
перемещают кольцевую диаф-
рагму так, чтобы она совмес-
тилась с фазовым кольцом
(рис. 52). Если ширина тем-
ного кольца (фазовой плас-
тинки) больше, чем ширина
светлого кольца (щель диаф-
рагмы), то необходимо, что-
бы светлое кольцо вписалось в
контур темного кольца кон-
центрично.
8. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и фокусируют
препарат.
9. При микроскопировании с другими объективами устанавли-
вают соответствующие кольцевые диафрагмы и каждый раз про-
веряют центрировку, пользуясь вспомогательным окуляром.
6.1.4. Люминесцентная микроскопия
Люминесцентная микроскопия основана на способности мно-
гих веществ биологического происхождения и красителей све-
титься под воздействием падающего на них света. Молекулы
веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию пада-
ющего света и переходят в возбужденное состояние, которое ха-
рактеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком
состоянии они находятся непродолжительное время и вновь воз-
94
вращаются к исходному энергетическому уровню. Этот переход
сопровождается отдачей избытка энергии в виде света — люми-
несценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объ-
ект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300—
400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400—
460 нм.
Ряд веществ биологического происхождения — хлорофилл, ви-
тамин В2, алкалоиды, каротиноиды, порфирины, некоторые анти-
биотики и другие соединения обладает собственной люминесцен-
цией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке ряду
микроорганизмов, например, зеленым водорослям, некоторым
дрожжам и бактериям, свойственна периичная люминесценция.
Однако клетки большинства микроорганизмов люминесцируют
очень слабо, поэтому их обрабатывают специальными красителя-
ми — флуорохромами, обладающими люминесценцией. Люминес-
ценцию объекта после обработки флуорохромами называют наве-
денной, или вторичной.
Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изо-
бражения, дает возможность различить отдельные клеточные
структуры и даже отметить их изменения при различных функ-
циональных состояниях клетки. Этот вид микроскопии широко
применяют для цитологических исследований, выявления живых и
мертвых клеток, для изучения микроорганизмов в почвах, илах и
ризосфере растений.
Люминесценцию в сине-фиолетовых лучах видимого света
можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на
пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр, пропус-
кающий сине-фиолетовые лучи видимого спектра. Синие лучи,
мешающие выявлению люминесценции, убирают желтым свето-
фильтром, который помещают на окуляр микроскопа. В результа-
те наблюдатель видит на темном фоне люминесцирующие объек-
ты. Однако для микробиологических исследований наиболее удо-
бен люминесцентный микроскоп, в котором люминесценция воз-
буждается сине-фиолетовыми лучами и ближним ультрафиолетом.
Оптическая схема микроскопа МЛ-2 позволяет наблюдать объек-
ты при освещении их как в проходящем, так и в падающем свете.
Чаще свет, возбуждающий люминесценцию, направляется на пре-
парат сверху, через объектив. При освещении объектов сверху
(для возбуждения люминесценции) одновременно допускается
освещение объектов снизу с помощью конденсора темного поля
ОИ-13 или фазово-контрастного устройства. Люминесцентный
микроскоп также позволяет исследовать объекты в видимой обла-
сти спектра в проходящем и отраженном свете в темном поле.
Устройство люминесцентного микроскопа и порядок работы даны
в описании каждой конкретной модели и здесь не приводятся.
Большинство микробиологических объектов рассматривают с
объективами 40Х, 70Х или 90Х- При переходе от объектива
меньшего увеличения к объективу большего увеличения соблюда-
95
ют определенную последовательность Просмотрев объект с мень-
шим увеличением, ставят объектив большего увеличения. Затем
фокусируют препарат и вновь настраивают освещение, проверяя
центричность и резкость изображения полевой диафрагмы и ис-
точника света С иммерсионными объективами используют соот-
ветственно дистиллированную воду и нелюминесцирующее иммер-
сионное масло: вазелиновое или сандаловое.
6.1.5. Электронная микроскопия
В отличие от световых микроскопов электронные обслужива-
ются специалистами по их эксплуатации. Предел разрешения
электронного микроскопа на три порядка выше, чем светового, и
достигает 0,1 нм. В практике биологических исследований дости-
гается разрешение 0,5—1,0 нм. Получаемое при этом увеличение
составляет 5000—50000 крат (на экране микроскопа и фотоплен-
ке) и может быть повышено еще в 5—10 раз при фотопечати (в
этом случае, однако, новых элементов структуры не выявляется,
просто становятся видны мелкие детали, размеры которых мень-
ше разрешения человеческого глаза, но больше размеров зерен
фотоэмульсии).
Электронный микроскоп в отличие от светового позволяет ис-
следовать только неживые высушенные объекты, так как образец
находится в условиях высокого вакуума и интенсивного электрон-
ного облучения. Принцип возникновения изображения в электрон-
ном микроскопе иной, чем в световом. Как уже отмечалось, в
световом микроскопе контраст обусловлен избирательным погло-
щением света различных длин волн элементами структуры объек-
та (адсорбционный контраст) или изменением фазы световой вол-
ны при прохождении света через объект (фазовый контраст), тог-
да как в электронном микроскопе контраст вызван отклонением
ускоренных электронов тяжелыми атомами, входящими в состав
тонкопленочного объекта (или искусственно внесенными в него
при «химическом» контрастировании). Такой контраст называют
дифракционным. Абсорбционный контраст в электронном микро-
скопе — явление нежелательное (поглощение энергии электро-
нов приводит к хроматической аберрации, а часто и к тепловому
разрушению образца), и с ним приходится бороться, исследуя
объект в виде ультратонких (30—100 нм) срезов и пленок.
Основной частью электронного микроскопа является вакуум-
ная колонна, в которой последовательно расположены по прин-
ципу осевой симметрии электронная пушка, содержащая катод и
анод, а также ряд магнитных линз и люминесцирующий экран.
Электронная пушка обеспечивает эмиссию и ускорение электро-
нов. Часть электронов проходит через отверстие в центре анода
(центральную апертуру) и образует электронный луч, который
фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освеща-
ет объект. Прошедшие через объект электроны фокусируются
96
второй магнитной линзой (объективной), формирующей увеличен-
ное изображение объекта, которое затем дополнительно увеличи-
вается третьей магнитной линзой (проекционной) и проецируется
на люминесцирующий экран или фотопленку.
Электронный микроскоп, создающий изображение благодаря
прохождению (просвечиванию) электронов сквозь тонкопленоч-
ный образец, называется просвечивающим или трансмиссионным
(ТЭМ). Он позволяет выявить детали внутреннего строения мик-
роорганизмов, а также особенности их взаимодействия в анали-
зируемом образце. Предварительно образец фиксируют химичес-
ки, заливают в различные смолы и контрастируют солями тяже-
лых металлов. Часть электронов проходит через объект, часть в
той или иной степени рассеивается тяжелыми атомами, связав-
шимися с компонентами структуры, вследствие чего и формиру-
ется контраст изображения. Необходимая для трансмиссионной
микроскопии минимальная толщина образца обеспечивается при-
менением специальных устройств для приготовления срезов —
ультрамикротомов. Микроорганизмы и вирусы можно наблюдать
в ТЭМ и без заливки в смолы. Для этого каплю суспензии поме-
щают на пленку-подложку, высушивают и контрастируют хими-
чески или физически — косым напылением металлов (оттенение).
В сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) или в про-
свечивающем электронном микроскопе со сканирующей пристав-
кой изображение на телевизионном экране получается вследствие
того, что первичный электронный луч, сканируя поверхность об-
разца, взаимодействует с электронными оболочками атомов веще-
ства объекта, что вызывает различные вторичные излучения. Их
относительная интенсивность зависит от характеристик облучае-
мой поверхности рельефа, химического состава и электропровод-
ности. Различия в интенсивности вторичных излучений преобра-
зуются в изменение амплитуды электрических сигналов, что реги-
стрируется на экране или фотопленке. Достигаемое при этом по-
лезное увеличение меньше, чем в ТЭМ, и, как правило, не превы-
шает 50 000 крат (разрешение порядка 3—5 нм). Сканирующая
электронная микроскопия позволяет получить трехмерное (сте-
реоскопическое) изображение и наиболее эффективна для выяв-
ления поверхностных структур микроорганизмов, определения
формы и архитектоники объекта. Предварительно образец фикси-
руют химически, высушивают специальными методами и напыля-
ют в вакууме золотом, платиной или палладием для повышения
интенсивности вторичноэлектронной эмиссии и создания на по-
верхности электропроводящего покрытия, снимающего поверхност-
ный заряд.
6.2. ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В СВЕТОВОМ МИКРОСКОПЕ
Морфологические особенности клеток микроорганизмов можно
изучать, используя различные методы микроскопии, а также при-
меняя некоторые способы дифференциальной окраски. Выбор ме-
97
тодов микроскопического анализа и способов окраски определя-
ется конкретной целью исследования. Однако существует ряд при-
емов, которые имеют принципиальное значение и лежат в основе
большинства специальных методов исследования морфологии и
цитологии бактерий. Это некоторые способы приготовления пре-
паратов, фиксации и окраски клеток.
Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, тол-
щина которых не должна превышать 1,2—1,4 мм. Применение бо-
лее толстых стекол не позволяет получить резкое изображение
краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата, так как оно
попадает в толщу стекла, что нарушает фокусировку конденсора
и резко снижает четкость изображения. Чрезмерная толщина
предметного стекла недопустима при работе с иммерсионным
объективом, когда необходимо полностью использовать числовую
апертуру системы.
Существенным моментом является подготовка поверхности
предметных стекол, что особенно важно при изготовлении фикси-
рованных препаратов. Поверхность стекла должна быть тщатель-
но очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно
расплывалась по стеклу, а не собиралась в выпуклые, медленно
высыхающие капельки. Наиболее надежный способ обезжирива-
ния •— обработка стекол хромовой смесью с последующим опо-
ласкиванием водой и спиртом. В повседневной работе, однако,
вполне достаточно бывает тщательно натереть сухое стекло мы-
лом, после чего вытереть его чистой хлопчатобумажной салфет-
кой. Хорошее обезжиривание достигается протиранием вымытых
и высушенных стекол ватой, смоченной эфиром (после этого про-
мывание водой не требуется), или обжиганием поверхности сте-
кол в пламени горелки (жир при этом сгорает). Кипячение стекол
в растворах щелочей не рекомендуется, так как щелочи разъ-
едают стекло и поверхность его становится матовой. Хранить
чистые обезжиренные стекла можно в сухом состоянии или в эта-
ноле.
Покровные стекла, применяемые для приготовления препара-
тов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и
высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать
0,15—0,17 мм. Более толстые стекла резко ухудшают качество
получаемого изображения.
6.2 1. Препараты живых клеток микроорганизмов
Препарат «раздавленная капля». На предметное стекло нано-
сят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое ко-
личество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и на-
крывают покровным стеклом Микроорганизмы, выращенные на
плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериоло-
гической петлей, выращенные в жидкой среде, — стерильной пи-
петкой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно
98
не наносить. Капля исследуемого материала должна быть на-
столько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не
было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном
случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бу-
магой.
Препарат «висячая капля». Каплю суспензии микроорганиз-
мов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, ко-
торое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное
предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля дол-
жна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки
предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герме-
тизированной во влажной камере, что делает возможным много-
дневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений
используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов го-
товят в жидкой питательной среде.
Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой
микроорганизмы ,растут сплошным газоном или в виде отдельных
колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его
на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизма-
ми была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикла-
дывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него
петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть
в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в
каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стек-
ло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если ка-
саться поверхности колонии или газона предметным стеклом.
Препараты живых клеток рассматривают с «сухими система-
ми» микроскопа. Препараты, работа с которыми закончена, преж-
де чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе.
Препарат «микрокультура» или «агаровая пленка». На тон-
кое, простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят
стерильной нагретой пипеткой 0,2—0,3 мл горячей агаризованной
питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла.
После застывания среды петлей удаляют лишний агар, оставляя
два тонких участка пленки величиной с покровное стекло каждый.
В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят
каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма.
Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем
мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат.
Перед микроскопированием на пленку с выросшей микрокульту-
рой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыха-
ния пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом.
Метод, основанный на получении роста микроорганизма непо-
средственно на предметном стекле, позволяет вести микроскопи-
ческое наблюдение за процессами роста и развития, влиянием
токсических и других агентов на эти процессы. На препаратах не
нарушается естественное расположение клеток в растущей коло-
99
нии. Рост можно осуществлять в аэробных или анаэробных (под
покровным стеклом) условиях.
Агаровую пленку можно нанести на покровное стекло и при-
готовить препарат «висячая капля». На таком препарате можно
наблюдать движение бактерий по типу скольжения.
6.2.2. Препараты фиксированных окрашенных клеток
микроорганизмов
Приготовление фиксированных окрашенных препаратов вклю-
чает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фик-
сацию и окраску.
Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное
стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и пере-
носят в нее петлей небольшое количество исследуемого материа-
ла, как для препарата «раздавленная капля». Полученную
суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1—2 см2
возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько то-
нок, чтобы высыхал после приготовления.
Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при
комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тон-
кий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание мазка за-
медленно, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воз-
духа высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх.
Эту • операцию следует проводить осторожно, не перегре-
вая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.
Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микро-
организмы, т. е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ни-
кГи; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать ма-
зок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки ок-
рашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным спосо-
бом фиксации является термическая обработка. Для этого препа-
рат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пла-
мени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следу-
ет перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изме-
нения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, на-
пример их сморщивание. Для исследования тонкого строения
клетки прибегают к фиксации различными химическими вещест-
вами (см. Приложение). Фиксирующую жидкость наливают нама-
зок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с
фиксатором.
Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным об-
разом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные
красители. К кислым красителям относятся те, у которых ион,
придающий окраску (хромофор), — анион. У основных красите-
лей хромофором является катион. Примером кислых красителей
служит эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все этн кра-
сители интенсивно связываются с цитоплазматическими компо-
нентами клетки. Основные красители — метиленовый синий, ос-
100
новной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиоле-
товый, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компо-
нентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной
рнк в клетке бактерий делает ее более чувствительной к основ-
ным красителям. В связи с этим в микробиологической практике
применяются почти исключительно основные красители.
Различают простые и дифференциальные способы окрашива-
ния микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся
клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры.
Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей
клетки, а определенных ее структур. С помощью дифференциаль-
ной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запас-
ные вещества.
Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще все-
го пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым
синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные
стеклянные рейки, лежащие над кюветой, и заливают красителем
на 1—3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раст-
вор красителя на мазке не подсыхал. В случае необходимости на
мазок наливают новые порции красителя.
По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор,
пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат вы-
сушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной
бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного
масла и просматривают с объективом 90Х- Для получения более
чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый филь-
тровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева
позволяет использовать вместо растворов красителей фильтро-
вальную бумагу, заранее пропитанную красителем.
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле
зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганиз-
мов. Фиксировать и окрашивать можно также и препараты «от-
печатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут хранить-
ся длительное время.
Форму клеток и их сочетания (цепочки, розетки, пакеты, тет-
рады и т. д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавлен-
ная капля» в светлопольном или фазово-контрастном микроскопе.
Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий
таких, как Serratia marcescens, готовят препарат фиксированных
клеток и окрашивают их простым способом. Клетки мелких бак-
терий, имеющих выросты (роды Stella, Caulobacter, Prosthecomi-
crobium), целесообразно исследовать в темном поле. Естествен-
ное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также
спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изу-
чают на препарате «отпечаток». .
Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и ус-
ловия культивирования существенно влияют на морфологию и
цитологию микроорганизмов.
101
6.2.3. Определение размеров клеток микроорганизмов
Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с по-
мощью окулярной линейки — микрометра или окулярного винто-
вого микрометра. Для измерения лучше использовать живые, а не
фиксированные клетки, так как фиксация и окраска клеток при-
водят к некоторому изменению их истинных размеров. Удобно оп-
ределять размеры клетки, пользуясь фазово-контрастным устрой-
ством. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к
капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-ного водного
раствора агара. Размеры клеток выражают в микрометрах (мкм).
Окулярный микрометр представляет собой круглую
стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована линейка
длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микро-
метр вставляют в окуляр. Для этого вывинчивают глазную линзу
окуляра, помещают на его диафрагму окулярный микрометр де-
лениями вниз и завинчивают линзу. Однако делениями окуляр-
мнкрометра нельзя непосредственно измерить величину клетки,
так как последние рассматриваются через объектив и окуляр, а
деления линейки — только через верхнюю линзу окуляра. Поэто-
му, прежде чем приступить к измерению величины клеток, необ-
ходимо определить цену деления окулярного микрометра для дан-
ного увеличения микроскопа, что делают с помощью объективно-
го микрометра.
Объективный микрометр (рис. 53) — это металли-
ческая пластинка с отверстием в центре. В отверстие вставлено
стекло, на которое нанесена линейка длиной 1 мм. Она разделена
на 100 частей, т. е. деление объективного микрометра соответст-
вует 0,01 мм, или 10 мкм. Для определения цены делений окуляр-
ного микрометра объективный микрометр помещают на столик
микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изображение
линейки перемещают в центр поля зрения и только после этого
S
Рис. 53 Объективный микрометр
а — общий вид, б — вид под мик-
роскопом
меняют объектив на тот, при ко-
тором будут определяться раз-
меры клеток. Перемещая столик
микроскопа и поворачивая оку-
ляр, устанавливают микрометры
так, чтобы их шкалы были па-
раллельны и одна перекрывала
другую. Цену деления окуляр-
ного микрометра определяют по
принципу нониуса, т. е. совме-
щают одно из делений шкалы
окулярного и объективного
микрометров и находят следую-
щее их совмещение (рис. 54).
Устанавливают, скольким деле-
ниям объективного микрометра
соответствует 1 деление окуляр-
102
Рис 54 Определение Це-
ны деления объективного
микрометра-
1 — деление объективно-
го микрометра; 2 — де-
ление окулярного микро-
метра
ного микрометра. Например, 2 деления
объект-микрометр а (20 мкм) соответст-
вуют 5 делениям окуляр-микрометра,
следовательно, 1 деление окуляр-микро-
метра равняется 4 мкм (20:5). Если те-
перь на столик микроскопа положить
препарат с клетками микроорганизмов и
рассматривать его при том же увеличе-
нии, то можно измерить величину клетки.
Для этого определяют, какому числу
делений окулярной линейки соответст-
вует величина измеряемого объекта, и
умножают это число на цену деления
окулярного микрометра.
Удобно определять размеры клеток с
помощью винтового окулярного
микрометра МОВ-1-15. Винтовой
окулярный микрометр закрепляют на
тубусе микроскопа, предварительно вы-
нув окуляр. В окуляре винтового микрометра имеется неподвиж-
ная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров
крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрес-
тием. Пластинка связана с микрометрическим винтом-барабаном
и перемещается вместе с перекрестием при его вращении. Для из-
мерения длины клетки вращением микрометрического винта-бара-
бана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки
и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, пере-
мещают перекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают
деление на барабане. Определяют, скольким делениям микромет-
рического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножа-
ют полученное значение на цену деления барабана при данном
увеличении микроскопа.
Цену деления барабана для каждого объктива определяют с
помощью объективного микрометра. С этой целью подводят пере-
крестие к началу одного деления объективного микрометра и от-
мечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемеща-
ют перекрестие до конца деления объективного микрометра и
вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким де-
лениям микрометрического винта-барабана соответствует 1 деле-
ние объективного микрометра. Например, 1 деление объективного
микрометра, т. е. 10 мкм, соответствует X делениям микрометри-
ческого винта-барабана, следовательно, 1 деление его при данном
увеличении микроскопа равно 10 :Х мкм.
Чтобы результаты были достоверными, необходимо измерить
не менее 20—30 клеток. При определении размеров округлых
форм измеряют диаметр клеток, у других форм — длину и шири-
ну, указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т. е.
минимальные и максимальные размеры.
103
6.2.4. Клеточные структуры и запасные вещества
Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте
их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым
внешним слоем — капсулой или слизью. Эти структуры часто
имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании
.живых клеток. Химический состав капсул у разных бактерий нео-
динаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом
окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются,
а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко
отмывается в процессе обработки препарата. Чаще всего для вы-
явления капсул применяют способ «негативной» окраски (нега-
тивного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого-
небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю
разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают
покровным стеклом и просматривают с объективом 40Х- На об-
щем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы,
окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый
цвет. Кроме того, существуют специальные методы окраски кап-
сул, один из них приведен ниже.
Окраска капсул по методу Гинса. На конец
предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю
черной туши, вносят в нее клетки, хорошо перемешивают и реб-
ром покровного стекла делают мазок до всей поверхности стекла.
Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5—10 мин смесью
Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом. Далее мазок ок-
рашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в
соотношении 1:3. Время окрашивания — 2—3 мин. Препарат про-
мывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с им-
мерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастно
выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бес-
цветными капсулами.
Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо
видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточ-
ной стенки в световом микроскопе применяют метод темного поля
либо специальную окраску, с помощью которой удается легко вы-
явить границы между отдельными клетками, расположенными в
виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном
стекле делают мазок клеток исследуемых бактерий, высушивают
его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5 %-ным раствором
фосфоромолибденовой кислоты. Затем препарат промывают водой
и окрашивают не более 15 с 0,02%-ным раствором кристаллвио-
лета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с.
иммерсионной системой. Клеточная стенка окрашивается в чер-
ный, а цитоплазма — в бледно-сиреневый цвет.
Можно использовать метод окраски клеточной стенки по Гут-
штейну. Мазок выдерживают 15 мин в жидкости Карнуа, про-
травляют в течение 25 мин 10%-ным водным раствором таннина,
104
промывают водой и окрашивают водным фуксином или 0,02%-ным
раствором кристаллического фиолетового в течение 30—60 с. За-
тем препарат промывают, высушивают и микроскопируют с им-
мерсией.
Окраска по Граму. С молекулярной организацией и хи-
мическим составом клеточной стенки связывают способность бак-
терий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным ди-
агностическим признаком, она коррелирует со многими другими
свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями,
триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы:
грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные
бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом,
при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фио-
летовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой
способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей об-
работке фуксином или сафранином они приобретают розовую ок-
раску.
Как правило, по Граму окрашивают клетки молодых, чаще-
всего суточных, культур, так как способность удерживать краси-
тель зависит от физиологического состояния бактерий. Например,
некоторые бактерии после прекращения активного роста теряют
способность окрашиваться по Граму.
Окраска по Граму заключается в следующем. На одном обез-
жиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в цен-
тре — мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа — кон-
трольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны
быть грамположительными (например, Micrococcus luteus или1
Bacillus cereus), другой •— грамотрицательными (например,
Escherichia coli). Мазки следует готовить тонкими, чтобы клетки
равномерно распределялись по поверхности стекла и не образо-
вывали скоплений. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют
над пламенем горелки и окрашивают в течение 1—2 мин карбо-
ловым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем
краситель сливают и, не .промывая мазок водой, обрабатывают его
1—2 мин раствором Люголя до почернения. Сливают раствор
Люголя, препарат обесцвечивают 0,5—1,0 мин 96°-ным этиловым
спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают
1—2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промы-
вают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной сис-
темой. При правильном окрашивании грамположительные бакте-
рии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные — розово-крас-
ный цвет.
Выявление кислотоустойчивост и. Кислотоустой-
чивость — свойство, характерное для некоторых микобактерий в
нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих
бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость обус-
ловлена особенностями химического состава клеточной стенки вы-
шеупомянутых бактерий: высоким содержанием в ней сложных,
липидов и, в частности, наличием миколовых кислот.
105
Наибольшее распространение получил способ выявления кис-
.лотоустойчивости по Циль — Нильсену. На обезжиренном пред-
метном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток
кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воз-
духе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают
«фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фукси-
ном Циля и затем 2—3 раза подогревают его до появления паров,
держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением па-
ров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тот-
час отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают
остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и
мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ным
раствором H2SO4. Для этого предметное стекло погружают 2—3
раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат
вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3—5 мин мети-
леновым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промы-
вают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой.
При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые
клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоуетойчи-
вые — синий. Кислотоустойчивость можно определить у клеток
любого возраста.
Жгутики. Способность к движению у большинства микроорга-
низмов обусловлена наличием жгутиков. Расположение и количе-
ство их у различных бактерий варьируется и имеет диагностичес-
кое значение. Особенно важен этот признак для идентификации
палочковидных грамотрицательных бактерий. По характеру дви-
дкения бактерий в препарате можно предположительно судить о
типе жгутикования. Если жгутики расположены на одном или на
двух полюсах клетки, то движение обычно очень быстрое —
«ввинчивающееся», без покачивания из стороны в сторону; при
латеральном или перитрихиальном расположении жгутиков клетки
двигаются плавно, совершая колебательные отклонения от оси
движения.
Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что нераз-
личим в световом микроскопе, если он не окрашен особым спосо-
бом, который увеличивает кажущуюся толщину жгутика. Так,
диаметр отдельных жгутиков колеблется в пределах 0,01 —
0,02 мкм (у Bdellovibrio 0,04—0,06 мкм), а максимальное разре-
шение светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Лишь у немно-
гих бактерий, например у представителей рода Spirillum, пучки
жгутиков достаточно плотны и их удается обнаружить при на-
блюдении в светлом поле с помощью фазово-контрастного уст-
ройства или в темном поле.
Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они ос-
нованы на использовании различных протрав, осаждающихся на
поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увели-
чивается и они становятся видимыми в световом микроскопе. Ок-
раска жгутиков требует тщательной подготовки клеток и аккурат-
J06
ности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при
легком взбалтывании суспензии.
Окраска жгутиков по методу Леффлера в
модификации Пешкова. Бактерии, предназначенные для
окраски жгутиков, ежедневно в течение 2—3 дней пересевают в
свежую жидкую или на плотную среду, содержащую не более
1,5% агара. Для окраски жгутиков используют клетки 12—16-ча-
совой культуры Клетки осторожно берут петлей и переносят в
пробирку со стерильной водой, подогретой до температуры, при
которой их выращивали. Прежде чем делать мазок, каплю полу-
ченной суспензии просматривают под микроскопом и убеждаются
в том, что клетки подвижны и плотность суспензии невелика —
5—10 клеток в поле зрения.
Клетки легко теряют жгутики в момент приготовления мазка,
поэтому необходимо обращать внимание на чистоту стекла и спо-
соб нанесения на него суспензии. Предметные стекла должны
быть тщательно обезжирены. Непосредственно перед приготовле-
нием мазка стекло 3—4 раза проводят через наиболее горячую
часть пламени горелки. Дают стеклу остыть и пастеровской пи-
петкой или петлей наносят 3—4 маленькие капли на стекло. Кап-
ли должны хорошо расплываться по стеклу и быстро высыхать.
Высушенный мазок заливают протравой. Необходимо следить,
чтобы протрава не подсыхала. Через 15 мин протраву смывают
дистиллированной водой и препарат окрашивают в течение 5 мин
разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раст-
вор красителя. Затем препарат промывают водой, высушивают
на воздухе и исследуют с иммерсионной системой. Обращают
внимание на расположение жгутиков, их количество и длину.
По методу Рыжковой препарат заливают протравой через во-
ронку с фильтром и трижды в течение 3—5 мин подносят стекло
к пламени горелки до появления паров. Затем протраву сливают
И препарат заливают через воронку с фильтром раствором Циля
на 5—10 мин
Окраска жгутиков по способу Фонтана. Для
окраски жгутиков используют клетки 12—16-часовой культуры,
выращенной на скошенной агаризованной среде с конденсацион-
ной водой. Культуру вынимают из термостата и оставляют на 1 ч
при комнатной температуре. В пробирку с 0,5 мл водопроводной
стерильной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсаци-
онной водой. Материал берут осторожно, следует только коснуть-
ся бактериологической петлей поверхности культуры. Петлю с
бактериальной массой оставляют в воде на 1 ч. За это время
подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. За-
тем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после
этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят их на
обезжиренное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они
должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксиру-
ют 5 мин жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают
протравой и подогревают стекло до появления паров в течение
107
2 мин. Протраву сливают и препарат тщательно промывают во-
дой. Далее обработку препарата проводят серебрением. Разбав-
ленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло
несколько раз осторожно подогревают в течение 2 мин до появ-
ления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микро-
скопируют с иммерсионной системой. Бактерии в препарате окра-
шены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики, часто спу-
танные, — в светло-коричневый или желтый.
Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при
помощи светового микроскопа трудно. Основные красители, изби-
рательно окрашивающие хроматин ядер эукариотических клеток,
равномерно и интенсивно окрашивают всю прокариотную клетку.
Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клет-
ки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавлен-
ной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК-
Последующее окрашивание основным красителем позволяет выя-
вить нуклеоид в виде плотных тел, имеющих неправильные очер-
тания и расположенных в центре или на обоих полюсах клетки.
Довольно четко нуклеоид обнаруживается у следующих бактерий:
Proteus vulgaris, Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium.
Bacillus mycoides, Bacillus subtilis.
Для выявления нуклеоида поступают следующим образом.
На предметном стекле делают мазок суточной культуры бактерий,
высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 2—3 мин в
парах 2%-ного раствора осмиевой кислоты. С этой целью на дно
чашки Петри наносят 2-—3 капли фиксатора, а предметное стек-
ло помещают мазком вниз на обрезки стекла. По окончании фик-
сации препарат опускают на 2—3 мин в стаканчик с раствором
1 н. НС1 для гидролиза рибосомальной РНК. Стакан держат на
водяной бане при 60°. После гидролиза препарат немедленно про-
мывают водой. Затем мазок помещают на 15 мин в 1%-ный раст-
вор формалина, вновь промывают водой и окрашивают в течение
1—2 мин 0,1-—1,0%-ным водным раствором основного фуксина.
Препарат промывают, высушивают и микроскопируют с иммерси-
онной системой. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нук-
леоид — в ярко-малиновый.
Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют
запасные вещества, которые обнаруживаются в клетке в виде гра-
нулярных цитоплазматических включений. Природа запасных ве-
ществ различна. Чаще всего это полисахариды, липиды, полифос-
фаты. Некоторые бактерии накапливают в клетках серу.
Гранулы углеводной природы (полисахариды) выявляют при
обработке клеток раствором Люголя. Для этого к капле суспензии
клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя.
Препарат накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гра-
нулы крахмалоподобных веществ — гранулезы — окрашиваются
в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов — в крас-
новато-коричневый цвет. Гликоген при окраске Люголем легко
108
выявляется у дрожжей, гранулеза характерна для бактерий рода
Clostridium. Реакция на гликоген хорошо идет только в кислой
среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в
которой выращивали микроорганизмы, подкисляют.
Липидные гранулы. У дрожжей и мицелиальных грибов запас-
ные липиды представлены нейтральными жирами, которые легко
обнаруживаются в живых клетках без специальных методов ок-
раски в виде сильно преломляющих свет капель. Бактерии в каче-
стве резервных липидов образуют поли-р-оксимасляную кислоту.
Гранулы поли-р-оксибутирата хорошо заметны при микроскопи-
ровании живых бактериальных клеток с фазово-контрастным уст-
ройством, однако чаще для их выявления клетки окрашивают ли-
пофильными красителями — Суданом III или Суданом черным.
Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фик-
сируют в пламени горелки. Заливают поверхность мазка раство-
ром Судана черного и оставляют краситель на 5—15 мин. Избы-
ток красителя сливают, просушивают препарат фильтровальной
бумагой, просветляют в ксилоле, погружая в него несколько раз
предметное стекло. Время просветления препарата не должно пре-
вышать 1 мин. После этого клетки дополнительно окрашивают в
течение 10 с 0,1%-ным водным раствором сафранина. Более дли-
тельная обработка сафранином нежелательна, так как маскиру-
ется основная окраска. Гранулы поли-р-оксибутирата окрашива-
ются в темный цвет, остальная часть клетки — в розовый.
Полифосфаты (син. волютин и метахроматин). В клетках про-
кариот волютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот —
в вакуолях. Окраска волютиновых гранул основана на свойстве
метахромазии — способности вызывать изменение цвета некото-
рых красителей (метиленовый синий, толуидиновый синий). Го-
товят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фикси-
руют в пламени горелки. На фиксированный мазок наливают ме-
тиленовый синий по Леффлеру и окрашивают клетки в течение
10 мин Краситель сливают, препарат промывают водой, высуши-
вают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки окра-
шиваются в голубой цвет, а зерна волютина — в фиолетово-крас-
ный. Волютин легко выявить окраской по способу Омелянского,
основанному на плохой растворимости волютина в растворах кис-
лот. В этом случае на фиксированный в пламени горелки мазок
наливают карболовый фуксин Циля и окрашивают клетки в тече-
ние 0,5—1,0 мин. Краску сливают, промывают препарат водой и
обесцвечивают 1 % -ным раствором H2SO4 в течение 20—30 с. Затем
кислоту сливают, препарат промывают водой и дополнительно ок-
рашивают 20—30 с метиленовым синим (1:40) Снова промыва-
ют препарат водой, высушивают и микроскопируют с иммерсион-
ной системой. При правильном окрашивании гранулы волютина
имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы
Для выявления волютина у дрожжей применяют следующий
способ. Фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают ме-
109
тиленовым синим по Леффлеру в течение 3 мин. Краситель слива-
ют, препарат промывают водой и, не высушивая, наносят на мазок
небольшую каплю 1%-ного раствора серной кислоты; мазок нак-
рывают покровным стеклом и микроскопируют. Волютин имеет вид
капель сине-фиолетового цвета па слабо-голубом фоне цитоплаз-
мы.
Включения серы встречаются только у некоторых бактерий.
Благодаря двойному лучепреломлению капли серы хорошо замет-
ны в клетках без специального окрашивания. Включения серы
растворяются при обработке клеток абсолютным спиртом, сероуг-
леродом или ледяной уксусной кислотой.
Параспоральные тельца. Спорулирующая клетка Bacillus thu-
ringiensis образует примыкающий к споре правильный бипирами-
дальный белковый кристалл, который высвобождается вместе со
спорой при автолизе материнской клетки. Для обнаружения па-
распоральных телец применяют специальную окраску. Готовят
тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе, фиксируют над
пламенем горелки и в течение 2 мин окрашивают анилиновым
черным. Затем осторожно смывают краску водой и мазок в тече-
ние 15 с докрашивают фуксином Циля. Препарат промывают во-
дой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
При правильной окраске кристаллы белка (параспоральные тель-
ца) окрашиваются в черный, а остальная часть клетки — в розо-
вый цвет. Параспоральные тельца можно наблюдать и в живых
клетках, используя фазово-контрастное устройство. В этом слу-
чае параспоральные тельца выглядят как гранулы, способные
сильно преломлять свет.
6.2.5. Эндоспоры
Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и
некоторых других. Для обнаружения способности клеток к споро-
образованию лучше использовать старые культуры. Споры мож-
но обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем
дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. В случае
выявления у микроорганизма способности к образованию спор
необходимо обратить внимание на тип спорообразования (бацил-
лярный, клостридиальный, плектридиальный), расположение спо-
ры в клетке (центральное, эксцентральное или полярное), форму
свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и опреде-
лить их размеры. С этой целью просматривают клетки 2—3-суточ-
ной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий
проходят за этот период времени все стадии развития—-от веге-
тативной клетки до, свободной споры.
Наблюдение спорообразования в микрокультуре. На стериль-
ном предметном стекле, как описано выше (см. 6.2.1.), получают
тонкую пленку агаризованной питательной среды, благоприятной
для спорообразования (например, картофельного агара). В центр
110
пленки наносят петлей каплю жидкой 24-часовой культуры Bacil-
lus megaterium или другой крупной спорообразующей бактерии.
Полученный препарат инкубируют при 37° во влажной камере в;
течение 20—24 ч. Перед микроскопированием препарат подкра-
шивают метиленовым синим по Леффлеру и осторожно наклады-
вают покровное стекло. Микроскопируют с иммерсией или фазо-
вым контрастом. Просматривают край колонии, обращая внима-
ние на расположение клеток и на клетки в разных стадиях споро-
образования.
Наблюдение живых клеток. Споры по сравнению с цитоплаз-
мой характеризуются более высоким показателем преломления:
света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны
как более темные включения округлой или овальной формы. При
использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид
светлых включений на фоне почти черных клеток.
Метод выявления спор негативным окрашиванием. На пред-
метном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бак-
терий, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени. Затем на
3—5 мин наносят метиленовый синий или на 1—3 мин фуксин*
после чего препарат осторожно промывают водой и подсушивают
на воздухе. Просматривают с иммерсией.
Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры*
имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку — нет.
Они видны как сильно преломляющие свет сферические илк
овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии
спорообразования внутри или вне клеток бактерий.
Метод удобен при количественной оценке процесса спорооб-
разования путем подсчета количества спор и вегетативных клеток
в разных условиях роста бактерий.
Дифференциальная окраска споры и цитоплазмы по м ето ду
Пешкова. Споры и цитоплазму окрашивают при нагревании. Про-
мывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы*
тогда как спора прочно удерживает краситель.
На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высуши-
вают его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают
раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят
до кипения, держа предметное стекло над пламенем горелки. По
мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продол-
жительность окраски, считая с момента закипания красителя,—
10—20 с. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщатель-
но промывают водой, после чего клетки в течение 30 с докраши-
вают 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного или
сафранина. Краситель сливают, препарат промывают водой и
просматривают с иммерсионной системой. При правильном окра-
шивании клетки имеют красный, а споры — синий цвет. Вместо
метиленового синего можно использовать малахитовый зеленый.
В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки, за-
ливают на 7—10 мин 7,5%-ным раствором малахитового зеленого.
111
Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над со-
судом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании
окраски предметное стекло охлаждают, промывают препарат во-
дой и докрашивают клетки 0,25%-ным водным раствором сафра-
нина в течение 1—2 мин. Споры окрашиваются в зеленый цвет,
клетки — в розовый.
6 3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ
МИКРОСКОПИИ
Как уже отмечалось (6.1.4), некоторые микроорганизмы обла-
дают собственной (первичной) люминесценцией, что связано с
наличием в их клетках люминесцирующих веществ — хлорофилла,
каротиноидов, рибофлавина, алкалоидов, порфиринов, некоторых
антибиотиков. Такие микроорганизмы можно изучать в люминес-
центном микроскопе на препаратах «раздавленная капля». Одна-
ко в большинстве случаев применяется предварительная обработ-
ка клеток специальными красителями — флуорохромами, что при-
водит к вторичной люминесценции. Существуют природные и син-
тетические флуорохромы. Широко используются акридин оран-
жевый, этидиумбромид, примулин, родамин, берберинсульфат,
флуорескамин, аурофосфин и некоторые другие, избирательно
концентрирующиеся на отдельных структурах клетки. Флуореска-
мин выявляет аминогруппы, этидиумбромид — ДНК, фосфин 3R—
липиды. Калькофлуор белый образует соединения с хитином, цел-
люлозой и используется для учета грибов в почве. Диацетилфлуо-
ресцеин дифференцирует живые и мертвые клетки.
Особый интерес представляет флуоресцеинизотиоцианат
(ФИТЦ), образующий связь с белками антител без нарушения их
способности соединяться с гомологичными антигенами. Меченные
ФИТЦ антитела представляют собой высокочувствительные инди-
каторы на соответствующие антигены. Антитела получают обще-
принятыми методами из крови иммунизированных кроликов и за-
тем флуорохромируют. Кроме того, широко используются готовые,
меченные флуорохромом определенные антисыворотки, а также
готовый комплекс ФИТЦ-у-глобулин. Иммунофлуоресцентный
анализ широко применяется в медицинской и санитарной микро-
биологии, генетике, систематике, экологии микроорганизмов.
Препараты живых клеток. На предметное стекло в каплю ра-
створа акридина оранжевого в воде или 0,5%-ном NaCl в разведе-
нии 1:10 000 вносят исследуемую культуру микроорганизмов и
накрывают покровным стеклом. Через 2—10 мин микроскопируют
при увеличении объектива 40X или 90X с вазелиновым маслом.
Препараты фиксированных клеток. На предметном стекле го-
товят мазок, фиксируют и окрашивают нейтральным или слабо-
кислым раствором акридина оранжевого в разведении 1:10 000
2—4 мин. Затем препарат отмывают от избытка флуорохрома в
стоячей или слабопрОточной воде в течение 5—10 мин, накрыва-
112
ют покровным стеклом (при необходимости добавляя каплю во-
ды) и просматривают с объективом 90X.
Иммунофлуоресцентное окрашивание: прямой метод. На
предметное стекло помещают суспензию клеток или образец, со-
держащий искомый микроорганизм, подсушивают и фиксируют
нагреванием или другим способом. Препарат окрашивают мечен-
ной ФИТЦ антисывороткой, поместив его во влажную камеру
(чашка Петри с мокрой фильтровальной бумагой). Время взаимо-
действия подбирают опытным путем; обычно достаточно 20 мин.
Затем препарат отмывают в стоячей или слабопроточной воде
2—3 мин, накрывают покровным стеклом и исследуют с объекти-
вом 90 X. Так как оболочка клетки непроницаема для антител,
они адсорбируются на поверхности клетки, так что возникает ха-
рактерный «эффект ореола» как один из критериев специфичнос-
ти. Если в сыворотке есть несвязанный флуорохром, он, проникая
в клетку, вызывает ее свечение вследствие неспецифической реак-
ции
Иммунофлуоресцентное окрашивание: непрямой метод. Вклю-
чает два этапа. Препарат фиксируют нагреванием, наносят кап-
лю нелюминесцирующей гомологичной иммунной сыворотки опре-
деленного разведения и оставляют на 20—30 мин во влажной ка-
мере. Затем осторожно промывают в течение 5 мин. На втором
этапе на препарат наносят каплю меченого антикроличьего
^-глобулина, разведенного до так называемого окрашивающего
титра. Время инкубации на втором этапе и окрашивающий титр
определяют эспериментально. После этого препарат осторожно
промывают и микроскопируют при увеличении 90X. Непрямой
метод обладает принципиальным преимуществом, так как, имея
лишь одну люминесцирующую сыворотку, можно отыскать боль-
шое число разных антигенов, используя стандартные кроличьи сы-
воротки. При непрямом методе, однако, крайне важен контроль,
включающий инкубирование препарата на втором этапе непо-
средственно с меченой сывороткой; обработку препарата гетеро-
логичной меченой сывороткой; обработку препарата на первом
этапе нормальной или гетерологичной сывороткой, не содержа-
щей антител к исследуемому антигену.
Обнаружение мелких колоний микроорганизмов. Мембранный
фильтр марки «Синпор» с диаметром пор 1 мкм стерилизуют ки-
пячением в дистиллированной воде в течение 20 мин. Через фильтр
пропускают исследуемый субстрат (воду, почвенную вытяжку)
или суспензию микроорганизмов. Фильтр накладывают тыльной
стороной на агаровую пластинку с элективной питательной сре-
дой и помещают на 5—6 ч в термостат. Затем фильтр с колония-
ми снимают со среды и кладут тыльной стороной на дно чашки
Петри, содержащей несколько капель флуорохрома, или диск
фильтровальной бумаги, смоченный раствором флуорохрома, на-
пример, акридина оранжевого, в разведении 1:5000. Диффунди-
рующий через фильтр флуорохром в течение 5—10 мин окраши-
113
вает колонии микроорганизмов. При необходимости фильтр нак-
ладывают на фильтровальную бумагу, смоченную физиологичес-
ким раствором, для удаления избытка флуорохрома. Фильтры
просматривают в синем свете. Микроорганизмы остаются живыми
и могут быть использованы для дальнейшего выращивания и изу-
чения.
6.4. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Как уже отмечалось (6.1.5.), электронный микроскоп позволя-
ет исследовать только неживые обезвоженные объекты. Способы
подготовки микроорганизмов к наблюдению в сканирующем
(СЭМ) и трансмиссионном (ТЭМ) электронных микроскопах
имеют свои особенности.
6.4.1. Препараты для просвечивающей электронной
микроскопии
Приготовление препаратов включает процессы фиксации, обез-
воживания, пропитки и заливки специальными смолами.
Фиксация. Микроорганизмы фиксируют раствором глутарово-
го альдегида, раствором оксида осмия или последовательным ис-
пользованием того и другого. Работу ведут в вытяжном шкафу.
Клетки отделяют от среды центрифугированием при 6 000 об/мин,
промывают фосфатным буфером (0,1 н., pH 7,2) и вновь центри-
фугируют. 5—10 мг биомассы помещают в 1 мл 2,5%-ного охлаж-
денного раствора глутарового альдегида в том же фосфатном бу-
фере и оставляют на 1—2 ч в темноте при +4°. Глутаровый аль-
дегид сливают, клетки промывают 2 раза фосфатным буфером и
после центрифугирования заливают 1%-ным водным раствором
OsO4. Оставляют на 2—16 ч в темноте при +4°. Раствор оксида
осмия сливают и клетки промывают 2—3 раза фосфатным буфе-
ром, центрифугируя.
Обезвоживание. Осадок после фиксации и промывки фосфат-
ным буфером проводят через растворы этанола возрастающей
концентрации, каждый раз центрифугируя суспензию: 30°-ный —
2 раза по 5 мин; 50°-ный—1 раз 10 мин; 70°-ный — с 3%-ным
уранилацетатом, оставляя на ночь; 96°-ный — 2 раза по 10 мин;
100°-ный — 2 раза по 10 мин. На последнем этапе клетки прово-
дят через ацетон 2 раза по 10 мин.
Пропитка смолами. После обезвоживания клетки пропиты-
вают смолами (эпон, аралдит), выдерживая материал в стеклян-
ных бюксах при 37° по 1 ч в системе ацетон: смолы, взятых после-
довательно в соотношении 3’1, 1:1 и 1:3. Затем клетки переносят в
заливочные капсулы и заливают смолами без ацетона. Капсулы
выдерживают при комнатной температуре 1 сутки, затем при 37°
1 сутки и при 60° 2 суток. После этого капсулы с включенными в
смолы клетками микроорганизмов готовы для заточки и резки на
114
ультрамикротоме. После нанесения срезов на формваровые се-
точки их окрашивают цитратом свинца или уранилацетатом.
6.4.2. Препараты для сканирующей электронной микроскопии:
клетки, колонии, споры воздушного мицелия
Подготовка клеток включает три этапа: фиксацию, обезвожи-
вание, напыление металлом.
Фиксация. 20—50 мг сырой биомассы микроорганизмов поме-
щают в 5 мл фосфатного буфера (0,1 н., pH 7,2) в центрифужных
пробирках, перемешивают и центрифугируют при 6 000 об/мин
5 мин. К осадку добавляют 2 мл глутарового альдегида в 18 мл
того же фосфатного буфера, перемешивают и оставляют на 1 ч в
темноте. Затем клетки центрифугируют и промывают фосфатным,
буфером.
Обезвоживание. Процесс обезвоживания проводят, последова-
тельно помещая осадок клеток на 5 мин в водные растворы эта-
нола концентрации 50, 60, 70, 96 и в конце 100°, каждый раз цент-
рифугируя. Полученный осадок переносят в маленькие бюксы,
которые оставляют на ночь открытыми в вытяжном шкафу для
полного испарения ацетона. Далее проводят досушивание в кри-
тической точке.
Напыление металлом. На поверхность поддерживающего сто-
лика наносят тонкий слой клея или лака, на который помещают
небольшое количество полученного материала. Столики в специ-
альном приборе напыляют металлом в течение 15 мин.
Микроорганизмы для наблюдения в СЭМ можно подготовить
на покровном стекле. Культуру или промытые фосфатным буфе-
ром клетки наносят на осколок обезжиренного покровного стекла
и высушивают на воздухе. Стекло помещают на 1 ч в глутаровый
альдегид (2,5%-ный раствор в фосфатном буфере, 0,1 н., pH 7,2)
и промывают затем фосфатным буфером. Далее обезвоживают
клетки, последовательно помещая стекла в водные растворы эта-
нола (20, 25, 50, 70, 96; 100°) на 15 мин в каждый и в амилацетат
или чистый ацетон на 1 ч. Досушивают в критической точке. Сухие
мазки готовы для напыления и просмотра в СЭМ.
С целью изучения архитектоники колоний микроорганизмов
их выращивают на мембранных фильтрах (Владипор, №2—5) и
проводят фиксацию и обезвоживание в щадящем режиме. Фильт-
ры стерилизуют и помещают на поверхность плотной питательной
среды в чашке Петри, инокулируют культурой в определенном
разведении и инкубируют в подходящем режиме. Выросшие коло-
нии подвергают фиксации и обезвоживанию, последовательно по-
мещая фильтры в чашки Петри, крышки которых покрыты внутри
фильтровальной бумагой, пропитанной следующими веществами:
25%-ный глутаровый альдегид, на 20—30 мин, безводный ацетон
или пропиленоксид, 2 раза по 20 мин. После напыления металлом
колонии исследуют в СЭМ.
115
Колонии микроорганизмов можно также последовательно по
20—30 мин фиксировать 25%-ным глутаровым альдегидом и
1—2%-ным водным раствором оксида осмия и после обезвожива-
ния, заливки смолами и ультратомирования исследовать в ТЭМ.
Экзоспоры актиномицетов и грибов готовят к наблюдению в
СЭМ следующим образом. К спороносящему воздушному мице-
лию слегка прикасаются поверхностью поддерживающего столи-
ка, покрытой клеем или лаком. Полученный отпечаток подсуши-
вают на воздухе и напыляют металлом. Обращают внимание на
расположение и структуру поверхности спор.
ГЛАВА 7
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в
питательных средах судят по количеству их клеток или биомассе
в единице объема. Методы определения этих показателей могут
быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание на
весах) или косвенными. Косвенные методы основаны на измере-
нии параметров, величина которых зависит от количества или био-
массы микроорганизмов (число колоний, выросших после высева
суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглоще-
ние суспензией клеток света, содержание в ней белка и др.). Вы-
бор метода зависит от целей исследования, свойств питательной
среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии
микроорганизмов. Так, многие методы, используемые для опреде-
ления числа одноклеточных микроорганизмов, не приемлемы при
подсчете многоклеточных (нитчатых, мицелиальных и др.) форм.
При оценке численности микроорганизмов, особенно в естест-
венных субстратах (прежде всего в почве), необходимо помнить,
что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном)
состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом под-
счета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (де-
сорбировать). Выбор метода десорбции (механическое переме-
шивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком,
применение поверхностно активных веществ и т. д.) определяется
особенностями исследуемого субстрата.
7 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК
7.1.1. Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом
Подсчитать клетки микроорганизмов под микроскопом можно,
используя счетные камеры, капилляры Перфильева, препараты
фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на пред-
метных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы
позволяют определить общее количество клеток в единице объе-
ма. Следует помнить, что подсчитываются все клетки, как живые,
так и мертвые. Основное ограничение большинства указанных
методов — необходимость довольно высоких концентраций клеток
в единице исследуемого субстрата.
Подсчет клеток в счетных камерах. Этот метод рекомендуется
использовать для подсчета крупных объектов — дрожжей, одно-
117
клеточных водорослей, конидий
грибов и некоторых относитель-
но крупных бактерий. Обычно
используют камеру Горяева —
Тома (рис. 55), хотя можно при-
менять и другие счетные каме-
ры. Камера Горяева представля-
ет собой толстое предметное
стекло, разделенное бороздками.
На центральную часть стекла
нанесена сетка. Площадь квад-
рата сетки указана на одной из
сторон предметного стекла и со-
ответствует 1/25 мм2 (большой
квадрат) или 1/400 мм2 (малый
квадрат). Часть предметного
стекла, на которой нанесена сет-
ка, на 0,1 мм ниже двух Других
сторон. Это глубина камеры; она
всегда указывается на предмет-
ном стекле.
При работе с камерой необ-
ходимо соблюдать определенный
порядок ее заполнения. Вначале
углубление с сеткой покрывают
специальным шлифованным
покровным стеклом и, слегка
прижимая, смещают покровное
В
A
Рис. 55. Счетная камера Го-
ряева—Тома:
А — вид сверху; Б — вид сбо-
ку; В — при малом увеличении
микроскопа
стекло в противоположные сто-
роны до появления колец Нью-
тона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сто-
ронам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроор-
ганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. Пос-
ле этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорга-
низмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или
пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3—5 мин
после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопи-
ровании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед
заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием
в 0,5%-ном водном растворе формалина.
Число клеток подсчитывают с объективом 8Х или 40Х. С
иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное
расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитыва-
ют клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких
квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают
все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересе-
кающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете коли-
чество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в
малом — 10, в противном случае исходную суспензию разводят
118
водопроводной водой. Для получения достоверного результата
общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть
не менее 600.
Точность определения зависит от того, насколько плотно при-
шлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому
подсчет клеток повторяют 3—4 раза, каждый раз заново монти-
руя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов.
Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при
однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл иссле-
дуемой суспензии вычисляют по формуле
а-103
М ==-----п
hS
где Л1 — число клеток в 1 мл суспензии; а — среднее число клеток
в квадрате сетки; h — высота камеры в мм; <$ — площадь квадра-
та сетки в мм2; 103 — коэффициент перевода см3 в мм3; п — разве-
дение исследуемой суспензии.
Подсчет клеток в капиллярах Перфильева. Для изучения и
подсчета микроорганизмов в естественных субстратах иногда при-
меняют капилляры Перфильева. Они имеют прямоугольное сече-
ние и по принципу подсчета аналогичны счетной камере. При по-
гружении капилляра в субстрат (ил, почву и т. д.) он заполняет-
ся в силу своих капиллярных свойств. Затем капилляр помещают
на предметное стекло, заливают конец расплавленным парафи-
ном и подсчитывают клетки, используя объективы 40 X, 90 X или
фазово-контрастное устройство.
Длина отрезка капилляра соответствует диаметру поля зрения
при данном увеличении микроскопа. Для получения достоверного
результата подсчитывают клетки в 50—100 полях зрения. Коли-
чество клеток в 1 мл исследуемого субстрата определяют по фор-
муле
где М—количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а —
среднее число клеток в капилляре, длиной в диаметр поля зрения;
h — высота капилляра в мм; I—ширина капилляра в мм; d —
диаметр поля зрения (длина капилляра) при данном увеличении
микроскопа в мм; 103 — коэффициент перевода см3 в мм3; п —
разведение исследуемого субстрата.
Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (ме-
тод Виноградского—Брида). Метод широко используется для оп-
ределения численности микроорганизмов в различных естествен-
ных субстратах — почве, загрязненных водах, молоке, в оптически
непрозрачных питательных средах, содержащих нерастворимые
в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преиму-
щество метода заключается также в том, что фиксированные ок-
рашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет мож-
но проводить в удобное для исследователя время.
119,
Приготовление препарата сводится к следующему. Хорошо
обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бу-
магу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 или 6 см2.
Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объ-
ем исследуемой суспензии (0,01, 0,02 или 0,03 мл) и каплю
0,03—0,1%-ного водного раствора агара. Нанесенную суспензию
равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на
миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фик-
сируют 10—20 мин 96°-ным спиртом и окрашивают 1—2 мин фук-
сином Циля или любым другим красителем. Краситель сливают,
препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4—5
стаканов с водой (промывать препарат под струей водопроводной
воды не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препа-
раты хорошо сохраняются.
Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объекти-
вом в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр
между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки
подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Для мак-
симального использования оптических возможностей микроскопа
рекомендуется иммергировать конденсор. Следует иметь в виду,
что использование ахроматов не дает одинаково четкой картины
в центре поля зрения и по его краям, что затрудняет подсчет.
Правила подсчета в квадратах окулярной сетки те же, что и при
подсчете клеток в квадратах сетки счетной камеры. Чтобы ре-
зультат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендует-
ся подсчитывать в 50—100 полях зрения. Общее количество под-
считанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток
микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата,
вычисляют по формуле
aS
М = — п,
sV
где М — количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а —
среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s — площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) в мкм2;
V — объем нанесенной на стекло суспензии в мл; S — площадь
приготовленного мазка в мкм2; п — разведение исследуемого суб-
страта.
Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с по-
мощью объект-микрометра. Последний помещают на столик мик-
роскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором
проводили подсчет, определяют сторону квадрата окулярной сет-
ки или диаметр поля зрения (см. гл. 6). Площадь поля зрения вы-
числяют по формуле s = яг2.
Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Этот метод реко-
мендуется использовать для определения численности микроор-
ганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток. Его применя-
ют при определении количества микроорганизмов в различных
водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других
120
исследованиях. Фильтрование пробы определенного объема (от
нескольких миллилитров до десятков литров) позволяет сконцен-
трировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки
микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.
Для фильтрования выбирают фильтр, который задерживает мик-
роорганизмы, находящиеся в исследуемом субстрате. Характерис-
тика мембранных фильтров приведена в гл. 3. Перед использова-
нием каждую партию фильтров необходимо проверять, так как
иногда они бывают сильно загрязнены бактериями. Для этого-
3—5 фильтров кипятят в дистиллированной воде, окрашивают кар-
боловым эритрозином, как указано ниже, и просматривают под
микроскопом. Фильтры с большим загрязнением микроорганиз-
мами для подсчета клеток не используют. Пригодные для работы
фильтры кипятят в дистиллированной воде для удаления воздуха
и остатков растворителей; воду следует 2—3 раза сменить. Кипя-
чение не должно быть слишком бурным, иначе фильтры будут
скручиваться. После этого фильтр матовой стороной вверх поме-
щают на пористую пластинку специального держателя и про-
пускают через него точно измеренный объем исследуемой пробы.
Подробно о технике фильтрования через мембранные фильтры
см. гл. 3.
Чем больше плотность клеток в исследуемом материале, тем
меньше должен быть фильтруемый объем, и наоборот. Клетки
микроорганизмов, осевшие на фильтре, окрашивают карболовым
эритрозином. Для этого фильтр помещают нижней стороной в
чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную красите-
лем, чашку закрывают крышкой и оставляют на 3—5 ч или даже
на сутки. Для равномерного окрашивания клеток мембранный
фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритро-
зином. Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, пере-
кладывая его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, обильно
смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока он не перес-
танет окрашивать влажную фильтровальную бумагу. После от-
мывания фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для
микроскопирования. На предметное стекло капают иммерсионное
масло и помещают на него окрашенный мембранный фильтр так,
чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность мем-
бранного фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и
покрывают фильтр покровным стеклом.
Количество клеток микроорганизмов подсчитывают с иммер-
сионным объективом 90Х в квадратах окулярной сетки или в по-
ле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, кото-
рые изложены для метода Виноградского. Количество клеток в
1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле
.. af-1Oe
где М — количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а —
среднее количество клеток в квадрате окулярной сетки (поле
121
зрения); F — площадь мембранного фильтра в мм2; V — объем
(мл) профильтрованной жидкости; 106 — коэффициент перевода
мм2 в мкм2; s — площадь квадрата окулярной сетки (поля зре-
ния).
При выявлении и количественном учете микроорганизмов
широко применяют люминесцентную микроскопию (см. гл. 6).
Препараты микроорганизмов готовят непосредственно из исследу-
емой суспензии и ее разведений либо концентрируют клетки на
специально обработанных нефлуоресцирующих фильтрах. Препа-
раты и фильтры с микроорганизмами обрабатывают акридином
оранжевым или другими красителями. Принципы подсчета при
люминесцентной и светлопольной микроскопии одинаковы,
однако окрашенные флуорохромами клетки более четко видны на
темном фоне препарата и хорошо отличимы от небиологических
объектов (частиц ила, почвы и т. д.). Это позволяет вести их под-
счет более точно.
Люминесцентная микроскопия дает также возможность выя-
вить и оценить численность отдельны^ групп микроорганизмов в
исследуемой пробе. Это достигается в результате использования
специальных флуорохромов (например, калькофлуора белого —
для выявления грибов), методов иммунофлуоресценции и др.
7.1.2. Определение числа клеток микроорганизмов высевом на
питательные среды
В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом
этот метод дает возможность определить только число жизнеспо-
собных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста
всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возмож-
ность определить число микроорганизмов, способных расти на
среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы,
которые не растут или растут крайне медленно. Это важно пом-
нить при анализе таких естественных субстратов, как почва, вода
и т. п.
Определение количества клеток высевом на плотные пита-
тельные среды (чашечный метод Коха). Метод широко применя-
ют для определения численности жизнеспособных клеток в раз-
личных естественных субстратах и в лабораторных культурах.
В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая ко-
лония является потомством одной клетки. Это позволяет на ос-
новании числа колоний, выросших после посева на плотную пи-
тательную среду определенного объема исследуемой суспензии,
судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов.
Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенно-
го методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в услов-
ных единицах — так называемых колониеобразующих единицах
(КОЕ).
122
Определение числа микроорганизмов этим методом включает
три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в
чашки Петри и подсчет выросших колоний.
Приготовление разведений. Численность популяции
микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изоли-
рованных колоний необходимо приготовить ряд последовательных
разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной во-
де или 0,85%-ном растворе NaCl (физрастворе). В ходе опыта
целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведе-
ния, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.
Для приготовления разведений стерильную водопроводную
воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем
1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в
пробирку с 9 мл стерильной воды — это 1-е разведение, 10-1. Полу-
ченное разведение тщательно перемешивают новой стерильной
пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь.
Эту процедуру выполняют 3—5 раз, затем той же пипеткой отби-
рают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку —
получают 2-е разведение (10^2). Таким же образом готовят и пос-
ледующие разведения. Степень разведения зависит от плотности
исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем
больше, чем больше плотность популяции.
Для приготовления каждого разведения следует обязательно
использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом при-
водит к получению ошибочного результата.
Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глу-
бинным способом. Перед посевом поверхностным способом
(рис 56) разливают расплавленную, чаще всего агаризованную,
питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15—20 мл
в каждую Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, по-
ка среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед по-
севом рекомендуется подсушивать для удаления конденсацион-
ной воды.
Среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2—3
суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверх-
ность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем
(0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют
его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды.
Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех послед-
них разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных
высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начи-
нать следует обязательно с большего разведения. Для каждого
разведения используют новый стерильный шпатель. После посева
чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило
0,1, 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в
расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду,
тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку
Петри Среде дают застыть. В случае глубинного посева поль-
123
Рис. 56. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроор-
ганизмов шпателем
зуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах
работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следую-
щих образом. По 1 мл из соответствующего разведения перено-
сят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем
заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до
48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную
среду с посевным материалом легким вращательным движением
чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на го-
ризонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет,
чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.
Для определения количества клеток анаэробных микроорга-
низмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в
анаэростаты. Иногда для определения численности анаэробов
плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность
застывшей среды заливают парафином. Для лучшего рассмотре-
ния колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендует-
ся осветлять. Определение численности экстремальных анаэробов
требует применения техники Хангейта (см. гл. 4).
124
Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганиз-
мов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2—15
суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая
чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отме-
чают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом коли-
честве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитыва-
ют колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иног-
да для подсчета колоний используют специальные полуавтомати-
ческие счетчики.
Лучшим разведением следует считать то, при высеве из кото-
рого в чашке Петри вырастает от 30—50 до 100—150 колоний.
Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти ре-
зультаты для расчета количества клеток в исходном материале
не используют. Результаты параллельных высевов из одного и
того же разведения суммируют и определяют среднее число ко-
лоний, выросший при высеве из разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют
по формуле
V
где М — количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при
высеве разведения, из которого сделан высев; V — объем
суспензии, взятый для посева, в мл; 10п — коэффициент разведе-
ний.
Определение количества клеток высевом в жидкие среды (ме-
тод предельных разведений). Метод используют для подсчета мик-
роорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных
питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго
измеренный объем из различных разведений исследуемого суб-
страта. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых
наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают по табл. 11
наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуе-
мого субстрата. Таким образом, определение количества микроор-
ганизмов методом предельных разведений включает приготовле-
ние разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или
отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного
числа клеток в единице объема исходного субстрата.
Приготовление разведений. Разведения исходной
суспензии готовят, как и для чашечного метода.
Посев в среду и регистрация результатов. Сте-
рильную среду, обеспечивающую рост микроорганизмов, числен-
ность которых хотят определить, предварительно разливают в
пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует
наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого
разведения или из 4—5 последних, причем каждое разведение вы-
севают в 3—5 параллельных пробирок. Количество посевного ма-
териала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеян-
125
to
о
Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема
исходной суспензии (по Мак-Кредн)
Таблица 11
Числовая характерис- тика Наиболее вероятное число микроорганиз- мов при засеве парал- лельных пробирок в числе Числовая характерис- тика Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе Числовая характерис- тика Наиболее вероятное число микроорганиз- мов при засеве парал- лельных пробирок в числе
2 3 4 5 2 3 4 5 2 3 4 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и 12 13 14 15
ООО 0,0 0,0 0,0 0,0 222 110,0 3,5 2,0 1,4 433 30,0
001 0,5 0,3 0,2 0,2 223 — 4,0 1 — 434 — — 35,0
002 — — 0,5 0,4 230 — 3,0 1,7 1,2 440 — .— 25,0 3,5
003 — — 0,7 — 231 «— 3,5 2,0 1,4 441 — — 40,0 4,0
010 0,5 0,3 0,2 0,2 232 — 4,0 — — 442 — — 70,0 —.
011 0,9 0,6 0,5 0,4 240 .— — 2,0 1,4 443 — — 140,0 —
012 — — 0,7 0,6 241 — 3,0 — 444 — — 160,0 —.
013 — — 0,9 — 300 — 2,5 1,1 0,8 451 — — — 4,0
1)20 0,9 0,6 0,5 0,4 301 4,0 1,6 1,1 450 .— — — 5,0
021 —— — 0,7 0,6 302 1— 6,5 2,0 1,4 500 — — — 2,5
022 —— «— 0,9 — 303 — — 2,5 — 501 — .— *— 3,0
030 — 1— 0,7 0,6 310 — 4,5 1,6 1,1 502 — .— .— 4,0
031 — 0,9 — 311 — 7,5 2,0 1,4 503 — .— — 6,0
040 — — 0,9 — 312 — 11,5 3,0 1,7 504 — .— — 7,5
041 — — 1,2 — 313 — 16,5 3,5 2,0 510 — 3,5
100 0,6 0,4 0,3 0,2 320 1 9,5 2,0 1,4 511 — — 4,5
Окончание табл. 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
101 1,2 0,7 0,5 0,4 321 15,0 3,0 1,7 512 6,0
102 .— 1,1 0,8 0,6 322 — — 20,0 3,5 2,0 513 — — 8,5
103 .— — 1,0 0,8 323 — 30,0 — — 520 .— — 5,0
ПО 1,3 0,7 0,5 0,4 320 — 25,0 3,0 1,7 521 .— — 7,0
Ill 2,0 1,1 0,8 0,8 331 — 45,0 3,5 2,0 522 .— — 9,5
112 •— — 1,1 0,8 332 •— 110,0 4,0 —• 523 — — — 12,0
113 — — 1,3 —• 333 — 140,0 5,0 — 525 > - .— — 15,0
120 2,0 1,1 0,8 0,6 340 •— — 3,5 2,0 524 — .— — 17,5
121 3,0 1,5 1,1 0,8 341 — — 4,5 2,5 530 — — — 8,0
122 — «— 1,3 1,0 350 — — —. 2,5 531 — — — 11,0
123 •— — 1,6 — 400 — «— 2,5 1,3 532 — — .— 14,0
130 •— 1,6 1,1 0,8 401 — — 3,5 1,7 533 — —, — 17,5
131 — — 1,4 1,0 402 — — 5,0 2,0 534 — — 20,0
132 — — 1,6 — 403 — — 7,0 2,5 535 — — — 25,0
140 — — 1,4 1,1 410 — — 3,5 1,7 540 — — — 13,0
141 •— — 1,7 — 411 — 5,5 2,0 541 — .— — 17,0
200 2,5 0,9 0,6 0,5 412 — — 8,0 2,5 542 — — — 25,0
201 5,0 1,4 0,9 0,7 413 — — 11,0 — 543 — — — 30,0
202 •— 2,0 1.2 0,9 414 — —. 14,0 — 544 — — — 35,0
2|03 — .— 1,6 1,2 420 — — 6,0 2,0 545 —. .— — 45,0
210 6,0 1,5 0,9 0,7 421 — — 9,5 2,5 550 — — .— 25,0
211 13,0 2,0 1,3 0,9 423 — •— 17,0 — 551 —. — .— 35,0
212 20,0 3,0 1,6 1,2 422 —• — 13,0 3,0 552 —, — — 60,0
213 — — 2,0 — 424 — -— 20,0 — 553 — — .— 90,0
220 25,0 2,0 1,3 0,9 430 —• — 11,5 1,5 554 — — — 100,0
221 70,0 3,0 1,6 1,2 431 — —. 16,5 3,0 555 1 180,0
432 — —. 20,0 4,0
ные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблет-
ся от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов,
численность которых определяют. После инкубации регистрируют
рост микроорганизмов, используя различные показатели: помут-
нение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в
среде определенных продуктов метаболизма.
Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рас-
считывают по таблице Мак-Креди (табл. 11), разработанной на
основании методов вариационной статистики. Для этого первона-
чально составляют числовую характеристику, которая включает
три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том
последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных
пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают
число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при
засеве их из двух последующих разведений. Затем по таблице на-
ходят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствую-
щее данному значению числовой характеристики. Количество
микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует
этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято
для получения первой цифры числовой характеристики.
Пример 1
Разведение исходной суспензии .......... О 10—’ Ш-2 10-3 10-4
Число засеянных пробирок ............... 4 4 4 4 4
Число пробирок, в которых обнаружен рост 4 4 3 1 0
Числовая характеристика ...............431 — — — —
Наиболее вероятное число микроорганиз-
мов ................................. 16,5 — — — —
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл
исходной суспензии ................165
Пример 2
Разведения исходной суспензии ........ Ш-2 10~3 10—4 10—5 10-’
Число засеянных пробирок ............... 3 3 3 3 3
Число пробирок, в которых обнаружен рост 3 3 2 0 0
Числовая характеристика ...............320 — — — —
Наиболее вероятное число клеток микроор-
ганизмов ........................... 9,5 — — — —
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл
исходной суспензии .................9,5 103
ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Точность любого метода определения числа микроорганизмов
ограничена ошибкой метода, которая возникает вследствие слу-
чайного распределения клеток в суспензии и является результатом
ограниченного числа подсчитываемых клеток, а также техничес-
кими ошибками, т. е. неточностью в приготовлении разведений,
неправильным монтажом камеры, повторным учетом одной и той
128
же клетки (колонии) и т. д. Ошибки метода неизбежны, тогда как
технические ошибки зависят главным образом от качества рабо-
ты исследователя. Необходимо помнить, что статистическая обра-
ботка результатов возможна только при минимальной техничес-
кой ошибке. Чашечный метод и метод предельных разведений
требуют особой чистоты и аккуратности при выполнении всех
операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки, пробирки и
среды от заражения микроорганизмами из воздуха, так как каж-
дая случайно попавшая клетка может заметно завысить число
микроорганизмов в исследуемом субстрате.
7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ
Этот метод широко применяют для оценки роста микроорга-
низмов в жидких питательных средах. Можно использовать его
и для определения массы клеток, выращенных на плотной пита-
тельной среде, однако в этом случае микроорганизмы необходимо
предварительно тщательно смыть с поверхности среды физиологи-
ческим раствором или водой и перевести в суспензию. Метод не
может быть использован при культивировании микроорганизмов
на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые
в воде.
Определение биомассы состоит из трех последовательных опера-
ций: доведения массы центрифужных пробирок или фильтров до
постоянного значения, отделения клеток микроорганизмов от
культуральной жидкости, определения их массы. Чаще всего опре-
деляют массу сухих клеток, хотя иногда можно ограничиться опре-
делением сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпа-
дает; достаточно только взвесить центрифужную пробирку
(фильтр), но не доводить ее массу до постоянного значения. Био-
массу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр
культуральной жидкости.
Доведение массы центрифужных пробирок
или фильтров до постоянного значения. С этой
целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку
Петри, или центрифужные пробирки помещают в сушильный
шкаф и высушивают в течение 1—2 ч при температуре 80—85° и
90—100° соответственно. Затем чашку Петри с фильтрами или
центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и пе-
реносят в эксикатор с безводным хлористым кальцием (CaCls)
или концентрированной серной кислотой. Эксикатор ставят около
аналитических весов, на которых будет проводиться взвешива-
ние. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают
с точностью до 0,0001 г. Высушивание и взвешивание повторяют,
соблюдая указанную последовательность операций, пока масса
не достигнет постоянного значения, т. е. колебания в ее опреде-
лениях не превысят ±0,0001 г.
Отделение микроорганизмов от среды возможно
центрифугированием или фильтрованием. Центрифугированием
129
отделяют обычно бактерии. Для этого в центрифужную пробирку
наливают точно измеренный объем тщательно перемешанной
жидкой культуры, который в зависимости от ее плотности колеб-
лется от 5 до 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов
зависят от размеров клеток. Чем они меньше, тем больше требу-
ется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центри-
фугирования. Чаще всего центрифугируют 15—20 мин при
5—10 тыс. оборотов в мин. После центрифугирования надосадоч-
ную жидкость осторожно сливают, осадок промывают слегка под-
кисленной дистиллированной водой (1 мл концентрированной
НС1 на 1 л воды) и снова центрифугируют при том же числе обо-
ротов. Супернатант сливают тотчас после остановки центрифуги.
В противном случае часть осадка может быть потеряна.
Мицелий актиномицетов и грибов отделяют фильтрованием.
Бумажный фильтр помещают в стеклянную воронку и фильтру-
ют через него точно измеренный объем культуры, от 5 до 10 мл.
Осадок на фильтре многократно промывают подкисленной дис-
тиллированной водой.
Для отделения бактерий используют мембранные фильтры.
Размеры пор мембранного фильтра должны быть меньше вели-
чины клеток, биомассу которых определяют (характеристику
фильтров см. гл. 3). Мембранный фильтр помещают на пористую
пластинку специального держателя, вставленного в колбу. Чтобы
ускорить фильтрование, колбу подключают к водоструйному на-
сосу. Осадок несколько раз промывают подкисленной дистилли-
рованной водой. Подробно порядок работы с мембранными фильт-
рами см. гл. 3.
Определение биомассы. Чтобы определить массу су-
хих клеток, центрифужную пробирку или фильтр с осадком кле-
ток микроорганизмов помещают в сушильный шкаф, высушива-
ют и взвешивают. Режим высушивания и взвешивания тот же,
который использовали и при определении массы пробирок или
фильтров. Сухую биомассу определяют по формуле
м = (А—5)1000
V
где М — сухая биомасса в г/л; А — масса центрифужной пробир-
ки (фильтра) с осадком в г; В — масса центрифужной пробирки
(фильтра) без осадка в г; V — объем культуральной жидкости,
взятый для центрифугирования (фильтрования) в мл. Точность
метода определяется полнотой отмывания клеток от компонентов
среды и тщательностью взвешивания.
7 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И БИОМАССЫ
НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Оптический (нефелометрический, турбидиметрический) метод
определения биомассы нашел широкое применение в лаборатор-
ных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет
130
быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в сус-
пензии или культуральной жидкости.
В основе метода лежит измерение уменьшения количества
света при его прохождении через суспензию клеток. В определен-
ных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием све-
та клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого
показателя зависит от многих факторов (формы и размеров кле-
ток, оптических свойств культуральной среды, длины волны па-
дающего света и т. д.). Поэтому нефелометрический метод приго-
ден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает рав-
номерное помутнение среды и не сопровождается заметным изме-
нением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок
или других скоплений.
Питательная среда для культивирования микроорганизмов,
в которой предполагается определять число клеток по светорас-
сеянию, должна быть оптически прозрачной. Если мутность среды
связана с выпадением в осадок некоторых солей, чаще всего фос-
фатов, то перед измерением светорассеяния ее подкисляют нес-
колькими каплями концентрированной соляной кислоты.
Изменение интенсивности света при прохождении через сус-
пензию клеток измеряют с помощью фотоэлектроколориметра
(ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в
интервале 540—650 нм), при которой поглощение света данной
суспензией клеток является минимальным. Так, рассеяние света,
вызываемое суспензией клеток в мясо-пептонном бульоне или
сусле, наиболее удобно измерять с красным фильтром, при кото-
ром оптическая плотность таких сред минимальна. При высоких
концентрациях клеток в культуральной среде происходит вторич-
ное рассеяние света, что приводит к получению заниженных ре-
зультатов. Поэтому суспензии больших плотностей перед^ измере-
нием светорассеяния следует разводить средой или водой. Раз-
бавление проб одной и той же культуры разными жидкостями не-
допустимо, так как набухание и сжатие клеток влияет на величи-
ну светорассеяния.
Правила работы на фотоэлектроколориметре и порядок изме-
рения величины светорассеяния подробно изложены в инструк-
ции, прилагаемой к прибору.
В некоторых случаях плотность клеточной суспензии выража-
ют в показаниях нефелометра. Однако чаще строят калибровоч-
ные кривые зависимости между величиной светорассеяния и чис-
лом клеток или сухой биомассой в единице объема. Для построе-
ния калибровочной кривой поступают следующим образом. Изме-
ряют величину светорассеяния суспензий с различным содержа-
нием клеток и в каждой из них определяют одним из применяемых
методов количество клеток или биомассу. Полученную зависи-
мость выражают графически, откладывая на оси ординат показа-
ния ФЭК, а на оси абсцисс — количество клеток, содержащихся
в 1,0 мл суспензии, или биомассу в г/л. Для каждого микроорга-
низма следует строить свою калибровочную кривую.
131
7.3.1. Стандарты мутности и их применение
В ряде случаев количество клеток в суспензии бывает доста-
точно определить визуально путем сравнения со стандартом мут-
ности. Стандарты мутности, выпускаемые государственным НИИ
стандартизации и контроля медицинских и биологических препа-
ратов им. Л. А. Тарасевича, представляют собой взвесь частиц
стекла пирекс в дистиллированной воде. За единицу стандарта
мутности общего назначения условно принята мутность суспензии
в физиологическом растворе бактерий — возбудителей тифа с кон-
центрацией клеток 100 млн/мл. Стандарт мутности включает 4
эталона на 10, 11, 9 и 5 единиц, что соответствует содержанию
1-Ю9; 1,1 109; 0,9-109 и 0,5109 клеток в 1 мл взвеси. Для опреде-
ления количества клеток пробирку с исследуемой суспензией ста-
вят рядом с эталоном 10 и рассматривают их в отраженном и
проходящем свете на фоне белого листа бумаги, в центре кото-
рого нанесено несколько черных линий. Эталоны 9 и 11 являются
вспомогательными и позволяют более четко сравнить мутность
исследуемой суспензии с эталоном. Стандартизация мутности
суспензии бактерий (особенно часто в случае тест-организмов)
имеет существенное значение при приготовлении посевного мате-
риала в серийных опытах, например, при определении антибио-
тической активности препаратов методом диффузии в агар.
ГЛАВА 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМОВ
8.1. МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК
В большинстве экспериментов для выделения и определения
внутриклеточных компонентов применяют различные методы раз-
рушения микроорганизмов. Это могут быть ручные и механические
гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание за-
мороженных клеток, перемешивание биомассы со стеклянными
бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае
применения декомпрессионных методов (Х-пресс,Френч-пресс) или
ультразвука. Реже применяют осмотический шок и метод замора-
живания-оттаивания. Описаны также комбинированные методы
разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных
стенок ферментами с последующим осмотическим шоком получен-
ных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогени-
заторе.
В зависимости от вида микроорганизма применяют различные
способы их отделения от среды. Такие способы включают исполь-
зование сепараторов для крупных микроорганизмов, осаждение их
фильтрованием через ткань (грибной мицелий) и применение
различного рода центрифуг, позволяющих осаждать клетки с
охлаждением или без него. В зависимости от величины объектов,
целей эксперимента и термолабильности выделяемых структур
применяют низкоскоростное или высокоскоростное центрифугиро-
вания в периодическом или непрерывных режимах. Для крупных
и тяжелых клеток бывает достаточным короткое осаждение при
2—3 тыс. g, тогда как мелкие и легкие клетки требуют длитель-
ного центрифугирования при 15—20 тыс. g. Необходимо учиты-
вать возможный нагрев биологического материала при высокоско-
ростном центрифугировании объектов без соответствующего ох-
лаждения.
Отделенную от культуральной жидкости биомассу 2—3 раза
промывают для удаления следов среды продуктов метаболизма,
суспендируя каждый раз в свежей среде (обычно без источника
углерода) или в буферном растворе. Экстракт, полученный после
разрушения клеток, отделяют от неразрушенных клеток и крупных
обломков центрифугированием с охлаждением от 10 мин при
15 тыс. g до 1 ч при 40 тыс. g в зависимости от целей экспери-
мента. Супернатант, называемый грубым, или исходным, экстрак-
том, можно затем повторно центрифугировать при 150—200 тыс. й
133
в течение 1,5—2 ч для получения прозрачного экстракта клеток
и осадка клеточных мембран. Если при этом исходный экстракт
содержит плавающие на поверхности частицы, их можно удалить
фильтрованием через ткань или стеклянную вату.
8,1.1. Гомогенизация
Гомогенизацию можно использовать для микроорганизмов с
тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки или для
животных и некоторых растительных клеток. Порции биомассы,
суспендированные в буферном растворе (3—5 объемов), переносят
в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10—
20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с бы-
стро вращающимися ножами («блендеров») время обработки
обычно не превышает 1—2 мин с интервалами по 20 с промежу-
точным охлаждением биомассы на льду.
Зазор между стеклянной стенкой и тефлоновым пестиком руч-
ного гомогенизатора должен быть в пределах 0,35—0,70 мм. Ме-
ханический гомогенизатор можно охлаждать в воде со льдом для
поддержания низкой температуры при разрушении клеток (в этом
случае резко снижается активность внутриклеточных протеиназ)
или проводить эксперимент в холодной комнате. Степень разру-
шения контролируют в фазово^контрастном микроскопе или по
белку, высвобожденному из клеток.
8.1.2. Растирание клеток
Одним из простых, но достаточно надежных способов разру-
шения клеток микроорганизмов является растирание их суспензий
с абразивами. Для этой цели применяют промытый кварцевый
песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия или дру-
гие твердые вещества. При разрушении к клеточной пасте посте-
пенно добавляют двойное количество (по массе) абразива и рас-
тирают с силой до появления щелкающих звуков (обычно 10—
15 мин после добавления последней порции абразива). В процессе
растирания клеточная паста подвергается нагреву, поэтому дно
ступки следует охлаждать (на лотке со льдом).
Особо следует отметить способ растирания клеток микроорга-
низмов, замороженных в жидком азоте, где в качестве разруша-
ющего абразива выступают кристаллики льда, образовавшиеся при
быстром замораживании биомассы (вкапывание суспензии в буфе-
ре в толстостенную ступку с налитым жидким азотом). При расти-
раниях применяют обычно фарфоровые ступки и пестики. Время
обработки зависит от толщины клеточных стенок разрушаемого
микроорганизма. Этими способами можно растирать до 30 г сырых
клеток за один прием. После растираний к полученной массе до-
бавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для
удаления абразивов, неразрушенных клеток и крупных их облом-
ков.
134
8.1.3. Разрушение со стеклянными бусами
Данный метод можно применять даже для разрушения клеточ-
ных стенок дрожжей, у которых она очень прочная, поскольку он
основан на механическом растирании клеток, попадающих между
двумя мелкими стеклянными шариками, вращающимися с большой
скоростью в механических мельницах. Малые порции биомассы
можно разрушать и в пробирке, используя пробирочный смеситель
(«вортекс»). Для больших порций клеток необходимо применять
специальные механические смесители («мельницы»).
Отмытые клетки ресуспендируют в равном объеме буфера и
помещают в прочную центрифужную пробирку с навинчивающейся
пробкой для предотвращения вытекания жидкости при встряхива-
нии. В пробирку добавляют 1—3 г охлажденных стеклянных ша-
риков на каждый грамм клеточной массы и встряхивают на сме-
сителе с максимальной скоростью 3—5 раз в течение 1 мин. В ин-
тервалах суспензию охлаждают на льду. Для микроколичеств
применяют пробирки Эппендорф.
Стеклянные шарики перед опытом отмывают концентрирован-
ной соляной кислотой (или хромовой смесью), водопроводной, а
затем дистиллированной водой до нейтральной реакции и высу-
шивают в сушильном шкафу. К недостаткам метода относится
сильный разогрев содержимого при встряхивании.
8,1.4. Обработка ультразвуком
Ультразвук разрушает микроорганизмы в результате создания
высокой степени вибрации и вследствие этого происходит механи-
ческий разрыв клеток. Для достижения максимального эффекта
необходимо применять высокую мощность излучателя и тщатель-
но настраивать его в резонанс с пробой. Следует контролировать
уровень пенообразования и перемешивания при обработке, по-
скольку интенсивное пенообразование приводит к денатурации
белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жид-
кость/газ. Внутренние структуры клеток при этом также подвер-
жены разрушению.
Кончик пестика излучателя должен быть опущен в обрабаты-
ваемую суспензию на глубину 1—2 см. Перед началом обработки
излучатель должен быть настроен в резонанс при выбранной мощ-
ности на порции подвергаемой обработке пробы или другой сход-
ной по вязкости суспензии в сосуде, используемом для озвучива-
ния. Обычно обработку проводят в пластиковых (полиэтиленовых)
центрифужных стаканах, но можно использовать и стеклянные
стаканы или стаканы из нержавеющей стали. Необходимым усло-
вием является строгий контроль за нагревом излучателя и темпе-
ратурой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной
водопроводной водой, а пробу — в воде со льдом.
Клетки для разрушения суспендируют в двух или более объе-
мах соответствующего буфера (см. Приложение) и охлаждают на
135
льду. Время облучения варьируют от 2 до 15 мин, однако интер-
валы непрерывной работы обычно не превышают 30 с. В переры-
вах между разрушениями пробу и излучатель охлаждают ледяной
водой. Степень и полноту разрушения контролируют микроскопи-
рованием суспензии. За одну обработку можно разрушить примерно
1 г сухой биомассы.
Описанным методом можно разрушать как многие грамполо-
жительные, так и грамотрицательные бактерии, но клетки акти-
номицетов, дрожжей и других грибов таким методом разрушаются
с трудом. Иногда для усиления эффекта ультразвуковой обработки
к суспензиям клеток добавляют кварцевый песок, стеклянные бусы
малого диаметра или пудру окиси алюминия.
8.1.5. Френч-пресс
Ячейка Френч-пресса (Френч-пресс) предназначена для разру-
шения микроорганизмов, основанного на перепаде давления в
пробе от высокого (550—1400 атм) к атмосферному. Быстрое из-
менение давления взрывает клетки изнутри и таким образом раз-
рушает их. Метод наиболее применим к суспензиям объемами от
10 до 30 мл; разрушение меньших объемов сложно технически, а
больших—-занимает много времени. Время, требуемое для разру-
шения одной порции клеток небольшого объема, обычно не пре-
вышает 10—15 мин. В перерывах необходимо тщательно промы-
вать ячейку от предыдущей пробы и постоянно контролировать
состояние полиэтиленового шарика, регулирующего на ячейке
степень перепада давления.
Перед разрушением клеточную пасту смешивают с буферным
раствором в соотношении от 1:1 до 1:4 г/мл. Суспензию помещают
в ячейку и ставят в гидравлический пресс под давление. Медлен-
ным открыванием клапана устанавливают требуемую скорость
вытекания разрушенного гомогената (обычно 1 капля/с). Для
некоторых микроорганизмов необходима двойная или даже трой-
ная обработка, чтобы достичь необходимую степень разрушения.
Ячейку перед заполнением суспензией необходимо охлаждать в.
ледяной воде. Степень разрушения контролируют микроскопи-
рованием или по увеличению вязкости жидкости (в результате
выхода ДНК).
8.1.6. Х-пресс
Разрушение клеток с применением Х-пресса основано на том
же принципе, что и на Френч-прессе, за исключением состояния
разрушаемой суспензии. Перед разрушением приготовленную сус-
пензию клеток в буфере замораживают в ячейке при —70° и за-
тем продавливают через тонкую фильеру с помощью гидравличес-
кой системы. Микроорганизмы при этом подвергаются перепаду
давления от 500 до 1000 атм и дополнительно абразивному дейст-
вию кристалликов льда внутри клеток. Под действием давления
136
(обычно это усилие до 20 т на шкале гидравлического пресса)
происходит постепенный разогрев замороженного образца. Когда
температура суспензии поднимается до —10...—15°, начинается
продавливание пробы через фильеру. На этом этапе для макси-
мального разрушения необходимо поддерживать давление по ма-
нометру на уровне 10—15 т. О конце процесса судят по степени
вхождения поршня в ячейку. Этим методом можно разрушить за
один прием до 10 г сырых клеток (количество зависит от разме-
ров ячейки для разрушения). Метод не удобен для многократного
разрушения клеток, поскольку приходится замораживать и отта-
ивать ячейку. Обычно время разрушения пробы не превышает
15—20 мин.
8.1.7. Лизис клеток с применением ферментов
Разрушение (лизис) клеточных стенок с применением детер-
гентов и ферментов проводят обычно с небольшими порциями био-
массы, причем эти методы дают более стандартную обработку для
каждой клетки в суспензии, так как концентрации детергентов и
ферментов практически одинаковы в любой порции пробы. Как
правило, время лизиса не превышает 15—30 мин Рассмотрим этот
метод на примере Escherichia roii. Для лизирования клетки сус-
пендируют в ТЕ-буфете (50 мМ трис-НСЛ. pH 8,0 и 10 мМ.
ЭДТА) из расчета 3 мл буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают
до 37°. Добавляют 1 мл раствора лизоцима (свежеприготовленный
раствор в ТЕ-буфере, 10 мг/мл) на каждые 5 мл суспензии или
эквивалентное количество сухого лизоцима и инкубируют 10—
20 мин при 37° с легким покачиванием. Быстрее клетки лизируются
при повышении действующей концентрации лицозима до 10 мг/мл.
В таких условиях удовлетворительного лизиса можно достичь в
течение 5 мин даже при 4°.
Для получения сферопластов дрожжей суспензии их клеток
могут быть подвергнуты лизису с помощью препарата ферментов,
выделенных из содержимого желудка виноградной улитки. Такой
«улиточный фермент» в течение короткого времени при 37—40°
лизирует, например, клеточную стенку дрожжей рода Saccha-
romyces. Препарат фермента готовят в лаборатории из свежесоб-
ранных улиток и хранят в замороженном состоянии, используя по-
потребности.
8.1.8. Лизис клеток с помощью детергентов
Это — наиболее мягкий и быстрый способ разрушения клеток
по сравнению с другими методами (занимает от 20 до 90 мин),
однако применим лишь для микроорганизмов, лишенных клеточ-
ной стенки. Перед лизисом клетки промывают несколько раз за-
буференным солевым раствором (например, ЮмМ трис-НС1, pH
7,5 с 150 мМ NaCl). После последнего центрифугирования био-
массу суспендируют до плотности 107—108 кл/мл или 3—4 мг
137
сухих клеток на 1 мл в том же буфере, с добавлением 0,1—0,3%
тритона Х-100. Содержимое перемешивают и инкубируют на льду
от 10 до 90 мин. Для стабилизации белков в экстракт добавляют
0,2 объема 50%-ного глицерола. Вместо тритона Х-100 могут
быть использованы и другие неионпые детергенты.
8.1.9. Лизис клеток в присутствии органических растворителей
Лизирование клеток органическими растворителями обычно
применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах с
целью проведения реакций с антителами или гибридизаций с про-
бами нуклеиновых кислот. Для проведения такой обработки чаще
всего используют невысокие концентрации толуола (0,1—1,0%) в
соответствующем буфере.
8.1.10. Лизис осмотическим шоком
Этот метод применим для клеток с тонкой стенкой или ли-
шенных ее, а также для лизирования протопластов и сфероплас-
тов микроорганизмов. «Нагруженные» высокой концентрацией со-
ли или углеводов клетки подвергают ферментативному лизису в
присутствии лизоцима и затем разводят в 10—50 раз дистиллиро-
ванной водой. Действующие концентрации в значительной степени
зависят от свойств исследуемого внутриклеточного фермента, вида
микроорганизма, соединения, примененного для создания высокого
осмотического давления внутри клеток и других факторов.
8.1.11. Лизис с помощью замораживания оттаивания
Этот метод (многократное замораживание, например, в ванне
с жидким азотом, и оттаивание, например, в теплой воде) —бы-
стрый, удобный, относительно дешевый — позволяет обрабатывать
одновременно большое количество биомассы и дает легко воспро-
изводимые результаты, однако имеет свои ограничения. Клетки,
разрушаемые таким способом, должны обладать не очень прочной
стенкой или не содержать ее, а интересуемые внутриклеточные
компоненты должны быть относительно стабильны к подобного
рода обработке, не подвержены денатурации и защищены от
протеолиза.
8.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА
Содержание белка можно измерять непосредственно в нерас-
сеивающих (истинных) растворах или после проведения гидролиза
клеток и отдельных клеточных структур. Для каждого экспери-
мента выбирают методы, которые удовлетворяют по скорости,
точности и удобству измерений. При определении строят калибро-
вочные кривые, анализируя известное количество белка в тех же
условиях, что и опытные пробы. Если перед проведением опреде-
138
ления содержания белка требуется гидролиз материала, необхо-
димо в тех же условиях провести и гидролиз стандарта, исполь-
зуемого для построения калибровочного графика. Во всех случаях
необходимо учитывать только те значения графика, которые ле-
жат в области 0,1—0,7 оптической единицы в кювете с длиной оп-
тического пути 1 см, при этом значения поглощения опытных об-
разцов должны находиться в пределах полученных эксперимен-
тальных точек калибровочного графика. В необходимых случаях
проводят кратные разведения исходного материала. Калибровоч-
ные кривые строят с использованием растворов альбуминов —
бычьего сывороточного, яичного или из сыворотки человека.
8.2.1. Измерение поглощения при 280 нм
Это наиболее простой и быстрый метод измерения количества
белка в содержащих его нерассеивающих растворах. Преимуще-
ствами метода является быстрота и неизменность пробы до и по-
сле анализа. К недостаткам следует отнести то, что метод не яв-
ляется строго количественным, так как основан на поглощении
тирозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков. По-
этому различные белки имеют разные коэффициенты поглощения,
а если белок не содержит вышеуказанных аминокислот, то он не
будет поглощать при 280 нм. Метод применим для измерения кон-
центраций белка и в растворах смесей белков.
Для большинства рутинных измерений можно с большой веро-
ятностью допустить, что поглощение при 280 нм раствора белка
с концентрацией 1 мг/мл даст значение Агво около 1 в кювете с
рабочим расстоянием 10 мм. Более скрупулезные исследования
показывают, однако, что поглощение одинаковых по концентрации
белков может значительно различаться (табл. 12).
Область чувствительности метода лежит в пределах от 0,2 до
2,0 мг белка/мл, а в микрокюветах возможно измерение 0,1 мл
пробы (~0,05 мг белка). Для измерения необходим спектрофото-
метр, позволяющий регистрировать ближнюю ультрафиолетовую
область спектра,
кварцевые кюветы Таблица 12
и пипетки для пере- Различия в поглощении растворов некоторых
носа образцов. __________________белков__________________
При измерении
выставляют значе-
ние спектрофото-
метра при 280 нм
на О' поглощения в
кювете с экспери-
ментальным буфер-
ным раствором, за-
тем в той же или
аналогичной кюве-
те измеряют погло-
Белок Aeeo (1 мг/мл)
Бычий сывороточный альбу-
мин (БСА)
Рибонуклеаза А
Яичный альбумин
Энтеротоксин
у-Глобулин
Трипсин
Химотрипсин
а-Амилаза
0,70
0,77
0,79
1,33
1,38
1,60
2,02
2,42
139
щение раствора белка в таком же буфере. В случае измерения
на двухлучевом спектрофотометре устанавливают значение прибо-
ра на 0 при 280 нм и измеряют образец против контроля с соот-
ветствующим буферным раствором.
Стеклянные и пластиковые кюветы значительно поглощают
ультрафиолетовый свет и не пригодны при измерении белка вы-
шеописанным методом. Если поглощение слишком велико, можно
использовать кюветы с более короткими рабочими расстояниями,
когда разбавление пробы нежелательно.
Оптический метод широко используется для быстрого нераз-
рушающего определения концентрации белков, например при ко-
лоночной хроматографии белков. Однако не любое поглощение
при 280 нм можно принимать за белковое, так как нуклеиновые
кислоты (максимум поглощения при 260 нм) могут вносить значи-
тельный влад в абсорбцию, если присутствуют в пробе. Если из-
меряемый образец сильно загрязнен нуклеиновыми кислотами, то
более точно концентрация белка вычисляется по формуле, учиты-
вающей вклад абсорбции при 260 нм (нуклеиновые кислоты):
концентрация белка (мг/мл) = 1,5 А28о—0,75 А28о.
Результаты экспериментов показывают, что если отношение
Амо—А26о около 2,0, то содержание нуклеиновых кислот в пробе
измеряемых белков незначительно. При высоком содержании нук-
леиновых кислот в пробе гораздо более специфичным является
определение белка по Брэдфорду.
8.2.2. Определение белка по Брэдфорду
Это быстрый и удобный метод измерения концентрации раст-
воренных белков, основанный на количественном связывании бел-
ков с красителем. Он не применим для измерения белка в рассеи-
вающих образцах. Хотя число соединений, мешающих определе-
нию белка этим методом сравнительно невелико, краситель реа-
гирует более или менее сильно с различными очищенными белка-
ми. Поэтому определение концентрации различных по составу
белков этим методом лишь до некоторой степени количественное.
К преимуществам метода можно отнести быстроту определения
(10 мин) и высокую чувствительность. К недостаткам — варьи-
рование результатов при определении концентраций различных
белков и необратимое денатурирование порции белка, пошедшей
на определение.
Для определения требуется спектрофотометр или ФЭК (длина
волны максимума поглощения 595 нм), кюветы (можно пластико-
вые), пипетки, пробирки, штатив для пробирок. В качестве стан-
дарта применяют бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) или
яичный альбумцн, который дает более точные результаты.
Стандартный исходный раствор содержит 350 мг краски
(Serva Blue G или Brilliant Blue R, Sigma), 100 мл 95%-ного
140
этанола и 200 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты. Данный ра-
створ стабилен при комнатной температуре. Рабочий раствор сос-
тоит из 30 мл стандартного исходного раствора, 15 мл 95%-ного
этанола, 30 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты и 425 мл дис-
тиллированной воды. Рабочий раствор пропускают через фильтр
№ 1 (Whatman). Он хранится при комнатной температуре в за-
темненной бутыли в течение нескольких недель с периодическим
фильтрованием.
Для определения в пробу белка (100 мкл максимум) добавляют
буфер до 100 мкл (если требуется) и 1 мл рабочего раствора
краски, перемешивают и после 2 мин инкубации определяют оп-
тическую плотность раствора при 595 нм. Оптическая плотность
может измениться через 1 ч с момента добавления раствора крас-
ки.
Стандартную кривую строят по растворам яичного альбумина
(или бычьего сывороточного) с содержанием белка от 2 до
20 мкг/100 мкл пробы (20—200 мкг/мл). Значения оптической
плотности в этом случае должны быть в пределах 0,1—0,7 ед. при
595 нм.
8.2.3. Определение белка по Лоури
Этот метод определения белка был предложен Лоури с соавт.
в 1951 г. и с тех пор широко используется в лабораторной прак-
тике. К преимуществам метода относятся его универсальность и
точность, а к недостаткам — отрицательное влияние многих соеди-
нений, что может быть преодолено осаждением белка из раствора
перед определением, медленное развитие цветной реакции, неста-
бильность некоторых реактивов, а также необратимая денатура-
ция порции белка, пошедшей на определение. Чувствительность
метода от 5 до 100 мкг белка/мл.
Для определения требуется спектрофотометр или .ФЭК (длина
волны максимума поглощения 750 нм), кюветы (можно пластико-
вые), пипетки, пробирки, штатив для пробирок. В качестве стан-
дарта можно применять бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл),
однако яичный альбумин дает более правильные результаты. Ни-
же приведена современная модификация метода. Для определения
готовят рабочие растворы А, В, С и D. Раствор А содержит 0,5 г
CuSO4-5H2O и 1 г Na3C6H5O7-2H2O (цитрат натрия) на 100 мл
дистиллированной воды. Раствор В содержит 20 г Na2CO3 и 4 г
NaOH в 1 л дистиллированной воды, растворы А и В устойчивы
при комнатной температуре. Раствор С состоит из 50 мл раствора
В и 1 мл раствора А (готовят перед определением). Раствор D
представляет собой разведенный в 2 раза дистиллированной водой
перед определением реактив Фолина (приготовление реактива Фо-
лина см. в Приложении, с. 212).
Процедура определения состоит в смешивании 0,5 мл пробы,
белка и 2,5 мл раствора С. После перемешивания и инкубации
141
при комнатной температуре 5—10 мин добавляют 0,25 мл раство-
ра D, перемешивают, выдерживают при комнатной температуре
20—30 мин и измеряют оптическую плотность раствора при 750 нм.
Проба белка может быть отделена от мешающих определению
веществ осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Этим же
способом можно пользоваться при определении белка в сильно
разбавленных растворах (менее 1 мкг/мл). Для осаждения к пробе
белка в 1 мл добавляют 0,1 мл 0,15%-ного раствора дезоксихола-
та натрия (ДХН), перемешивают и выдерживают при комнатной
температуре 10 мин. К смеси добавляют 0,1 мл 72%-ной ТХУ,
перемешивают и выпавший осадок отделяют центрифугированием
при 1—3 тыс. g в течение 5—30 мин. При использовании угло-
вых роторов, низких температурах или больших объемах время
осаждения увеличивают. После осаждения надосадочную жидкость
сливают и отбрасывают, осадок перерастворяют в реактиве С.
Метод применим и для определения белка в гидролизатах кле-
ток микроорганизмов. Для гидролиза применяют 2 М КОН и ве-
дут его при 37° в течение 2 ч, ночь при комнатной температуре или
10 мин на кипящей водяной бане.
Время развития цветной реакции обычно не превышает 20—
30 мин, после добавления реактива D, затем оптическая плотность
уменьшается примерно на 1 % в час. Большинство мешающих оп-
ределению веществ снижает развитие окраски, однако некоторые
детергенты могут наоборот ее усилить.
8.3. АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Анализ нуклеиновых кислот получил широкое распространение
при идентификации и систематике прокариот, поскольку вся или
основная генетическая информация заключена в 1 молекуле ДНК-
Это делает возможным ее изучение без опасения загрязнейия дру-
гими. ДНК (митохондриальной, хлоропластной), как может быть
в случае эукариотных организмов.
Геномы различных бактерий сравнивают по их размерам, об-
щему содержанию оснований ДНК (молярная доля гуанина и
цитозина в ДНК, %) по последовательностям нуклеотидов рибо-
сомных РНК и степени гибридизации нуклеиновых кислот. Для
разных прокариот установлены границы молярного содержания
ГЦ в ДНК от 23 до 75%. Значение ГЦ постоянно для данного
микроорганизма. Если по этой характеристике штаммы значи-
тельно отличаются (более чем на 10%), то это свидетельствует,
что они относятся к разным родам. Однако близкие значения ГЦ
в ДНК не обязательно говорят о филогенетическом родстве, по-
скольку организмы могут значительно отличаться по последова-
тельностям нуклеотидов в ДНК. Поэтому более важным является
сравнение гомологии участков ДНК или РНК изучаемых видов.
Достаточно простыми и доступными являются методы гибридиза-
ции ДНК—ДНК или ДНК—рРНК сравниваемых объектов, кото-
рые используют после их выделения и очистки.
142
8.3.1. Выделение и очистка ДНК
Для выделения нуклеиновых кислот из клеток обычно приме-
няют мягкие методы их разрушения, включающие использование
детергентов и лизоцима, хотя для разрушения некоторых микро-
организмов с прочными клеточными стенками может понадобиться
пресс, стеклянные бусы или растирание клеток с абразивами (см.
раздел 8.1.2). В некоторых случаях для «ослабления» клеточных
стенок в растущие культуры (например, грамположительных бак-
терий) добавляют глицин, лизин или треонин. Иногда для тех же
целей клетки грамположительных бактерий в растущих культурах
обрабатывают антибиотиками, такими как пенициллин С или ме-
тициллин, которые подавляют биосинтез пептидогликана клеточной
стенки. Чувствительность к лизоциму микобактерий, содержащих
высокий процент липидов и полисахаридов в клеточной стенке,
может быть усилена их обработкой изопропанолом. При лизисе
микроорганизмов, имеющих особенно прочные клеточные стенки,
применяют поли (этиленгликоль) с последующим удалением из
лизата, так как его присутствие мешает проведению дальнейшей
очистки ДНК-
Очистку ДНК из разрушенных клеток ведут последователь-
ным отделением от белков обычно с использованием смесей хло-
роформ-изоамиловый спирт или фенол-хлороформ и многократным
переосаждением ДНК этанолом. От следов РНК препараты ДНК
освобождают с помощью РНКазы, а от следов белка — с помощью
протеаз. ДНК сушат под вакуумом и хранят при 4°.
8.3.2. Определение нуклеотидного состава ДНК
Для определения молярного содержания ГЦ (%) в ДНК чаще
всего применяют два метода: основанный на измерении плавучей
плотности или анализе кривых температуры плавления (Тт)
выделенных ДНК. В качестве стандарта в обоих случаях приме-
няют ДНК известного состава, выделенную тем же методом. Оба
метода быстрые и дешевые, хотя более точным является метод
фракционирования ДНК на основания и количественное опреде-
ление каждого нуклеотида в отдельности с использованием хро-
матографии на бумаге. Однако этот метод более длителен, тру-
доемок и для получения воспроизводимых результатов необходи-
ма тщательная очистка препарата ДНК от РНК-
Различия в спектрах поглощения очищенных ДНК также мо-
гут быть использованы при определении их состава в сравнении с
препаратом ДНК известного процентного содержания ГЦ. Этот
метод дает быстрое и точное определение. Он считается удобной
альтернативой, если оборудование для определения плавучей плот-
ности или термальной денатурации ДНК недоступно.
Метод тепловой денатурации основан на разрушении водород-
ных связей между комплементарными цепями нативной ДНК и их
расхождении друг от друга при повышении температуры раство-
143
ра ДНК. Однонитевые ДНК имеют поглощение при 260 нм при-
мерно на 40% больше, чем двунитевые. При нагревании раствора
ДНК процент однонитевых ДНК увеличивается и наблюдается
увеличение поглощения при 260 нм (гиперхромизм). Термостабиль-
ность водородных связей между гуанином и цитозином в ДНК
выше по сравнению со связями между аденином и тимином. По-
этому, чем выше содержание Г + Ц пар в молекуле ДНК, тем
больше энергии требуется для расхождения нитей. После расхож-
дения цепей ДНК поглощение при 260 нм раствора с повышением
температуры не увеличивается. Значение температуры плавления
(Тт) соответствует температуре, при которой в растворе содер-
жится 50% разошедшихся нитей ДНК (температура 50%-ного
гиперхромизма). Эти значения линейно соответствуют молярному
содержанию ГЦ в ДНК между 30 и 70%.
Широко используют следующую модификацию этого метода.
Раствор ДНК доводят до плотности приблизительно 25 мкг/мл
(Агбо=0,50) в 1-сантиметровых кварцевых кюветах с герметичны-
ми крышками и термопарой (фиксирующей температуру), конец
которой должен быть непосредственно под поверхностью раство-
ра. Кюветы помещают в регистрирующий спектрофотометр с тер-
мостатирующим устройством. Температуру устанавливают равной
25° и регистрируют поглощение в опытной кювете при 260 нм про-
тив контрольной с растворителем. Температуру медленно повы-
шают (0,5°/мин) и проводят постоянную регистрацию изменения
поглощения. Значение температуры, дающее 50%-ное увеличение
поглощения, будет соответствовать значению Тт для данной ДНК.
Поскольку значения молярного содержания ГЦ (%) и Тт свя-
заны линейно, то расчет для неизвестной ДНК производится срав-
нительно просто. На расчеты влияют концентрации буферных ра-
створов, в которых проводят измерения, так как значение Тт ло-
гарифмически зависит от концентрации иона натрия в растворе.
Наиболее широко применяемым при измерении значений тепловой
денатурации буфером является цитратно-солевой (1-SSC, 0,015 М
тризамещенного цитрата натрия в 0,15 М NaCl, pH 7,0). Для этого
буферного раствора установлено следующее соотношение:
молярное содержание ГЦ, % =2,44 Тт— 169,00.
В случае ДНК с высокими молярными ГЦ, % используют более
разбавленные буферные растворы, например 0,33 или 0,1-кратный
раствор SSC. Для таких растворов уравнения выглядят следую-
щим образом:
0,33-SSC : молярное содержание ГЦ, % =2,47 Тт—135,14;
0,1-SSC : молярное содержание ГЦ, % =2,08 Тт—106,40.
С целью воспроизводимости результатов, проверки метода и
аппаратуры необходимо регулярно определять данным методом
содержание ГЦ в ДНК из Е. co/i'ATCC 11775, поскольку этот
штамм является международным стандартом и Тт его ДНК в
1-SSC равна 90,5°, а значение плавучей плотности —1,710.
144
Метод определения состава ДНК по плавучей плотности осно-
ван на том, что если раствор ДНК подвергнуть высокоскоростно-
му центрифугированию в градиенте плотности CsCl, то через оп-
ределенное время она займет в градиенте место, соответствующее
своей плавучей плотности. Значение плотности ДНК в середине
пика, формируемого в центрифужной пробирке, называется плаву-
чей плотностью ДНК- Она линейно зависит от молярного содер-
жания ГЦ, %. Метод был впервые описан в 1962 г. и с тех пор не
претерпел значительных модификаций.
Измерение плавучей плотности ДНК производят следующим
образом. Сухой CsCl растворяют в буфере (50 мМ трис-HCl, pH
7,3) до плотности 1,7 г/см3 и вносят 2—3 мкг исследуемой и репер-
ной (с известным составом) ДНК. Растворы переносят в чистые и
сухие центрифужные пробирки, помещают в аналитическую цент-
рифугу и центрифугируют при 150 тыс. g в течение 20 ч при 25°.
За это время градиент обычно формируется полностью.
Плавучая плотность неизвестной ДНК рассчитывается с ис-
пользованием расстояния между серединой ее пика и серединой
пика реперной ДНК на градиенте плотности CsCl. Маркерная
ДНК должна быть выбрана заранее, чтобы ее пик не перекрывал
пик определяемой ДНК. Нуклеотидный состав ДНК и ее плотность
(Р) связана следующей зависимостью:
Р = 1,660+0,098 (Г + Ц).
8.3.3. Гибридизация нуклеиновых кислот
Методы гибридизации ДНК/ДНК и ДНК/рРНК получили в
последние годы широкое распространение при идентификации но-
вых штаммов бактерий. Они позволяют* установить степень гене-
тического родства изучаемого штамма с определенным родом,
видом или выявить штаммовые различия. Принцип метода за-
ключается в денатурации выделенной двухцепочечной ДНК нагре-
ванием и фиксации разошедшихся цепей на фильтрах. При пони-
жении температуры возможна ренатурация цепей, причем соеди-
ниться с цепью может только комплементарная ей последователь-
ность оснований, а температура связывания во многом определяет
результаты опыта. Количество ренатурированной двуспиральной
ДНК служит прямой мерой сходства геномов сравниваемых орга-
низмов, причем последовательности, образующие двухцепочечные
комплексы, не обязательно комплементарны по всем нуклеотидам.
При гибридизации фрагменты одноцепочечной ДНК известного
микроорганизма (ДНК-репер) закрепляют на фильтре и добав-
ляют радиоактивно меченные фрагменты одноцепочечной ДНК
изучаемого штамма. Контролем служит связывание гомологичной
реперу ДНК (100%-ная гибридизация). Меченая ДНК (зонд)
должна составлять в опыте не более 1:300— 1:500 части от при-
крепленной к фильтру немеченой ДНК-репера. Связывание зонда
в пределах 100—70% считают штаммовыми различиями, 70—
50% —' различиями видовыми, менее 50% — различиями на уровне
рода. Данный метод удобен и объективен, однако может приме-
няться лишь для определения сходства бактерий на уровне рода и
более низком таксономическом уровне.
Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма раз-
рушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фраг-
ментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар ос-
нований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), дена-
турируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильт-
рах. ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вво-
дят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-
озид-5'-трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и
ДНК полимеразы 1 Е. coli и используют для гибридизации. Ее
чаще всего проводят по методу Денхардта в 20 %-ном формамиде
при 62° в течение 18—24 ч («мягкая ренатурация»), отмывают от
несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров прос-
читывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологич-
ных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связан-
ной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент свя-
занной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит пока-
зателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть
осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двой-
ные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и
комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в
справочном руководстве (Герхард и др., 1984).
8.3.4. Каталогизация нуклеотидных последовательностей 5S и
16S рРНК
Гибридизации ДНК—ДНК и ДНК—рРНК требуют прямого
экспериментального сравнения изучаемых микроорганизмов. В
отличие от этого методы анализа генома, построенные на опре-
делении последовательностей нуклеотидов в высококонсервативных
полимерных молекулах клетки, таких как 5S, 16S (18S) или 23S
(28S) рРНК, дают возможность оценивать данные, полученные в
разное время и в разных лабораториях. С помощью сравнения по-
следовательностей нуклеотидов можно проводить филогенетичес-
кий анализ любых организмов, как про- так и эукариотных, и
строить эволюционные деревья, что важно для определения сте-
пени их родства и путей эволюции жизни.
Метод изучения последовательностей нуклеотидов 5S рРНК по
сравнению с анализом 16S рРНК (или аналогичной 18S рРНК у
эукариот) дает меньше информации. Это понятно, исходя из дли-
ны цепи молекул (120 и 1500—1600 нуклеотидов соответственно).
Анализ нуклеотидных последовательностей 5S рРНК, тем не ме-
нее, проводят во многих лабораториях, так как он более прост,
быстр и дешев, по сравнению с анализом 16S рРНК. Последова-
тельности нуклеотидов сравнивают между собой для получения
коэффициента сходства (Sab), характеризующего подобие нуклео-
146
гидов у организмов А и В. Коэффициент Sba рассчитывают путем
деления суммы нуклеотидных остатков, находящихся в общих для
двух организмов нуклеотидах, на сумму нуклеотидных остатков,
содержащихся во всех сравниваемых нуклеотидах, определенных у
организмов А и В. Коэффициенты Sab используют для построения
дендрограмм, которые рассматривают как филогенетические де-
ревья. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Гер-
хард и др., 1984).
8 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИф ОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ
(ПБОМК)
Многие бактерии образуют ПБОМК (и другие полимеры на
основе окси-жирных кислот и их производных) в качестве внутри-
клеточного запасного продукта. Иногда способность к такому син-
тезу служит диагностическим признаком.
Для экстракции ПБОМК из клеток биомассу после осаждения
высушивают смесью диэтилового эфира и метанола (Г.1, объем/
объем). Сухую биомассу освобождают от остатков растворителей
в вытяжном шкафу. Осадок растирают в ступке до порошкообраз-
ного состояния и взвешивают. Если для анализа берут сухую био-
массу, то этап высушивания смесью растворителей пропускают.
ПБОМК экстрагируют из навески биомассы смесью хлорофор-
ма и метанола (2:1, объем/объем) при 60° в водяной термостати-
рованной бане в колбе или пробирке с притертой и прижатой
пробкой (во избежание ее выталкивания при испарении раствори-
телей и подъема давления внутри колбы или пробирки). Для
экстракции берут 5 мл смеси растворителей на 0,5 г сухих клеток.
Экстрацию ведут в течение 20 мин при периодическом покачива-
нии содержимого, затем экстракт сливают с осадка и экстракцию
повторяют. После экстракции осадок биомассы отбрасывают.
Объединенные экстракты фильтруют через стеклянный фильтр
и упаривают досуха под вакуумом или в вытяжном шкафу в фар-
форовой чашке на кипящей водяной бане. Осадок после упарива-
ния растворяют в 1 н. серной кислоте (5 мл на каждый грамм
высушенной исходной биомассы) и ПБОМК гидролизуют в те-
чение 2 ч на кипящей водяной бане или в термостате при 100—
105°. Гидролизат фильтруют через стеклянный фильтр под ваку-
умом, доводят его объем до 5 мл 1 н. серной кислотой и измеря-
ют экстинкцию при 235 нм против серной кислоты на спектрофо-
тометре. Калибровочную кривую строят на 3-гидроксимасляной
кислоте с кислотной обработкой ее параллельно опытной пробе.
8 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ
Полисахариды, образуемые микроорганизмами, входят в сос-
тав ряда компонентов клеток, в частности в клеточную стенку,
служат запасными веществами, локализуются внутри и вне клет-
ки. Внеклеточные полисахариды могут быть капсульными или
147
свободными. Часто полисахариды определяют антигенную специ-
фичность штамма, вполняют защитную функцию, играя роль барь-
ера проницаемости для молекул, ионов или препятствуют потере
клеткой влаги.
Из культуральной жидкости полисахариды выделяют осажде-
нием 3—5 объемами этанола или изопропанола, осадок, обра-
зующийся за 24 ч при комнатной температуре отделяют центри-
фугированием (3 тыс. g, 15 мин) и сушат на воздухе.
Для определения моносахаридного состава проводят гидролиз
1—2%-ного препарата полисахарида в 1 н. НС1 при 100° в тече-
ние 3 ч в герметическом сосуде и смесь затем доводят сухим би-
карбонатом натрия до нейтральной реакции по индикатору. Ра-
створ гидролизованного полисахарида хранят в холодильнике.
Количество редуцирующих сахаров в гидролизате полисаха-
рида определяют по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия
хлористого (ТТХ), используя в качестве стандарта раствор D-
глюкозы. Качественный моносахаридный состав полисахарида
определяют методом хроматографии на бумаге с соответствую-
щими свидетелями.
Для определения образования внутриклеточных полисахаридов
в качестве запасных веществ проводят кислотный гидролиз кле-
точной массы и в гидролизате определяют количество редуциру-
ющих сахаров.
8 6 ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК
МИКРООРГАНИЗМОВ
Главный полимер клеточной стенки большинства бактерий —
пептидогликан (ПГ). В современной классификации грамположи-
тельных бактерий для характеристики рода и вида учитывают
его строение. Известно около 100 типов ПГ. Все грамотрица-
тельные бактерии содержат за небольшими исключениями один
тип ПГ. У этих бактерий его строение не является таксономичес-
ким признаком.
8.6.1. Выделение и очистка фракций клеточных стенок
Клеточные стенки бактерий для анализа ПГ получают после
их механического разрушения (ультразвуковой дезинтегратор с
бусами или без; декомпрессионный шок, см. выше) и центрифу-
гирования при 15 тыс. g в течение 20 мин (условия осаждения
могут несколько отличаться в зависимости от вида). При этом
осадок делится на два слоя: нижний — неразрушенные клетки, и
верхний — клеточные стенки студенистой консистенции. Верхний
слой осадка отделяют и несколько раз промывают водой, пока
расслаивание осадка не прекратится (нижний слой каждый раз
отбрасывают). После последнего промывания (обычно 5—6 раз)
верхний слой отмытых клеточных стенок лиофилизируют или
148
высушивают при обработке спиртом (3 раза), эфиром (2 раза),
затем на воздухе или в вакуум-эксикаторе.
Высушенную массу стенок грамположительных бактерий экст-
рагируют трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для удаления тейхое-
вых кислот. С этой целью к 100—200 мг сухих клеточных стенок
добавляют 10—20 мл 5%-ной ТХУ и суспензию нагревают при 100°
20 мин. Смесь охлаждают и осадок стенок отмывают водой при
центрифугировании до кислотности близкой к нейтральной. Оса-
док суспендируют в 50 мМ трис-НС1-буфере (pH 7,8), препарат
обрабатывают трипсином (2,5 мг сухого фермента в 2,5 мл бу-
фера на каждые 10 мг стенок) в течение 20 мин при 37° при по-
стоянном перемешивании. Осадки стенок промывают 3 раза бу-
фером и обрабатывают 2%-ным дезоксихолатом натрия в том же
буфере для удаления белков. Обработку ведут 5 мин при 100°.
Детергент затем отмывают 3 раза 1 н. NaCl и затем 3—5 раз
дистиллированной водой. Полученный препарат ПГ высушивают
при обработке спиртом (3 раза), эфиром (2 раза) и досушивают
в вакуум-эксикаторе.
8.6.2. Анализ состава пептидогликана
Выделенный и очищенный препарат ПГ гидролизуют в 4 н.
НС1. Для этого 2—3 мг ПГ помещают в ампулу, добавляют 0,5 мл
кислоты и запаянную ампулу инкубируют в течение 16 ч при
100°. В редких случаях бывает необходимым гидролиз препарата
6 н. НС1 18 ч при 120° или 3 н. трифтор уксусной кислоте 4 ч при
100°. После проведения гидролиза и охлаждения ампулы ее вскры-
вают и гидролизат переносят на чашечку из фторопласта. НС1
из гидролизата удаляют в вакуум-эксикаторе, многократно до-
бавляя в чашечку по 0,5 мл дистиллированной воды и высуши-
вая в эксикаторе. В дальнейшем гидролизат количественно пере-
носят в мерную пробирку, объем доводят бидистиллированной
водой до 1 мл и при необходимости центрифугируют. Анализ
гидролизата проводят на аминокислотном анализаторе, после
чего вычисляют мольное отношение аминокислот, мурамовой кис-
лоты и глюкозамина. В том случае, когда в гидролизате обнару-
жена диаминопимелиновая кислота, определяют ее стереоизомер.
Для определения стереоизомера диаминопимелиновой кислоты
(ДАП) гидролизат ПГ (из расчета 1 мг исходного ПГ; при от-
сутствии белка в клеточной стенке можно использовать ее гидро-
лизат) разделяют хроматографией на бумаге в системе раствори-
телей: метанол—вода—НС1—пиридин (40:13:2-5, объем/объем).
Хроматограмму высушивают, опрыскивают 0,5%-ным нингидри-
ном и нагревают в течение 5 мин при 100—110°. ДАП проявляет-
ся в виде желтых пятен на белом фоне. Полученные пятна срав-
нивают по Rf со стандартными образцами мезо- и L-формами
ДАП, которые должны быть нанесены на ту же хроматограмму в
качестве свидетелей.
149
В некоторых случаях для таксономических целей необходимо
определить только природу диаминокислоты. ДАП определяют вы-
шеописанным способом, лизин — хроматографически в системе
бутанол—уксусная кислота—вода (4:1:1) и сравнивают со стан-
дартом.
Идентификацию редких диаминокислот проводят несколькими
способами — хроматографически в разных системах растворите-
лей или на аминокислотном анализаторе с соответствующими сви-
детелями.
В гидролизате определяют аминосахарный и аминокислотный
состав ПГ. В большинстве случаев для целей таксономии доста-
точно определить мольное отношение аминосахаров и аминокис-
лот. В ПГ может быть от 3 до 6 различных аминокислот, однако
в их составе никогда не встречаются разветвленные и аромати-
ческие аминокислоты.
Предположим, что в пробе гидролизата ПГ получено следую-
щее количество аминосахаров и аминокислот (в мкмолях): мура-
мовая кислота (М)—4,03; глюкозамин (ГН)—4,52: диаминопиме-
линовая кислота (ДАП)—5,03; аланин (А)—9,81: глутаминовая
кислота (ГК) — 5,40 (М—ГН—ДАП—А—ГК — 0,80:90:1,00:1,95:
;1,02). Учитывая, что мурамовая кислота и глюкозамин при кис-
лотном гидролизе частично подвергаются разрушению, истинное
мольное отношение в природном полимере данного типа составля-
ет, по-видимому, 1:1:1:2:1.
Выяснив, что ДАП имеет мезо-форму, приходим к выводу, что
ПГ имеет А1т тип, т. е. все остатки мурамовой кислоты замещены
тетрапептидом, состоящим из двух остатков аланина, ДАП, глута-
миновой кислоты, и перекрест между соседними пептидными еди-
ницами осуществляется напрямую (без аминокислот в мостике)
между ДАП одной цепи и последним аланином другой.
ГЛАВА 9
КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ
Для решения многих задач бывает достаточным определение
некоторых, легко выявляемых свойств культур микроорганизмов,
а также их физиолого-биохимических особенностей. Знание та-
ковых, в сочетании с характеристикой морфологии микроорганиз-
ма, иногда позволяет установить его принадлежность к тому или
иному таксону — классу, порядку, семейству.
9.1. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
К культуральным, или макроморфологическим, свойствам от-
носятся характерные особенности роста микроорганизмов на плот-
ных и жидких питательных средах.
9.1.1. Рост на плотных питательных средах
На поверхности плотных питательных сред в зависимости от
посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или
сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление
клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной
клетки. В зависимости от того, где растет микроорганизм клетки
(на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на
дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные ко-
лонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются
большим разнообразием и являются наиболее существенной осо-
бенностью роста многих микроорганизмов на плотном субстрате.
При их описании учитывают следующие признаки:
форму колонии —- округлая, амебовидная, неправильная,
ризоидная и т. д. (рис. 57);
размер (диаметр) колонии измеряют в миллиметрах;
если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют то-
чечными;
поверхность колонии — гладкая, шероховатая, борозд-
чатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или
радиально исчерченная;
профиль колонии — плоский, выпуклый, кратерообраз-
ный, конусовидный и т. д. (рис. 58);
блеск и прозрачность — колония блестящая, матовая,
тусклая, мучнистая, прозрачная;
цвет колонии — бесцветная (грязно-белые колонии отно-
сят к бесцветным) или пигментированная — белая, желтая, золо-
151
Рис. 57 Форма колоний:
А — круглая, Б — круглая с фестончатым краем, В — круглая с валиком по
краю; Г, Д — ризоидные; Е — с ризоидным краем; Ж — амебовидная: 3 —
нитевидная; И — складчатая; К — неправильная, Л — концентрическая, М —
сложная
152
1
2
3
4
6 7 8
5
2
Рис. 58. Профиль колонии:
/ — изогнутый; 2 — кратерообразный; 3 — бугристый; 4 — врас-
тающий в субстрат; 5 — плоский; 6 — выпуклый; 7 — каплевид-
ный; 8 — конусовидный
5

6
7 8
9
Рис. 59. Край колонии:
1 — гладкий; 2 — волнистый; 3 — зубчатый; 4 — лопастной; 5 —
неправильный; 6 — реснитчатый; 7 — нитчатый; 8 — ворсинча-
тый; 9 — ветвистый
Рис. 60. Структура колонии:
1 — однородная; 2 — мелкозернистая; 3 — крупнозернистая; 4 — струй-
чатая; 5 — волокнистая
тистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная. Особо отмечают
выделение пигмента в субстрат. При описании колоний актиноми-
цетов отмечают пигментацию воздушного и субстратного мицелия,
а также выделение пигментов в среду;
край колонии — ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый
и т. д. (рис. 59);
структуру колонии - однородная, мелко-или крупнозер-
нистая, струйчатая и т. д. (рис. 60). Край и структуру колонии
определяют с помощью лупы или при малом увеличении микрос-
копа. Для этого чашку Петри помещают на столик микроскопа
крышкой вниз;
153
консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее
поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть
плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает
к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко
ломается при прикосновении петлей).
Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще
всего они по виду похожи на более или менее сплющенные чече-
вички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными кон-
цами. Лишь у немногих бактерий глубинные колонии напоминают
пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Об-
разование глубинных колоний часто сопровождается разрывом
плотной среды, если микроорганизмы выделяют углекислоту или
другие газы.
Донные колонии разных микроорганизмов имеют обычно вид
тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.
Размеры и многие другие особенности колонии могут изме-
няться с возрастом и зависят от состава среды. Поэтому при
их описании указывают возраст культуры, состав среды и тем-
пературу культивирования.
При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают
следующие особенности; скудный, умеренный или обильный,
сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный, напомина-
ющий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый,
древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства
налета, его цвет, поверхность и консистенцию.
Для описания колоний и роста по штриху многие микроорга-
низмы часто выращивают на мясо-пептонном агаре. Применяют
также мясо-пептонную желатину. Для лучшего рассмотрения глу-
бинных колоний среды с агаром или желатиной рекомендуется
осветлять.
9.1.2. Рост в жидких питательных средах
Рост микроорганизмов в жидких питательных средах более
однообразен. Он сопровождается помутнением среды, образовани-
ем пленки или осадка. Характеризуя рост микроорганизмов в
жидкой среде, отмечают степень помутнения — слабая, умеренная
или сильная, особенности пленки — тонкая, плотная или рыхлая,
гладкая или складчатая, а при образовании осадка указывают —
скудный ои или обильный, плотный рыхлый, слизистый или хлопье-
видный.
Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением
запаха, пигментацией среды, выделением газа. Последнее обнару-
живают по образованию пены, пузырьков, а также с помощью
«поплавков» — маленьких запаянных с одного конца трубочек.
Поплавок помещают в пробирку запаянным концом вверх перед
•стерилизацией среды и следят, чтобы он полностью был заполнен
средой. В случае выделения газа он скапливается в поплавке в
виде пузырька.
154
Для описания характера роста микроорганизмов в жидких
средах их выращивают на МПБ или другой среде, обеспечивающей
хороший рост.
9 2 ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Характеристика физиолого-биохимических особенностей мик-
роорганизмов включает описание их способности расти на разных
питательных средах и вызывать определенные превращения ве-
ществ, входящих в состав этих сред. Учитывают использование
различных соединений углерода, азота и серы, отношение к моле-
кулярному кислороду, способность образовывать антибиотические
вещества и проявлять ферментативную активность в отношении
определенных субстратов. Проверяют чувствительность микроор-
ганизмов к разным антибиотикам.
9.2.1. Использование соединений углерода
Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью
использовать различные соединения углерода для конструктивного
и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность рос-
та микроорганизмов за счет тех или иных углеродсодержащих
веществ, их высевают обычно на синтетические среды, содержа-
щие в качестве единственного источника углерода различные
моно , ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические
кислоты, углеводороды. Из углеводов и многоатомных спиртов
испытывают, как правило, следующие соединения: арабинозу,
ксилозу, рамнозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, сорбозу,
сахарозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, рафинозу,
декстрин, крахмал, инулин, целлюлозу, глицерол, эритрит, маннит,
дульцит, сорбит, инозит, салицин.
Для определения способности микроорганизмов использовать
углеводы и спирты поступают следующим образом. Готовят основ-
ной фон среды, который часто имеет следующий состав (г/л):
пептон — 5,0, К2НРО4 — 1,0. В зависимости от физиологических
особенностей микроорганизмов можно применять иной состав
фона. Так, например, для коринеподобных бактерий рекомендуется
такая фоновая среда (г/л): пептон — 3,0; NaCl — 2,5, а для акти-
номицетов — среда состава (г/л): (NH4)2SO4 — 2,6; КН2РО4 —
2,4; К2НРО4-ЗН2О — 5,6; M(gSO4-7H2O — 1,0; раствор микроэле-
ментов1 — 0,1 мл; вода дистиллированная.
Рост микроорганизмов на средах с углеводами или многоатом-
ными спиртами часто сопровождается накоплением органических
кислот, нейтральных продуктов, газов. Образование кислот реги-
стрируют по изменению pH среды. Для этого к основному фону
добавляют индикатор из расчета 2 мл 1,6%-ного спиртового ра-
1 Раствор микроэлементов (г): GuSO4-5H2O — 0,64; FeSO4-7H2O —0,11;
МпС12 4Н2О — 0,79, ZnSO4 7Н2О — 0,15, вода дистиллированная — 100 Раствор
готовят отдельно и хранят при температуре 3—5°.
155
Рис. 61. Накопление газа в
поплавке:
1 — рост культуры сопро-
вождается образованием
газа; 2 — газ не образуется
Рис. 62. Схема посева на плотную
среду различных микроорганизмов
(1, 2, 3, ...10) для определения
способности использовать угле-
воды
створа на 1 л среды. В качестве индикатора применяют бром-
тимолблау, который изменяет окраску от желтой к синей в интер-
вале pH 6,0—7,6, или бромкрезолпурпур, изменяющий цвет от
пурпурного к желтому в интервале pH 6,8—5,2. «Основной фон»
разливают в пробирки по 8—10 мл, опускают на дно каждой
пробки поплавок и стерилизуют при 1,0 ати.
Углеводы и спирты готовят в виде 10%-ных водных раство-
ров и стерилизуют отдельно от основного фона среды автоклави-
рованием при 0,5 ати или фильтрованием. Раздельная стерили-
зация рекомендуется в связи с тем, что сахара в присутствии
фосфатов и других компонентов среды частично разрушаются и
образуют соединения, токсичные для микроорганизмов. Стериль-
ные растворы добавляют к основному фону в таком количестве,
чтобы концентрация сахара (спирта) в среде составляла 1 г
на 100 мл. Среды засевают суспензией клеток микроорганизмов
и выдерживают в течение 1—5 суток при соответствующей тем-
пературе. Медленно развивающиеся микроорганизмы инкубируют
в течение 7—10 суток. Рост или его отсутствие на среде с данным
источником углерода определяют по помутнению среды, образо-
ванию пленки или осадка. Изменение цвета индикатора указывает
на образование кислых или щелочных (вследствие разложения
пептона) продуктов метаболизма. Об образовании газа свидетель-
ствует накопление его в поплавке (рис. 61). Результаты наблюде-
156
ний сравнивают с показателями роста в контрольной (фоновой)
среде, не содержащей испытуемого источника углерода.
Способность микроорганизмов использовать углеводы и много-
атомные спирты можно определять и на плотных средах. В этом
случае стерильный раствор углевода или спирта добавляют в
стерильную агаризованную расплавленную среду, тщательно пе-
ремешивают ее и разливают в стерильные чашки Петри. После
того как агар застынет, дно чашки Петри с наружной стороны
делят на секторы чернилами или карандашом по стеклу. Затем
каждую из исследуемых культур микроорганизмов высевают пет-
лей, проводя радиальный штрих (рис. 62). В качестве посевного
материала используют густые суспензии клеток, которые готовят
смывом культур с поверхности скошенного агара. Продолжитель-
ность культивирования 2—10 суток. О результатах судят по
интенсивности роста культур в сравнении с ростом на контроль-
ной среде, не содержащей испытываемых соединений углерода.
Этот метод удобен тем, что позволяет в одной чашке Петри одно-
временно проверить способность нескольких микроорганизмов ис-
пользовать тот или иной субстрат.
Многие микроорганизмы могут использовать в качестве един-
ственного источника углерода органические кислоты. Для опреде-
ления способности расти на средах с органическими кислотами
рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH4)2HPO4 — 0,5;
MgSO4-7H2O —0,2; NaCl — 0,1; агар — 15,0; органическая кис-
лота в виде соли Na или К — 2,0; pH 6,8. До стерилизации к
среде добавляют 20 мл 0,04%-ного водного раствора индикатора
фенолрот, который в интервале pH 6,8—8,4 изменяет окраску от
желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют
при 1 ати. Посев проводят уколом, продолжительность культи-
вирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста мик-
роорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельст-
вует рост по уколу и 'изменение кислотности среды в щелочную
сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.
Некоторые микроорганизмы способны использовать и такие
химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить
способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углево-
дороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO3 — 4,0;
КН2РО4 — 0,6; Na2HPO4-12H2O — 1,4; MgSO4-7H2O — 0,8; выще-
лоченный агар — 2,0; pH 7,2. Среду стерилизуют в колбах при
1 ати и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как
среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку.
Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диа-
метр 8—10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени
горелки. Микроорганизмы высевают радиальными штрихами от
лунки к периферии чашки (рис. 63). В лунку вносят 2—3 капли
исследуемого углеводорода *. На чашке с одним углеводородом
можно проверить рост нескольких микроорганизмов. Чашки поме-
1 Стерилизуют фильтрованием.
157
Рис 63. Определение способности микроорганизмов использовать
углеводороды:
а — схема посева; 1—6 — штрихи различных микроорганизмов;
в центре — лунка с жидким углеводородом; б — рост различных
культур
щают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через
7—10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в
сравнении с контролем — ростом на среде без углеводорода.
9.2.2. Использование соединений азота
Для определения способности микроорганизмов использовать
те или иные соединения азота их выращивают на соответственных
питательных средах.
Использование органических азотсодержащих веществ. Многие
микроорганизмы могут усваивать азот органических соединений,
например, пептонов, аминокислот и белков. В процессе фермен-
тативного гидролиза белка освобождаются аминокислоты, которые
используются клеткой непосредственно в процессах биосинтеза, а
также подвергаются расщеплению в результате дыхания или бро-
жения до более простых соединений. Поэтому разложение белка
микроорганизмами (аммонификация) всегда сопровождается об-
разованием побочных продуктов: аммиака, который выделяется
при дезаминировании аминокислот, сероводорода, освобождаю-
щегося при разрушении серосодержащих аминокислот (цистина,
цистеина, метионина), а также индола, который образуется при
распаде триптофана. Обнаружение этих продуктов в культурах
свидетельствует об использовании аминокислот микроорганизма-
ми. Процесс аммонификации всегда сопровождается повышением
щелочности среды.
Обнаружение аммиака. Способность микроорганизмов
образовывать аммиак можно выявить при их росте в мясо-пептон-
ном бульоне. Для этого МПБ разливают в пробирки по 8—10 мл
в каждую и стерилизуют при 1 ати. После посева под ватной
158
пробкой укрепляют узкую стерильную по-
лоску лакмусовой бумаги 1 так, чтобы она
не соприкасалась с питательной средой
(рис. 64). Пробку рекомендуется завора-
чивать в полиэтилен, чтобы затруднить
улетучивание аммиака. При образовании
аммиака красный лакмус синеет.
Если используют пелтонную воду, то
образование аммиака выявляют с помощью
реактива Несслера. На фарфоровую плас-
тинку помещают несколько капель культу-
ральной жидкости и добавляют к ним
каплю реактива Несслера. В присутствии
следов аммиака жидкость окрашивается в
желтый цвет, при большом количестве ам-
миака образуется коричневый осадок.
Обнаружение сероводорода.
Рис. 64 Обнаружение
сероводорода, обра-
зуемого микроорга-
низмами:
Выявление способности бактерий продуци- 1 — почернение свин-
ровать H2S основано на реакции образова- повой бумаги; 2 —
ния сульфидов металлов. Наиболее рас- образование^ толще
пространенный способ — проба с уксусно- среды
кислым свинцом. Микроорганизмы выращивают в МПБ, содер-
жащем 0,01 % цистина и цистеина, которые добавляют к сте-
рильному бульону в виде раствора в подкисленной дистиллиро-
ванной воде. Растворы цистеина и цистина стерилизуют фильтро-
ванием. После посева исследуемых бактерий над средой помеща-
ют стерильную полоску фильтровальной бумаги, пропитанную на-
сыщенным раствором уксуснокислого свинца1 2, укрепив ее под
ватной пробкой. Пробку пробирки заворачивают полиэтиленом,
чтобы затруднить улетучивание H2S. Продолжительность культи-
вирования 7—10 суток. Выделение сероводорода обнаруживают
по почернению бумаги вследствие образования сульфида свинца.
Более четкие результаты наблюдаются при использовании сре-
ды следующего состава (г/л): пептон — 10,0; NaCl — 5,0; цитрат
NH4Fe— 0,30; агар — 15,0; дрожжевой автолизат — 2,0 мл; во-
да водопроводная, pH среды 7,0. Среду разливают в пробирки,
стерилизуют при 0,5 ати, после стерилизации скашивают и дела-
ют посев штрихом. О выделении H2S судят по почернению среды
вследствие образования сульфида железа — FeS (рис. 64).
Обнаружение индола. Индол обнаруживают по качест-
венной реакции с реактивом Эрлиха (приготовление реактива см.
Приложение). Для выявления индола можно использовать раз-
личные среды: МПБ с 0,01% триптофана; 1%-ную казеиновую
воду (г/100 мл: казеин — 1,0; Na2HPO4 — 0,2; NaCl — 0,3) или
1 Полоски лакмусовой бумаги помещают в чашки Петри и стерилизуют в
автоклаве при 0,5 ати.
2 Полоски индикаторной бумаги стерилизуют при 0,5 ати, поместив в чашку
Петри или в пробирку.
159
2—3%-ную пептонную воду (г/100 мл: пептон — 2,5; Na2HPO4 —
0,2; NaCl — 0,3); pH сред 7,2—7,4. Среды разливают в пробирки
по 8—10 мл, стерилизуют при 1,0 ати 1 и засевают суспензией бак-
терий. Через 5—7 суток проводят качественную реакцию на при-
сутствие индола в культуре и в контроле — стерильной среде. Для
этого на поверхность среды, не перемешивая, помещают, 1—2 мл
реактива Эрлиха; появление красной окраски свидетельствует об
образовании индола.
Субстратами аммонификации могут быть и более простые орга-
нические соединения азота, например мочевина. Ферментативный
гидролиз мочевины до аммиака и углекислоты способны осущест-
влять микроорганизмы, образующие уреазу. Образовавшийся ам-
миак используется этими бактериями в качестве источника азота.
Процесс аммонификации мочевины сопровождается сильным под-
щелочением среды.
Для выявления способности микроорганизмов использовать
мочевину часто применяют среду следующего состава (г/л):
(NH4)2 СОз — 5,0; К2НРО4 — 0,5; яблочнокислый, лимоннокислый
или виннокислый Na — 5,0. Среду без мочевины наливают в ко-
нические колбы тонким слоем и стерилизуют при 0,5 ати. Мочеви-
ну добавляют к стерильной среде в виде более концентрирован-
ного раствора в подкисленной дистиллированной воде, простери-
лизованного также при 0,5 ати. После засева среды микроорга-
низмами под ватной пробкой укрепляют стерильную полоску крас-
ной лакмусовой бумаги. Продолжительность культивирования
3—5 суток. Образование аммиака обнаруживают по изменению
цвета лакмусовой бумаги, а также качественной реакцией с реак-
тивом Несслера.
Использование азота минеральных солей. Способность микро-
организмов использовать соли аммония или нитраты в качестве
источника азота проверяют на синтетических средах. Готовят два
варианта среды. Состав основной среды (г/л): глюкоза — 20,0;
КаНРО4 — 1,0; КН2РО4 — 1,0; MgSO4-7H2O — 0,5; NaCl — 0,5;
раствор микроэлементов (с. 155) — 1мл; агар —15,0; pH 7,1—7,2.
В первом варианте к основной среде добавляют NH4C1 — 1,0 и
СаСО3 — 5,0, так как хлористый аммоний — физиологически
кислая соль (с. 44), во втором варианте (KNO3—1,0. Среды
разливают в пробирки, стерилизуют при 0,5 ати и после стерили-
зации скашивают. Посев проводят штрихом, продолжительность
культивирования— 2—10 суток. Рост или его отсутствие отмеча-
ют визуально.
Способность усваивать аммонийные соли или нитраты можно
проверить и на жидких средах того же состава. В этом случае по
окончании опыта целесообразно установить полноту использова-
' Триптофан добавляют к стерильному бульону в виде раствора, который
готовят следующим образом Триптофан вносят в воду и прибавляют по каплям
5—Ю°/о-ный раствор NaOH до полного его растворения. Раствор триптофана
стерилизуют при 0,5 ати в течение 15 мин.
160
ния данной соли. С этой целью в культуральной жидкости опреде-
ляют присутствие ионов аммония или нитратов качественными
реакциями (с. 159, 164). Для контроля проводят реакции с соот-
ветствующей стерильной средой.
9.2.3. Использование молекулярного азота
О способности аэробных микроорганизмов использовать моле-
кулярный азот можно судить по их росту на безазотистой среде
Эшби, которая имеет следующий состав (г/л): маннит — 20,0;
КяНРОц — 0,2; MgSO4 — 02; NaCI — 0,2; K2SO4 — 0,1; СаСОз —
5,0; агар — 20,0; pH 7,1—7,3. Среду разливают в пробирки,сте-
рилизуют при 0,5 ати и готовят скошенный агар. Посев проводят
штрихом. Продолжительность культивирования — 7—10 суток.
Необходимо отметить, что на среде Эшби могут расти не только
микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот, но и олиго-
нитрофилы, т. е. микроорганизмы, способные усваивать ничтожные
количества связанного азота, содержащегося в реактивах, воде и
воздухе. Обильный рост на среде Эшби может свидетельствовать
о принадлежности бактерий к азотфиксаторам.
Молекулярный азот могут фиксировать и анаэробные бакте-
рии. Для выявления этой способности у представителей рода
Clostridium используют среду следующего состава (г/л): дрож-
жевой экстракт — 0,015; глюкоза — 20,0; К2НРО4 —11,0, MgSO4X
Х7НгО — 0,5; NaCI, MnSO4 и FeSO4 — следы (по 1 мл 1%-ного
раствора каждой соли); СаСОз — 20,0; pH 7,0. Среду разливают
в высркие пробирки и стерилизуют при 0,5 ати. После стерилиза-
ции пробирки доливают почти до пробки стерильной средой и
прогревают на кипящей водяной бане в течение 20—30 мин для
удаления растворенного в среде кислорода. Затем среду в про-
бирках быстро охлаждают под струей холодной воды и проводят
посев суспензией микроорганизмов. Посевной материал вносят пи-
петкой на дно пробирки. Продолжительность культивирования —
2—7 суток. По окончании опыта отмечают рост азотфиксаторов
(помутнение среды, юбразование газа, появление запаха масляной
кислоты) или его отсутствие.
9.2.4. Отношение к молекулярному кислороду и рост
в анаэробных условиях
По отношению к молекулярному кислороду среди микроорга-
низмов выделяют группы облигатных аэробов и микроаэрофи-
лов, факультативных, аэротолерантных и строгих анаэробов. Что-
бы судить о принадлежности микроорганизмов к той или иной
группе, микробную суспензию высевают в пробирки с расплавлен-
ной и остуженной до 40—45 °C агаризованной питательной средой.
Посев можно проводить и уколом. Строгие аэробы растут на по-
верхности среды и в верхнем слое. Микроаэрофилы — на некото-
ром расстоянии от поверхности. Факультативные анаэробы обыч-
161
Рис. 65. Рост микроорга-
низмов при посеве уко-
лом (а) и при посеве в
расплавленную плотную
среду (б):
1 '— аэробы; 2 — микро-
аэрофилы; 3 — факуль-
тативные анаэробы; 4 —
анаэробы
но развиваются по всей толще среды.
Строгие анаэробы растут только в глу-
бине среды, у самого дна пробирки
(рис. 65).
Факультативные анаэробы хорошо
растут и в аэробных, и в анаэробных ус-
ловиях. В анаэробных условиях многие
из них способны использовать в качест-
ве конечного акцептора электронов не
кислород, а нитраты. В ходе этого про-
цесса, называемого нитратным дыхани-
ем, нитраты восстанавливаются до нит-
ритов, и далее до N2O и газообразного
азота. В случае образования этих газо-
образных продуктов говорят о денитри-
фикации. Другие факультативные ана-
эробы могут в анаэробных условиях пе-
реключаться с дыхания на брожение, и
тогда в средах с углеводами накаплива-
ются значительные количества органи-
ческих кислот и других продуктов мета-
болизма.
Определение способности к аэробно-
му дыханию. Тест на дыхание (погло-
щение молекулярного кислорода) прово-
дят с использованием полярографа и
платина-хлорсеребряного электрода
«закрытого» типа, позволяющего регис-
трировать дыхание в небольших по объ-
ему образцах. Полярограф представляет
собой прибор с термостатированной пе-
ремешиваемой ячейкой для определения
дыхания и автоматической регистрацией
изменения силы тока, линейно связан-
ной с концентрацией кислорода в ячей-
ке. Следует помнить, что концентрация
кислорода в ячейке зависит от темпера-
туры, молярности буфера и атмосферного давления. При комнат-
ной температуре (21°) и нормальном давлении (760 мм рт. ст.)
в литре дистиллированной воды, насыщенной воздухом, раство-
рено 7 мг кислорода, что соответствует примерно 500 натомов
Ог/мл.
Для измерения скорости дыхания клетки аэробных микроор-
ганизмов, выращенные на соответствующих средах, собирают цент-
рифугированием (режим зависит от величины клеток), промывают
физиологическим или буферным раствором с оптимальным для
данного объекта pH и суспендируют в небольшом объеме буфера
из расчета примерно 3 мл на 1 г осадка сырых клеток. Клетки в-
течение эксперимента хранят на льду. В ячейку полярографа вно-
162
сят клетки (обычно 0,1 объема ячейки) и добавляют проаэриро-
ванный буфер той же температуры. Регистрацию поглощения кис-
лорода следует проводить в термостатированных ячейках при тем-
пературе, близкой температуре выращивания испытуемого микро-
организма. Регистрируют поглощение Ог пробой без субстрата
(эндогенное дыхание), затем шприцем добавляют соответствую-
щий субстрат (обычно 10~2—10-3 М). Регистрацию ведут в тече-
ние нескольких минут, причем в первый период времени после
добавления субстрата дыхание должно быть линейным, т. е. его
скорость не должна изменяться со временем. Если такой линейнос-
ти не наблюдается, можно попытаться снизить концентрацию кле-
ток или увеличить скорость движения ленты самописца.
В качестве теста на функционирование терминальных оксидаз
можно добавить в ячейку с клетками ингибиторы, цианид или азид
(Внимание! Сильнейшие яды!). Их добавляют до конечной кон-
центрации 10-4—10“3 М, в таких условиях клетки теряют способ-
ность поглощать кислород.
Расчет скорости дыхания проводят по ленте самописца, учиты-
вая скорость поглощения клетками кислорода в первые 1—3 мин
после добавления субстрата; рассчитывают также степень подав-
ления дыхания (в %) при той или иной действующей концентра-
ции ингибитора. Данные рассчитывают на миллиграмм общего
клеточного белка (см. гл. 8).
Для калибровки шкалы полярографа проводят измерения со-
держания кислорода в насыщенной воздухом дистиллированной
воде (100% кислорода) и в той же пробе после добавления 10~2М
дитионита натрия (0% кислорода).
Способность к денитрификации определяют на среде следую-
щего состава (г/л): глицерин — 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0;
(NH'4)2SO4 — 2,0; KNO3 — 10,0; К2НРО4 — 2,0; MgSO4-7H2O —
0,025; NaCI — 0,5; FeSO4-7H2O — 0,001; агар — 1,0. Среду раз-
ливают в пробирки по 5 и 10 мл и стерилизуют при 0,5 ати. Иссле-
дуемый микроорганизм вначале засевают в пробирки с 5 мл сре-
ды (1-й пассаж). Посев делают уколом. Через 24 ч петлю культу-
ры 1-го пассажа переносят в пробирки с 10 мл среды, которую
предварительно расплавляют и охлаждают до 40—45°. После
внесения микроорганизмов среду перемешивают, остужают и за-
ливают 2—3 мл стерильного 1 %-ного водного агара для создания
анаэробных условий. Рост бактерий, способных к денитрифика-
ции, сопровождается помутнением среды и выделением газа.
Проверить способность бактерий к восстановлению нитратов
можно и на МПБ, к которому добавляют 0,2% KNO3. Среду раз-
ливают в пробирки по 10 мл, опускают на дно каждой поплавок
и стерилизуют при 1 ати. Посев проводят суспензией клеток. Про-
должительность культивирования — 2—5 суток. По окончании
опыта отмечают накопление в поплавке газа (N2) и определяют
качественными реакциями присутствие в культуральной жидкос-
ти нитратов и нитритов.
163
Реакция на нитраты с д и ф е н и л а м и н о м. На фар-
форовую пластинку наносят каплю концентрированной серной
кислоты, помещают в нее несколько кристаллов дифениламина и
после его растворения добавляют каплю исследуемой жидкости.
При наличии ионов ЫОз жидкость окрашивается в темно-синий
цвет. Следует иметь в виду, что азотистая кислота также дает с
дифениламином синее Окрашивание. Поэтому пробу на нитраты
можно проводить только при отсутствии в среде нитритов.
Крахмал-йодная реакция на нитриты основана на
том, что нитриты в кислой среде окисляют йодистый цинк с выде-
лением йода, присутствие которого обнаруживают с крахмалом.
Для проведения реакции к капле культуральной жидкости добав-
ляют каплю раствора, содержащего ZnCl2, KI и крахмал (приго-
товление реактива см. Приложение), и каплю раствора НС1. При
наличии в среде нитритов появляется синее окрашивание.
Реакция на нитраты с реактивом Грисса основана
на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и арома-
тических аминов (сульфофеноловой кислоты и а-нафтиламина)
азосоединения, окрашенного в красно-розовый цвет. Для проведе-
ния реакции к капле реактива Грисса (приготовление реактива
см. Приложение) добавляют каплю культуральной жидкости.
Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии
нитритов. Параллельно проводят реакции со стерильной средой.
Определение способности к брожению проводят обычно на уг-
леводно-пептонной среде с относительно высокой концентрацией
углеводов и небольшим количеством пептона. Состав среды (г/л):
углевод — 10,0; пептон — 2,0; NaCl — 5,0; К2НРО4 — 0,3; агар —
3,0. На 100 мл среды добавляют 0,3 мл 1%-ного водного раствора
бромтимолового синего, pH среды 7,1—7,2. Среду без углевода
стерилизуют при 1 ати. Углеводы (глюкозу, сахарозу, лактозу)
добавляют к стерильной расплавленной среде в виде растворов в
дистиллированной воде, которые стерилизуют при 0,5 ати. Сте-
рильную среду с углеводами разливают в стерильные пробирки
слоем 5—6 см и после того, как она застынет, ее засевают иссле-
дуемым микроорганизмом. Посев делают уколом. Для каждого
углевода используют две пробирки. После посева поверхность
среды в одной пробирке заливают стерильным расплавленным па-
рафином, смесью вазелинового масла и парафина (1:1), или вод-
ным агаром (1,5 г агара на 100 мл), слоем 1—2 см.
Продолжительность культивирования от 2 до 7 суток. По окон-
чании опыта регистрируют изменение pH среды по перемене цве-
та индикатора. Аэробные микроорганизмы, осуществляющие ды-
хание и не способные к брожению, растут на поверхности среды
только в пробирке без парафина и образуют небольшое количест-
во кислот лишь в верхнем слое среды. В случае нейтрализации
этих кислот продуктами разложения пептона в поверхностном
слое среды наблюдается щелочная реакция. Микроорганизмы,
способные сбраживать углеводы, растут и образуют кислоты в
обеих пробирках, но кислотность в анаэробных условиях значи-
164
тельно выше, чем в первом варианте. Это хорошо заметно по из-
менению цвета индикатора. Если брожение сопровождается обра-
зованием газов, то происходит разрыв агаризованной среды.
9.2.5. Определение внеклеточных ферментов
Как указывалось выше, некоторые микроорганизмы способны
использовать в качестве питательных субстратов самые различные
высокомолекулярные соединения: полисахариды, белки, нуклеи-
новые кислоты, липиды и др. Однако макромолекулы не могут
проникать через мембрану клетки. Они подвергаются расщепле-
нию, которое осуществляется под воздействием экзоферментов,,
относящихся к классу гидролаз. Большинство из них катализиру-
ет гидролиз полимера до растворимых продуктов, обычно диме-
ров или мономеров, которые поступают в клетку с помощью спе-
цифических транспортных механизмов. Образование экзофермен-
тов широко распространено среди различных групп микроорганиз-
мов. При поиске продуцентов ферментов-гидролаз в лабораторной
практике применяют специальные методы. Сущность их состо-
ит в следующем. Микроорганизмы выращивают на агаризованной
среде, содержащей макромолекулярный субстрат. Если клетки
выделяют в среду экзоферменты, гидролизующие данное соедине-
ние, то выросшие колонии окружены зоной, в которой обнаружи-
ваются продукты гидролиза.
Амилолитическая активность. Крахмал подвергается гидроли-
тическому расщеплению под действием амилаз, активными проду-
центами которых являются различные виды бацилл, псевдомонад,
стрептомицетов и мицелиальных грибов. Для выявления амилоли-
тической активности часто используют среду следующего состава
(г/л): пептон — 10,6; КН2РО4 — 5,0; растворимый крахмал —
2,0; агар — 15,0, pH среды 6,8—7,0. Среду стерилизуют при 1 ати
и разливают в стерильные чашки Петри. Когда среда застынет,
исследуемые микроорганизмы высевают штрихом по диаметру
чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2—10
суток.' Гидролиз крахмала обнаруживают после обработки ага-
ровой пластинки раствором Люголя (приготовление реактива см.
Приложение). Для этого на поверхность среды наливают 3—5 мл
раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в
синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобре-
тает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до дек-
стринов. Зону гидролиза крахмала измеряют в миллиметрах от
края штриха (колонии) до границы светлой зоны. Чем больше ди-
аметр светлой зоны, тем выше амилолитическая активность
(рис. 66).
Протеолитическая активность. Протеолитические ферменты
(протеазы) катализируют расщепление белков на поли- н олиго-
пептиды. Протеазы выделяются различными видами бацилл, акти-
номицетов, мицелиальных грибов и другими микроорганизмами.
165
Рис 66 Определение амилолитической активности:
а — схема посева (/—4 — штрихи разных культур); б — среда
с культурами после обработки раствором люголя
Активность внеклеточных протеаз определяют, используя в качест-
ве субстрата желатину, казеин или другие белки.
Протеолиз желатины. Микроорганизм высевают на мя-
со-пептонную желатину (МПЖ). Ее готовят следующим образом.
К 100 мл МПБ добавляют 10—15 г желатины, оставляют на 20—
30 мин, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на во-
дяной бане до полного растворения желатины и разливают полу-
ченную МПЖ в пробирки по 8—10 мл. Стерилизуют при 0,5 ати
15 мйи. Посев проводят уколом. Продолжительность культивиро-
вания 7—10 суток при комнатной температуре. Разжижение же-
латины или его отсутствие отмечают визуально. Если желзтина
разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения
•— послойное, воронкообразное, мешковидное, пузыревидное и т. д.
(рис. 67).
Рис. 67. Схема разжижения желатины микроорпаиизмами при посеве
уколом:
1 — кратеровидиое; 2 — реповидное; 3 — воронковидное; 4 — мешко-
видное; 5 — послойное; 6 — пузыревидное. 1—3 и 5 — разжижение
вызвано аэробами, 4 — факультативными анаэробами, 6 — анаэробами
166
Протеолиз казеина. Для выявления этой способности
используют молочный агар — среду, состоящую из равных частей
стерильного обезжиренного молока и стерильного 3%-ного водно-
го агара. Как правило, перед приготовлением среды молоко обез-
жиривают центрифугированием в течение 15 мин при 2—3 тыс.
об/мин. Жиры, которые образуют на поверхности молока доста-
точно плотную пленку, удаляют, а молоко стерилизуют при 0,5
ати. После стерилизации его подогревают и добавляют при пос-
тоянном перемешивании к стерильному расплавленному и осту-
женному до 50° водному агару. Полученную среду разливают в
чашки Петри. Микроорганизмы высевают штрихом по диаметру
чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2—10
суток. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления
среды вокруг колонии или выросших по штриху микроорганиз-
мов. Особенно четко она видна после обработки среды раствором
5%-ной трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казеина изме-
ряют в мм от края штриха или колонии до границы светлой зоны.
Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше казеинолитическая
активность бактерий.
Липолитическая активность. Липиды подвергаются гидролити-
ческому разложению под действием липаз. Продуценты липаз об-
наружены среди дрожжей, мицелиальных грибов, бактерий рода
Clostridium и других микроорганизмов. Для выявления липолити-
ческой активности исследуемые микроорганизмы высевают на сре-
ду, содержащую соответствующий липид. Определенная труд-
ность при постановке таких опытов связана с тем, что жиры не
смешиваются с водой. Поэтому чаще всего вместо жиров в среду
вводят твины — эфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содер-
жит пальмитиновую, твин-60 — стеариновую, а твин-80 — олеи-
новую кислоты. Твины хорошо растворимы в воде и имеют нейт-
ральную реакцию. Состав среды (г/л): твин — 10,0; пептон —
10,0; NaCI — 5,0; СаС12-Н2О — 0,1; агар — 20,0; pH среды 7,4.
Готовят среду без твина и стерилизуют ее при 1 ати. Водный раст-
вор твина соответствующей концентрации стерилизуют отдельно
при 0,5 ати и добавляют к стерильной основной среде. Среду раз-
ливают в чашки Петри. Когда агар застывает, на поверхность
агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый
микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соот-
ветствующей температуре необходимое для роста микроорганизма
время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха
или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот,
освобожденных из твина.
9.2.6. Образование антибиотиков
В процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы обра-
зуют специфические продукты, которые обладают высокой физио-
логической активностью по отношению к другим микроорганиз-
мам или вирусам, задерживая их рост или убивая их. Они назы-
167
ваются антибиотиками. В отличие от общебиологических ядов ан-
тибиотики проявляют свое действие лишь по отношению к от-
дельным, вполне определенным видам или группам микроорганиз-
мов. Одни антибиотики — пенициллин, фумагиллин, бацитрацин
и др. — подавляют рост ограниченного числа видов микроорга-
низмов. Другие — тетрациклины, хлорамфеникол, эритромицин,
карбомицин — имеют широкий спектр действия, т. е. подавляют
рост многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, а
также риккетсий и некоторых вирусов. Как правило, грамположи-
тельные бактерии более чувствительны к действию антибиотиков-
по сравнению с грамотрицательными, что связано со строением их
клеточной стенки. Наиболее часто активные продуценты антибио-
тических веществ встречаются среди стрептомицетов, спорообра-
зующих бактерий и мицелиальных грибов.
Определение антибиотической активности микроорганизмов.
Существуют различные способы выявления антибиотических
свойств микроорганизмов. Многие из них основаны на способности
антибиотиков диффундировать в агаризованные среды и образо-
вывать зоны, в которых не растут тест-организмы. Величина зоны
отсутствия роста указывает на степень активности данного анти-
биотика в отношении тест-культуры и зависит от его концентра-
ции, а также от плотности культуры тест-организма, состава и тол-
щины слоя агаризованной среды, температуры инкубации, дли-
тельности диффузии и других факторов. В качестве тест-организ-
мов используют представителей различных микроорганизмов, &
первую очередь Escherichia coli (грамотрицательные бактерии),
Staphylococcus aureus (грамположительные бактерии), Bacillus
subtilis или Bacillus mycoides (спорообразующие бактерии), дрож-
жи рода Candida или Saccharomyces. При необходимости этот
стандартный набор тест-организмов дополняют другими микроор-
ганизмами. Антибиотическую активность чаще всего выявляют
методами перпендикулярных штрихов и агаровых блочков.
Метод перпендикулярных штрихов. На питательный
агар в чашке Петри высевают штрихом предполагаемый проду-
цент антибиотического вещества. Посев штрихом делают по диа-
метру чашки Петри. Время инкубации продуцента зависит от ско-
рости его роста. После того как продуцент вырастет и образует
антибиотическое вещество, диффундирующее в толщу агара, пер-
пендикулярно к его штриху подсевают штрихами тест-организмы,
начиная от штриха к периферии чашки. Для посева используют
густые суспензии тест-организмов в стерильной водопроводной во-
де. Чашки выдерживают в термостате при 18—30° в теченио
2—8 суток в зависимости от скорости роста тест-организмов. Не-
чувствительные к антибиотическому веществу тест-организмы
растут вблизи штриха продуцента. Если антибиотик оказывает-
действие на тест-организм, то рост последнего будет наблюдаться
вдали от штриха продуцента (рис. 68). Чем больше это расстоя-
ние, тем более чувствительным является тест-организм к антибио-
тическому веществу, образуемому изучаемым продуцентом.
168
Рис 68 Определение антибиотической активности методом пер-
пендикулярных штрихов
а — схема посева (1—6 — штрихи тест-культур, 7 — штрих про-
дуцента антибиотического вещества); б — рост продуцента и
тест-культур
Метод имеет, однако, существенный недостаток. Продуцент ан-
тибиотического вещества и тест-организм выращивают на одной
среде, хотя известно, что не всегда одна и та же среда одинаково
благоприятна как для продуцента и образования им антибиотика,
так и для роста тест-организма.
Метод агаровых блочков предусматривает использова-
ние разных питательных сред для выращивания продуцента анти-
биотика и тест-организмов. Для выявления антибиотических
свойств актиномицетов предполагаемый продуцент выращивается
на среде следующего состава (г/л): глюкоза — 30,0; KNO3 — 5,5;
MgSCU — 0,5; NaCl — 1,0; К2НРО4 — 0,4; ZnSO4 — 0,002;
FeSO4 — 0,002; агар — 25,0; вода дистиллированная; pH 7,1—7,2.
Среду стерилизуют при 0,5 ати и разливают в стерильные чашки
Петри. После застывания агара продуцент антибиотического ве-
щества высевают сплошным газоном. Для этого споры актиноми-
цета переносят петлей на агаровую пластинку, распределяют по
всей поверхности шпателем и инкубирует при 28—30° в течение
8—10 суток. Затем стерильным пробочным сверлом (диаметр 6-8
мм) вырезают агаровые блочки с газоном актиномицета и перено-
сят их на поверхность агаризованной среды, например МПА, толь-
ко что засеянной тест-организмом. Агаровые блочки раскладыва-
ют по шаблону на равном расстоянии один от другого и на рас-
стоянии 1,5—2 см от края чашки мицелием вверх и плотно прижи-
мают к агаровой пластинке. Для лучшей диффузии антибиотичес-
ких веществ в толщу питательной среды, засеянной тест-организ-
мом, блочки можно закладывать непосредственно в лунки, предва-
рительно вырезанные тем же сверлом. На одной чашке Петри с
тест-организмом можно разместить 5—6 агаровых блочков с раз-
ными продуцентами антибиотиков (рис. 69). Чашки выдержива-
169
Рис 69. Определение антибиотической активности методом
агаровых блочков
а — схема постановки опыта (/—4 — блочки с разными про-
дуцентами); б — зоны подавления роста тест-культуры под
действием антибиотика, диффундирующего в агар блочков
ют 1 ч при комнатной температуре для диффузии антибиотичес-
ких веществ в толщу агара, затем помещают в термостат при
температуре, благоприятной для развития тест-организма на сут-
ки и более в зависимости от скорости его роста. Если тест-орга-
низм чувствителен к антибиотическому веществу продуцента, то
после инкубации вокруг агаровых блочков образуются зоны от-
сутствия его роста. Чем больше выделяется антибиотика и чем он
активнее, тем больше будет диаметр зоны отсутствия роста тест-
организма. Тест-организм, не чувствительный к антибиотическому
веществу данного продуцента, растет по всей поверхности среды и
даже вблизи блочка продуцента.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиоти-
ческим веществам. Чувствительность микроорганизмов к антибио-
тикам удобно определять с помощью выпускаемых промышлен-
ностью бумажных дисков, пропитанных определенными антибио-
тиками. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана с таким
расчетом, чтобы диаметры задержки роста стандартных тест-ор-
ганизмов были 28—32 мм.
Исследуемые микроорганизмы выращивают на соответствую-
щей плотной питательной среде. Готовят однородную суспензию
клеток в стерильной водопроводной воде. В 1 мл суспензии долж-
но содержаться около 2 млрд клеток *. 1 мл суспензии вносят в
пробирку с 20 мл стерильной расплавленной и остуженной до
50° агаризованной средой, например МПА. Если микроорганизмы
выращивали в жидкой питательной среде, в агар вносят соответ-
ствующий объем культуры. Содержимое пробирки быстро и тща-
1 Определяют по стандарту мутности
170
тельно перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри.
Когда среда застынет, на ее поверхности помещают бумажные
диски на равном расстоянии друг от друга и на 1,5—2,0 см от
края чашки. Чашки выдерживают 2 ч при комнатной температуре
для лучшей диффузии антибиотиков в толщу агаризованной сре-
ды, а затем 24 ч при 28—30°. Если исследуемые микроорганизмы
чувствительны к данным антибиотикам, то вокруг дисков образу-
ются зоны отсутствия роста. Диаметр зоны измеряют миллимет-
ровой линейкой. Зона более 30 мм свидетельствует о высокой чув-
ствительности микроорганизма к антибиотику, а менее 12 мм —
о слабой чувствительности.
Когда в распоряжении экспериментатора имеются растворы
антибиотических веществ или культуральные жидкости,содержа-
щие антибиотик, используют метод с применением лунок в толще
агара. В этом случае в застывшей агаризованной среде, засеянной
испытуемым микроорганизмом, стерильным пробочным сверлом
(диаметр 6—8 мм) делают лунки на расстоянии 1,5—2 см от края
чашки. В лунки вносят растворы антибиотиков или культуральную
жидкость. Этот метод позволяет также выявить способность к об-
разованию антибиотических веществ микроорганизмами, выращен-
ными в жидкой среде.
ГЛАВА 10
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
Одно из центральных мест в современной биологии принадле-
жит генетике — науке о наследственности и изменчивости. Нас-
ледственность обеспечивает материальную и функциональную пре-
емственность между поколениями организмов. Наследственная
информация, необходимая для существования и воспроизведения
организмов, заключена в генах, которые обладают тремя основ-
ными свойствами: они выполняют специфическую функцию, спо-
собны к точному самовоспроизведению, чрезвычайно стабильны.
Гены расположены в линейном порядке на хромосомах, причем
каждый ген занимает свое собственное место, или локус. Таким
образом, основной структурой, обеспечивающей материальную ос-
нову наследственности, является хромосома — система линейно
сцепленных генов, обеспечивающих хранение и передачу инфор-
мации.
Прокариоты и эукариоты различаются генетической организа-
цией. Наследственная информация у прокариот заключена в коль-
цевой молекуле ДНК, называемой бактериальной хромосомой.
Кроме того, часть наследственной информации может находиться
в плазмидах — автономно реплицирующихся кольцевых ковалент-
нозамкнутых суперскрученных молекулах ДНК- У эукариот нас-
ледственная информация находится в хромосомах, расположенных
в ядре. Экстрахромосомальная ДНК у эукариот может быть пред-
ставлена плазмидами, митохондриальной ДНК, хлоропластном
ДНК.
Изменчивость организмов может быть наследственной и нена-
следственной. Ненаследственная изменчивость (модификационная,
фенотипическая) является адаптивной, приспособительной к из-
менению факторов внешней среды. Однако она является генети-
чески детерминированной и находится в пределах нормы реакции
организма. Таким образом, фенотип микроорганизма часто сущест-
венным образом определяется условиями его выращивания.
Наследственная изменчивость подразделяется на комбинатив-
ную и мутационную. При комбинативном типе изменчивости са-
ми гены не изменяются, происходит лишь их перекомбинация и
перекомбинация хромосом, несущих разные аллели. Комбинатив-
ная изменчивость определяет разнообразие потомков, получивших
новые комбинации генов и хромосом, существовавших у родитель-
ских форм.
172
Несмотря на стабильность, гены обладают способностью под-
вергаться случайным внезапным изменениям, или мутациям, в ре-
зультате чего появляются новые аллели, функционально отличные
от исходного гена. Таким образом, мутационная изменчивость —
это возникновение новых дискретных единиц генетического мате-
риала, прежде всего новых аллелей.
10.1 ОСНОВНЫЕ понятия
Каждый вид микроорганизма может быть представлен рядом
штаммов. В генетике микроорганизмов термином «штамм» обоз-
начают генетически однородную культуру определенного вида, вы-
деленную из одной клетки и отличающуюся от других штаммов
происхождением, а часто и рядом признаков, несущественных для
систематики. Штамм, выделенный из природы, называют диким
типом. Одним из основных методов генетического анализа микро-
организмов является метод клонирования культуры. Клон — это
генетически однородное потомство, полученное при размножении
одной клетки (у прокариот) или вирусной частицы. У эукариоти-
ческих микроорганизмов клон —- потомство одной клетки (споры),
делящейся митотически.
Получение отдельных клонов позволяет изучать свойства ге-
нетически однородной совокупности клеток (популяции). На прак-
тике клоны получают из отдельных колоний микроорганизмов,
выросших на поверхности плотной питательной среды из отдель-
ных клеток (принцип одна клетка — одна колония).
В генетике микроорганизмов изучают свойства и признаки не
отдельных клеток, а популяции в целом. Признаки микробных
культур можно подразделить на морфологические, физиологичес-
кие и биохимические (см. гл. 9). Совокупность всех проявляемых
признаков определенного штамма называется его фенотипом. На-
следственной основой фенотипа является генотип — наследуемая
генетическая организация.
Перед проведением генетических экспериментов необходимо
убедиться в чистоте штаммов, отклонировать их, вырастить в не-
большом объеме среды и соответствующим образом проверить ге-
нотип этих штаммов. Наиболее широко используемыми объектами
практических занятий по генетике микроорганизмов из бактерий
являются Escherichia coll и Bacillus subtilis, а из эукариот — не-
которые виды грибов. Однако это не исключает использование и
других генетически хорошо изученных микроорганизмов. В дан-
ном практическом руководстве рассматриваемые методики отно-
сятся главным образом к Е. coll.
10.2 МУТАГЕНЕЗ
Мутации являются первоисточником наследственной изменчи-
вости и наряду с генетической рекомбинацией поставляют мате-
риал для эволюции, а также искусственного отбора. Они представ-
173
ляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических
исследованиях.
1. Вызывая изменения в гене, а следовательно, и в фенотипе,
мутации служат генетическими маркерами, позволяющими не
только идентифицировать ген, но также локализовать его на хро-
мосоме, плазмиде или другой молекуле ДНК в клетке с помощью
методов генетического картирования.
2. Наличие набора мутаций помогает исследовать процессы
метаболизма и механизмы их генетического контроля.
3. Исследование белков, измененных в результате мутаций,
способствует установлению их структуры и функционирования.
4. Мутации являются основой для селекции штаммов микроор-
ганизмов с полезными свойствами (например, штаммов — проду-
центов антибиотиков).
По своему происхождению мутации могут быть спонтанными и
индуцированными.
10.2.1. Спонтанные мутации
Спонтанные мутации возникают в естественных условиях в ре-
зультате нормальных процессов в клетке или при взаимодействии
клеток с окружающей средой. Мутагенным действием обладают
неконтролируемые факторы внешней среды, например естествен-
ная радиация. Мутагенное действие могут оказывать также опре-
деленные компоненты питательных сред. Существенная роль в
возникновении спонтанных мутаций принадлежит таким процес-
сам, как рекомбинация, репликация и репарация. Спонтанные му-
тации в популяции клеток по разным генам возникают с очень
низкой частотой (в пределах 10-5—10~7). Однако если существует
метод отбора (селекции) мутантного фенотипа, то оказывается
возможным обнаружить даже крайне редкие спонтанные мутан-
ты. При наличии таких методов отбора часто предпочтение отда-
ется выделению именно спонтанных мутантов, поскольку многие
мутагенные факторы являются потенциально опасными для чело-
века, а химические мутагены, кроме того, загрязняют окружаю-
щую среду.
10.2.2. Индуцированные мутации
Физические, химические или биологические агенты, индуцирую-
щие мутации, называются мутагенами. Мутагенным действием
обладает ионизирующее излучение, УФ-лучи, ряд химических сое-
динений, транспозирующиеся элементы и транспозон-подобные
фаги (иапример, фаг Ми), а также мутации в определенных генах
(гены-мутаторы).
10.2.3. Выбор мутагена
Выбор мутагена определяется типом мутации, которую жела-
тельно получить (т. е. замена основания, делеция, сдвиг рамки
174
считывания), а также эффективностью мутагена в отношении дан-
ного микроорганизма. Например, делеционные мутанты всегда
имеют ярко выраженный фенотип, не бывают температурозависи-
мыми и условно летальными; истинные реверсии к дикому типу у
них невозможны. Разные виды микроорганизмов могут требовать
разных доз и условий для эффективного мутагенеза. С этой целью
перед экспериментатором следует построить кривую выживае-
мости клеток в зависимости от дозы мутагенного фактора или
времени обработки.
В таблице 13 приведены некоторые мутагены, используемые
для получения мутаций у микроорганизмов.
УФ-лучи. Простым и удобным методом получения мутантов
разного типа у ряда микроорганизмов является УФ-облучение.
Для этого используются любые источники света с максимумом ис-
пускания в коротковолновой области (около 254 нм), например
бактерицидные лампы. Поскольку УФ-лучи являются относитель-
но слабым мутагеном, то наилучшие результаты получают при
низкой выживаемости клеток (0,1 —1,0%). Необходимо помнить,,
что УФ-лучи практически полностью поглощаются стеклом, поэто-
му при облучении суспензию вегетативных клеток или спор поме-
щают в открытый сосуд, например чашку Петри. Чтобы исключить
эффект экранирования, следует использовать суспензии с концен-
трацией не выше 5-Ю8 клеток/мл и проводить облучение в буфер-
ных растворах. Летальный эффект УФ-лучей зависит от физиоло-
гического состояния клеток, прежде всего от их возраста. Обычно
в фазе экспоненциального роста культуры клетки более чувстви-
тельны к УФ-лучам, чем в стационарной фазе. Кроме того, облу-
чение и дальнейшую инкубацию клеток микроорганизма следует
проводить в условиях, исключающих фотореактивацию, т. е. в тем-
ноте.
Нитрозогуанидин. Ы-метил-М-нитро-М-нитрозогуанидин (Н1Д
является одним из самых мощных и широко применяемых мутаге-
нов. Исходные растворы НГ готовят непосредственно перед ис-
пользованием, растворяя его в соответствующем буфере (напри-
мер, 0,1 М. цитратный буфер, pH 5,5) до концентрации 1 мг/мл.
Рабочая концентрация НГ составляет обычно 50—500 мкг/мл.
Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе рос-
та) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом
цитратного буфера, ресуспендируют в 5 мл буфера, добавляют
НГ и инкубируют при 30—37° в течение определенного времени.
Время обработки подбирают предварительно таким образом, что-
бы выживаемость клеток составляла примерно 50%. Клетки об-
рабатывают НГ в конечной концентрации 50—100 мкг/мл в тече-
ние 30 мин. Обработанные клетки осаждают центрифугированием,
промывают фосфатным буфером (pH 7,0) или минимальной сре-
дой (см. Приложение), чтобы удалить НГ. После этого клетки
переносят в богатую питательную среду (см. Приложение) и инку-
бируют в течение ночи (12—16 ч).
175
а>
Свойства некоторых мутагенов, используемых для индукции
мутаций у микроорганизмов
Таблица 13
Мутаген Механизм действия Тип мутации Эффективность Характерные особенности
1 2 3 4 5
Радиация
Рентгеновское излучение, быстрые нейтроны преимущественно разрывы хромосомы делеции, инверсии средняя требует специального оборудования
Уф-облучение димеризация пирими- динов транзиции, транс- версии, делении средняя высокая частота индукции мутаций достигается только в условиях низ- кой выживаемости: фотореактивация должна быть предотвращена
Химические агенты
Аналоги оснований: 2-аминопурин, 5-брому- рацил ошибки в репликации ДНК транзиции низкая слабый мутаген
Гидроксиламин дезаминирование цитозина транзиции низкая те же
Азотистая кислота дезаминирование цито- зина и аденина транзиции, делении средняя высокая частота мутаций достигает- ся только в условиях низкой выжи- ваемости
Нитрозогуаиидин алкилирование основа- ний в репликационной вилке транзиции, трансверсии, с низкой частотой делеции очень высокая опасен в обращении, высокая частота вторичных мутаций
Окончание табл. 13
1 2 3 4 5
Этилметансульфонат алкилирование гуанидина транзиции, трансверсии высокая опасен в обращении, по сравнению с нитрозогуанидином — меньше вторич- ных мутаций
Акридиновые красители, бромистый этидий интеркаляция между основаниями во время репликации ДН1\ мутации со сдви- гом рамки, не- большие вставки, делеции низкая эффективен при излечивании клеток от плазмид
Биологические агенты
Гены-мутаторы нарушение процессов репликации и репара- ции ДНК, транзиции, трансверсии средняя необходимо генетическое конструиро- вание штаммов
Транспозирующиеся элементы (IS-элементы, транспозоны, фаг Ми и др.) встраивание в ДНК вставки, изредка делеции очень высокая необходимо генетическое конструиро- вание штаммов и/или векторов
Азотистая кислота. Раствор азотистой кислоты готовят непос-
редственно перед использованием, растворяя нитрат натрия в
0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 4,6) до конечной концентрации
0,05 М.
Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе
роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объе-
мом Na-ацетатного буфера, ресуспендируют в 1 мл раствора азо-
тистой кислоты и инкубируют при 30—37° в течение определенно-
го времени. Время обработки подбирают предварительно таким
образом, чтобы выживаемость клеток составляла 0,01—0,1%.
Клетки обрабатывают азотистой кислотой в течение 10—20 мин.
После окончания инкубации к клеткам добавляют 5—10 мл мини-
мальной среды, чтобы остановить реакцию. Затем клетки осажда-
ют центрифугированием, ресуспендируют в 10 мл богатой пита-
тельной среды и выращивают в течение ночи.
Алкилирующие агенты. Из алкилирующих соединений в ка-
честве мутагена наиболее широко используют этилметансульфонат
(ЭМС). Клетки (обычно из 5 мл культуры в поздней экспоненци-
альной фазе роста) осаждают центрифугированием и ресуспенди-
руют в 2 мл минимальной питательной среды без источника угле-
рода, содержащей 0,2 М трмс-НС1(рН 7,5). К суспензии клеток
добавляют 0,03 мл ЭМС, энергично перемешивают до его полного
растворения и инкубируют при 30—37° в течение 1—2 ч (жела-
тельно на качалке). Затем к суспензии клеток добавляют 10—15
мл минимальной или богатой питательной среды и инкубируют в
течение ночи.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С МУТАГЕНАМИ
Физические и химические мутагены не только увеличивают
частоту мутаций: многие из них обладают канцерогенным действи-
ем, способным вызвать опухоли у млекопитающих. Кроме того,
химические мутагены при попадании на кожу или внутрь могут
привести к ожогам и отравлению.
При работе с мутагенами следует строго соблюдать следующие
правила:
1. Любую работу с химическими мутагенами необходимо прово-
дить в вытяжном шкафу, рабочая поверхность которого застеле-
на фильтровальной бумагой.
2. Руки должны быть защищены резиновыми или пластиковы-
ми перчатками.
3. Растворы мутагенов нельзя засасывать ртом; следует ис-
пользовать автоматические пипетки или пипетки с резиновой гру-
шей.
4. Растворы мутагенов нельзя сливать в раковину; лучше про-
питать ими соответствующие твердые материалы (такие, как вер-
микулит) и поместить в герметичный контейнер, подобно другим
опасным отходам.
178
5. При работе с источниками УФ-лучей следует защищать гла-
за стеклянными очками.
10.2.4 . Экспрессия мутаций
У микроорганизмов в экспоненциальной фазе роста культуры
скорость деления хромосомы (у бактерий) или ядер (у эукарио-
тических клеток) обычно опережает скорость деления клеток.
Поэтому для проявления возникших мутаций, большинство из ко-
торых являются рецессивными, необходим так называемый сег-
регационный лаг-период, в течение которого происходит образо-
вание клеток, содержащих только мутантные хромосомы или яд-
ра. Кроме того, для проявления некоторых мутаций необходим
дополнительный фенотипический лаг-период. Например, для про-
явления мутаций устойчивости к фагу у Е. colt необходимо, чтобы
все рецепторы клеточной стенки заменились на мутантные. Это
происходит только после двенадцати дополнительных делений.
В связи с этим суспензию клеток микроорганизма, обработанную
мутагеном, необходимо подрастить в течение определенного пе-
риода времени. Длительность этого периода зависит как от ско-
рости деления клеток, так и от специфики роста. Например, для
микроорганизмов, клетки которых при росте образуют цепочки
или гроздья, этот период больше, чем для штаммов, растущих в
виде одиночных клеток.
Таким образом, после подращивания клеток не все мутанты,
которые обнаруживаются в культуре, являются независимыми, т. е.
часть мутантных клеток происходит от одной исходной мутантной
клетки в результате ее размножения. Поэтому, чтобы получить
ряд независимых мутантов, культуру после обработки мутагеном
необходимо разделить на ряд субкультур и из каждой субкульту-
ры отбирать только по одному мутанту.
10.3. ОТБОР МУТАНТОВ
10.3.1. Прямой отбор мутантов
Использование селективных сред, т. е. сред, на которых спо-
собны расти клетки только определенного фенотипа, позволяет в
ряде случаев проводить прямой отбор мутантов. К таким мутан-
там относятся клетки, приобретшие устойчивость к какому-либо
веществу, например, антибиотику, токсичному соединению или
фагу. Во всех этих случаях селективная среда должна содержать
соответствующую добавку (например, антибиотик), подавляющую
рост клеток дикого типа. Кроме того, прямым отбором могут быть
выделены мутанты, способные к утилизации нетрадиционных ис-
точников углерода или азота. В данном случае, наоборот, в селек-
тивной среде должен отсутствовать какой-либо фактор, необходи-
мый для роста клеток дикого типа.
Существенной особенностью при прямом отборе мутантов яв-
ляется выбор оптимальной концентрации селективного агента, в
179
которой он подавляет рост клеток дикого типа, но в то же время
позволяет расти устойчивым к ним мутантам. Поэтому предвари-
тельно рекомендуется определить кривую выживаемости клеток в
зависимости от концентрации селективного.агента.
С помощью селективных сред можно также отбирать клетки-
ревертанты, т. е. клетки, у которых в результате обратных мута-
ций, истинных или супрессорных, произошло восстановление
свойств штамма дикого типа. Метод прямого отбора обладает
высокой чувствительностью, поскольку позволяет выявлять ред-
кие мутантные клетки на фоне немутировавших клеток.
10.3.2. Непрямой отбор мутантов
Использование индикаторных сред. Индикаторные среды, т. е.
среды, на которых колонии микроорганизма с разными фенотипа-
ми отличаются по внешнему виду, широко используются в генети-
ке микроорганизмов, в частности, для непрямой селекции мутан-
тов. Они позволяют различать фенотипы по цвету колоний. Инди-
каторные среды бывают двух типов: с индикаторами на использо-
вание веществ и с хромогенными субстратами.
Среды с индикаторами на использование веществ содер-
жат какой-либо углевод (например, лактозу) и индикатор (хло-
рид трифенилтетразолия, эозин-метиленовый синий, индикатор
Мак-Конки и другие), меняющий свой цвет в зависимости от pH
среды.
На среде с лактозой и трифенилтетразолием клетки Е. coll,
использующие лактозу, образуют кислоты и понижают pH среды.
При низких значениях pH восстановления трифенилтетразолия не
происходит и колонии имеют нейтральный или белый цвет. Коло-
нии, состоящие из клеток, не способных использовать лактозу,
имеют ярко-красную окраску. Напротив, на среде с индикатором
Мак-Конки, содержащей лактозу, колонии, клетки которых спо-
собны использовать ее, приобретают темно-красный цвет. Клетки,
не способные использовать лактозу, образуют колонии белого
цвета.
Применение индикаторных сред пригодно для поиска любых
мутантов, если имеется возможность различать колонии мутантов
по изменению их окраски. С помощью индикаторных сред можно,
например, выявлять мутанты по фосфатазной, нуклеазной или
протеолитической активности.
Важной особенностью метода индикаторных сред является под-
бор оптимального разведения культуры при посеве на агаризо-
ванные среды. Количество колоний на чашке не должно быть
слишком большим (обычно не более 100), иначе фенотипы сосед-
них колоний (например, из-за подкисления среды) могут быть вы-
ражены нечетко.
Среды с хромогенными субстратами содержат спе-
циальные субстраты, разлагающиеся с образованием красителя
при их гидролизе определенными ферментами, наличие которых
180
Рис 71 Игольча-
тый репликатор
тестируется. Такие субстраты либо просто добавляют в среду, ли-
бо опрыскивают ими среды в чашках после того, как на них вы-
росли колонии. В качестве хромогенного субстрата широко ис-
пользуют X-gal (5-бром4-хлор-3-индолил-|р-В-галактозид), с по-
мощью которого обнаруживают наличие ^-галактозидазы, одного
из ферментов, необходимых для утилизации лактозы. Клетки, син-
тезирующие ^-галактозидазу, расщепляют X-gal с образованием
5-бром-4-хлориндиго, который окрашивает колонии в ярко-синий
цвет.
Метод отпечатков. Один из широко используемых методов вы-
явления мутантов получил название метода отпечатков, или реп-
лик. Чашки Петри с полноценной агаризованной неселективной
средой засевают мутагенизированной культурой или суспензией
клеток в соответствующем разведении, получая таким образом ис-
ходную матричную чашку. После появления колоний к поверхнос-
ти среды в чашке прикасаются кусочком стерильного бархата,
натянутого на цилиндрическую болванку (рис. 70). Вместо барха-
та можно пользоваться фильтровальной бумагой. На поверхность
бархата переносятся (отпечатываются) клетки из колоний. После
этого бархат прикладывают к поверхности среды в чашке или в
чашках с селективными средами. Таким образом можно сделать
до 10 отпечатков (реплик). Колонии, которые растут на неселек-
тивной среде, но не растут на какой-либо селективной среде,
проверяют на наличие мутаций. Метод отпечатков за короткое
время позволяет проверить тысячи колоний и особенно полезен
для выявления ауксотрофов.
Исходную матричную чашку можно приготовить и иным спо-
собом: с помощью игольчатого репликатора (рис. 71). Таким сте-
рильным игольчатым репликатором, имеющим 50—100 цилиндри-
ческих иголок, расположенных в определенном порядке, слегка
прикасаются к поверхности неселективной среды в чашке. Эту
операцию следует проводить аккуратно, чтобы иголки не прока-
лывали агар. Затем с помощью стерильных спичек или стериль-
ных заостренных полосок толстой бумаги переносят клетки из ко-
лоний с чашек, на которых выросли мутагенизированные клетки,
на матричную чашку на следы уколов. После инкубации матрич-
181
ной чашки до образования колоний с помощью того же реплика-
тора делают отпечатки на ряд селективных сред.
10.3.3. Пенициллиновый метод обогащения мутантными
клетками у бактерий
Возникновение мутаций, даже при их индукции сильными му-
тагенами, — относительно редкое событие. При прямых методах
селекции это обстоятельство не играет существенной роли, пос-
кольку с помощью селективных сред элиминируются все нему-
тантные клетки. При использовании непрямых методов низкая
частота мутирования может стать фактором, ограничивающим их
разрешающую способность, поскольку поиск редких мутантных
колоний приходится проводить на значительном фоне немутант-
ных колоний. Повысить частоту мутантных клеток в популяции
можно с помощью метода обогащения, элиминируя значительную
часть немутантных клеток. При работе с бактериями чаще всего
используют пенициллиновый метод обогащения. Пенициллин по-
давляет синтез клеточной стенки (муреина) и вызывает гибель
только активно растущих клеток. Если культуру, содержащую му-
тантные (например, ауксотрофные) и немутантные клетки, выра-
щивать на минимальной среде, то в такой среде будут размно-
жаться только немутантные клетки. После внесения в такую сре-
ду пенициллина происходит гибель только немутантных клеток,
и популяция обогащается мутантами. В оптимальных условиях
можно достичь 1000-кратного обогащения культуры мутантами.
При использовании пенициллинового метода необходимо соб-
людать ряд условий.
1. Обрабатываемая пенициллином суспензия или культура
должна содержать не более 107 клеток/мл. При использовании бо-
лее густых суспензий продукты лизиса клеток, погибших от пени-
циллина, могут служить источниками ростовых факторов для
мутантных клеток, в результате чего они начнут расти и также
повергаться действию пенициллина.
2. Перед обработкой пенициллином бактерии должны быть
проинкубированы в минимальной среде в течение времени, доста-
точного для 3—4 делений. За этот период происходит истощение
эндогенных метаболитов в мутантных клетках, что предохраняет
их от гибели в присутствии пенициллина.
10.4. ПЕРЕНОС ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ У БАКТЕРИИ
У бактерий существуют три способа, или процесса, переноса
генетической информации, приводящие к рекомбинации генетичес-
кого материала: трансформация, конъюгация и трансдукция, ши-
роко используемые в генетических экспериментах.
Трансформацией называют процесс переноса генетической ин-
формации, в результате которого экзогенная ДНК проникает в
реципиентную клетку и вызывает ее наследственные изменения.
182
При этом ДНК может представлять весь донорный геном либо
его часть.
Передачу в клетку целого генома фага, приводящую к образо-
ванию в них зрелых фаговых частиц, называют трансфекцией. По
способу переноса ДНК в бактериальную клетку этот процесс яв-
ляется трансформацией, однако в отличие от последней в резуль-
тате трансфекции происходит лизис клетки, а не ее наследствен-
ное изменение.
Конъюгацией называют процесс переноса генетической инфор-
мации из клетки-донора в клетку-реципиент, который осуществля-
ется при непосредственном их контакте между собой.
Трансдукцией называют процесс переноса генетической инфор-
мации из клетки-донора в клетку-реципиент, осуществляемый фа-
гом.
Общим свойством всех трех процессов является их однонап-
равленность, т. е. всегда одна клетка выступает в роли донора
ДНК, а другая — в роли реципиента. Взаимного (реципрокного)
обмена генетической информации у бактерий не происходит.
В экспериментальной работе наиболее часто используют мето-
ды, основанные на процессах трансформации и конъюгации.
10.4.1. Трансформация
Трансформация может осуществляться как хромосомной, так и
плазмидной ДНК. Реципиентная клетка, в которой происходит
экспрессия генетического материала донора, называется транс-
формантом. Важное условие способности клетки к трансформа-
ции — развитие у нее особого физиологического состояния —
компетентности. По развитию состояния компетентности микро-
организмы можно разделить на три группы.
1. Микроорганизмы, у которых компетентность возникает лишь
в определенной фазе роста культуры (например, стрептококки,
бациллы).
2. Микроорганизмы, клетки которых компетентны в любой фа-
зе роста (например,гонококки, менингококки).
3. Микроорганизмы с отсутствием естественной компетенции.
Клетки таких микроорганизмов становятся компетентными только
после специальной обработки (например, клетки Е. coli становят-
ся компетентными после обработки на холоду хлористым каль-
цием).
Посев трансформированных клеток на селективные среды не-
обходимо производить после определенного времени их инкубации
в богатой питательной среде. В период такой инкубации в клет-
ках-трансформантах происходит экспрессия полученных ими но-
вых маркеров (генов) и они приобретают новый фенотип.
У ряда микроорганизмов с естественной компетентностью
внутрь клетки проникает только однонитевая ДНК. Поэтому
трансформация плазмидными ДНК, которые находятся в ковалент-
но-замкнутой суперскрученной форме, не осуществляется или осу-
183
ществляется с низкой эффективностью. Чтобы увеличить эффек-
тивность трансформации, следует предварительно получить прото-
пласты клеток.
При проведении трансформации у бактерий с естественной ста-
дией компетентности необходимо учитывать факторы, влияющие
на такое состояние: температуру, состав среды и ее pH, наличие
определенных концентраций двухвалентных катионов.
В последнее время распространение получил метод трансфор-
мации, названный электропорацией. Электропорация — введение
ДНК в клетки с помощью электрических импульсов, создаваемых
специальной аппаратурой. Электропорация является перспектив-
ным методом, поскольку позволяет вводить ДНК в клетки микро-
организмов, для которых системы трансформации неизвестны или
осуществляются с низкой эффективностью.
Для различных микроорганизмов, у которых описан процесс
трансформации, разработаны свои методы получения компетент-
ных клеток и их трансформации. В данном руководстве мы при-
водим методику приготовления компетентных клеток Е. coli
штамма С600 и их трансформации плазмидными ДНК с высо-
кой эффективностью.
Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli. Имеется боль-
шое количество методов выделения препаратов плазмидной ДНК,
пригодной без ее дальнейшей очистки для трансформации клеток
Е. coli. Одним из широко распространенных методов является
метод выделения плазмидных ДНК с помощью лизиса клеток ки-
пячением (Holmes, Quigley, 1981). Ниже приводится указанный
метод в несколько модифицированном варианте.
Клетки из ночной культуры Е. coli (1,5—5 мл) осаждают цент-
рифугированием при 11 тыс. об/мин в течение 3 мин в пробирках
Эппендорф. Супернатант тщательно сливают, а осадок ресуспен-
дируют для лизиса в 350 мкл STET-буфера (8%-ная сахароза,
5'%-ный тритон Х-100, 50 мМ ЭДТА-Naz, 50 мМ трис-НС1; pH
8,0). Добавляют 25 мкл раствора лизоцима в дистиллированной
воде (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют смесь при комнат-
ной температуре в течение 5 мин. Пробирки переносят в кипя-
щую водяную баню и инкубируют в течение 40 с. Затем получен-
ные лизаты центрифугируют при 11 тыс. об/мин в течение 30 мин
и образовавшийся осадок (лизированные клетки, денатурирован-
ные белки и денатурированная хромосомная ДНК) удаляют чис-
той спичкой или переносят супернатант в чистую пробирку. В
пробирку добавляют 174 мкл 7,5 М раствора ацетата аммония и
300 мкл изопропилового спирта, перемешивают и инкубируют при
—20° в течение 15 мин. В этих условиях происходит преципита-
ция ДНК, тогда как неденатурированные белки остаются в раст-
воре. Преципитат осаждают центрифугированием при 11 тыс.
об/мин в течение 15 мин. Осадок дважды промывают 1,5 мл7Ц%-
ного этанола, охлажденного до —20° (этанол следует аккуратно
добавлять в пробирку, не перемешивая осадка; центрифугирова-
ние проводят, как указано выше, в течение 10 мин). Полученный
184
осадок (беловатый налет на дне пробирки) высушивают струей
воздуха (можно использовать фен) и растворяют в 50 мкл ТЕ-бу-
фера (10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА-Ыа2, pH 7,5). При необхо-
димости раствор ДНК следует хранить при —20 °.
Получение компетентных клеток Е. coli. Ночную культуру
Е. coli штамма С600, выращенную без аэрации, разводят в 20 раз
теплой средой LB (см. Приложение) и инкубируют на качалке
при 37° в течение 90—100 мин. Клетки осаждают центрифугиро-
ванием на холоду, ресуспендируют в 1/2 объема 10 мМ раствора
хлористого кальция при 4°, осаждают центрифугированием на
холоду и ресуспендируют в 1/20 от исходного объема 100 мМ
раствора хлористого кальция при 4°.
Приготовленные таким образом клетки Е. coli сохраняют ком-
петентность при их инкубации во льду в течение суток. Компетент-
ность утрачивается даже при незначительном и кратковремен-
ном повышении температуры. Для более длительного хранения к
компетентным клеткам добавляют глицерин до конечной концент-
рации 15%, разливают аликвоты по 0,2 мл, замораживают и хра-
нят при —2...—80°.
Трансформация компетентных клеток Е. coll, К 0,2 мл компе-
тентных клеток Е. coli добавляют 1—10 мкл плазмидной ДНК
(1 —100 нг) и инкубируют клетки во льду в течение 30—45 мин.
Затем клетки подвергают тепловому шоку, помещая их на 5—10
мин при 42°. Добавляют к клеткам 0,5 мл среды LB и инкубиру-
ют с аэрацией при 37° в течение 2 ч. После инкубации высевают
по 0,1 мл культуры на чашки с селективной средой и инкубируют
в течение 16—24 ч.
10.4.2. Конъюгация
Процесс конъюгации у бактерий обусловлен наличием в клет-
ках-донорах определенных плазмид, названных конъюгативными.
Конъюгативные плазмиды содержат в своем составе tra-гены. Эти
гены кодируют формирование половых волосков-пилей, за счет ко-
торых происходит образование скрещивающихся (конъюгирую-
щих) пар, обеспечивающих конъюгативный перенос плазмидной
или хромосомной ДНК в клетку-реципиент. Плазмиды, не способ-
ные к конъюгативному переносу, называются неконъюгативными.
Первой описанной конъюгативной плазмидой, обеспечивающей
конъюгацию у Е. coli К-12, является половой фактор F (fertility).
Фактор F, существующий в автономном состоянии, способен с вы-
сокой эффективностью передаваться из клеток-доноров реципи-
ентам. При интеграции полового фактора в хромосому Е. coli об-
разуются штаммы Hfr (high frequency of recombination), способ-
ные переносить хромосомную ДНК в реципиентные клетки. Реци-
пиентные клетки, в которых происходит экспрессия генетического
материала донора, называются трансконъюгантами.
При проведении экспериментов по конъюгации необходимо учи-
тывать следующее.
185
1. Перенос конъюгативной плазмиды и хромосомы донора в
случае Hfr-штаммов начинается с определенной точки на плазми-
де, называемой oriT.
2. Перенос хромосомы донора происходит ориентированно, т. е.
гены переносятся в той последовательности, в которой они распо-
ложены на хромосоме. Начало переноса связано с местом интег-
рации конъюгативной плазмиды в хромосому донорного штамма
и ее ориентацией.
3. Скорость переноса хромосомных маркеров зависит от тем-
пературы, но в стандартных условиях скрещивания является ве-
личиной постоянной. Каждый генетический детерминант донора
попадает в реципиентную клетку через определенное время после
начала скрещивания.
4. Перенос является частичным. Во время передачи хромосомы
происходят ее спонтанные разрывы. Поэтому возникающие зиготы
содержат только часть генома донора и являются неполными (ме-
розиготы).
На использовании конъюгации основаны три метода генети-
ческого анализа у бактерий.
1. Определение частот рекомбинации между генетическими
маркерами. Из-за очень высокой частоты кросинговера маркеры,
удаленные друг от друга на расстояние более трех минут перено-
са, ведут себя как несцепленные. Данный метод обладает высокой
разрешающей способностью при анализе тесно сцепленных генов
и при внутригенном картировании.
2. Определение последовательности генов на хромосоме по гра-
диенту их передачи.
3. Локализация генов по времени их проникновения в реципи-
ентную клетку — картирование методом прерывания конъюгации.
Мобилизация неконъюгативных плазмид'. Определенные не-
конъюгативные плазмиды способны передаваться в реципиентные
клетки в присутствии определенных конъюгативных плазмид. Дан-
ное явление получило название мобилизации неконъюгативных
плазмид. Известны два основных механизма мобилизации не-
конъюгативных плазмид. Во-первых, перенос неконъюгативных
плазмид осуществляется за счет продуктов tra-генов конъюгатив-
ных плазмид. Такой перенос требует функционирования собствен-
ных генов mob и начинается с собственного сайта ori,T. При этом
механизме мобилизации перенос конъюгативной плазмиды в ре-
ципиентную клетку может и не происходить. По такому механиз-
му происходит, например, мобилизация плазмид ColEl и RSF1010.
Во-вторых, перенос неконъюгативных плазмид в реципиентные
клетки может осуществляться в составе коинтегратов с конъюга-
тивными плазмидами. Коинтеграт представляет собой единую мо-
лекулу ДНК, объединяющую два или более репликонов. Образо-
вание коинтегратов в основном может происходить либо за счет
реципрокной рекомбинации по участкам гомологии двух различ-
ных плазмид, либо за счет транспозиции IS-элементов и транспо-
186
зонов. По такому механизму, например, происходит мобилизация
широко используемых векторных плазмид серии pBR.
Интеграция полового фактора в хромосому, приводящая к об-
разованию Hfr-штаммов, также является примером формирова-
ния коинтегратов. В данном случае в единую молекулу ДНК
объединены два репликона — плазмида (половой фактор) и хро-
мосома.
Мобилизация неконъюгативных плазмид широко использует-
ся в практике генетических экспериментов. Этот метод менее тру-
доемок, чем трансформация и, кроме того, позволяет вводить не-
конъюгативные плазмиды в клетки микроорганизмов, для кото-
рых не разработаны системы трансформации.
Для мобилизации неконъюгативных плазмид можно исполь-
зовать также трехродительские скрещивания, когда мобилизуе-
мая и мобилизующая плазмиды находятся в разных донорных
штаммах. Трехродительские скрещивания обладают рядом пре-
имуществ по сравнению с двухродительскими. Прежде всего от-
падает необходимость конструировать донорный штамм, содер-
жащий две плазмиды. Кроме того, трехродительские скрещива-
ния позволяют преодолеть барьер несовместимости, когда моби-
лизуемая и мобилизующая плазмиды относятся к одной группе
несовместимости. '
Постановка скрещивания. Существует несколько способов
скрещивания бактериальных штаммов при помощи конъюгации:
в жидкой среде, на поверхности питательного агара, на мембран-
ных фильтрах. Выбор способа скрещивания определяется типом
конъюгативной плазмиды и целью эксперимента. Самым прос-
тым способом является скрещивание в жидкой .среде. В этих ус-
ловиях с высокой эффективностью происходит скрещивание,
обусловленное половым фактором F и родственными ему плазми-
дами. Однако этот метод имеет ограниченное ^применение, по-
скольку многие плазмиды детерминируют образование коротких
пилей (например, плазмиды P-группы несовместимости), которые
в условиях жидкой среды не обеспечивают тесного контакта меж-
ду клетками. Для создания такого тесного контакта между клет-
ками скрещивание проводят непосредственно в чашке с агаризо-
ванной питательной средой или на мембранном фильтре, поме-
щенном на поверхность агаризованной питательной среды. Пос-
ледний способ более удобен в случае, когда необходимо провести
одновременно несколько скрещиваний. Для скрещивания исполь-
зуют мембранные фильтры, задерживающие микроорганизмы,
т. е. с диаметром пор 0,45 или 0,22 мкм.
Детальное описание экспериментов, основанных на конъюга-
ции, для генетического анализа у бактерий можно найти в ряде
руководств (см. список литературы). В данном пособии мы при-
водим общую методику постановки конъюгации скрещиваний на
примере мобилизации неконъюгативной плазмиды RSF1010
конъюгативной плазмидой RP1.
187
Родительские штаммы микроорганизмов, используемые в скре-
щивании, должны различаться между собой генетическими мар-
керами, например маркерами ауксотрофности или устойчивости к
антибиотикам. В случае Е. coli одним штаммом, например, может
быть С600 (thr leu thi), а другим — J53 (pro met). Допустим, что
один из штаммов С600 содержит конъюгативную плазмиду RP1
(кодирующую устойчивость к ампициллину, тетрациклину и
канамицину), а второй штамм С600 содержит неконъюгативную
плазмиду RSF1010 (кодирующую устойчивость к сульфанилами-
дам и стрептомицину), которую нужно передать в штамм J53.
Для скрещивания используют молодые, активно растущие
культуры, причем концентрация реципиентных клеток должна
значительно (примерно в 10 раз) превышать концентрацию до-
норных клеток. С этой целью ночные культуры всех трех штам-
мов Е. coli (выращивать можно без аэрации) разводят примерно
в 5 раз теплой средой LB и подращивают в течение 90—100 мин.
Затем в пробирке (удобно использовать пробирки Эппендорф)
смешивают по 20 мкл донорных культур, т. е. штаммов с плазми-
дами RP1 и RSF 1010, и 0,1 мл культуры реципиента. Растира-
ют смесь шпателем по поверхности среды LB-arap и чашку ин-
кубируют при 37° в течение 3 ч. По окончании скрещивания клет-
ки смывают шпателем с поверхности агара 2 мл физраствора и
делают 10-кратное серийное разведение конъюгационной смеси в
физрастворе до 1Q-5. Затем пробы по 0,1 мл из разведений 10-3 и
10-5 высевают на чашки с селективными средами. Одна чашка
должна содержать селективную среду с одним из антибиотиков
для отбора трансконъюгантов, получивших плазмиду RP1 (ка-
намицин — 50 мкг/мл, тетрациклин — 20 мкг/мл, тетрациклин —
20 мкг/мл, тетрациклин — 20 мкг/мл, ампициллин — 100 мкг/мл),
другая — со стрептомицином (50 мкг/мл) для отбора трансконъ-
югантов, получивших плазмиду RSF1010. В качестве основы для
селективной среды используют минимальную среду А (с добавка-
ми пролина и метионина), на которой могут расти только клетки
штамма J53. В качестве контроля на селективные чашки засевают
по 0,1 мл культур родительских штаммов, чтобы убедиться в не-
способности клеток этих штаммов образовывать колонии на се-
лективных средах. Засеянные чашки помещают в термостат при
37° на 48 ч. По окончании инкубации проводят подсчет трансконъ-
югантов в чашках с селективными средами. Частота мобилизации
неконъюгативной плазмиды RSF1010 определяется как отношение
количества трансконъюгантов, получивших маркер неконъюгатив-
ной плазмиды, к количеству трансконъюгантов, получивших мар-
кер конъюгативной плазмиды.
ГЛАВА 11
СИСТЕМАТИКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
11.1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ПРАВИЛА НАИМЕНОВАНИЯ
Описано несколько тысяч видов микроорганизмов, однако счи-
тают, что это составляет лишь около 5% от реально существую-
щих. Изучение разнообразия микроорганизмов составляет пред-
мет систематики. Основной ее задачей является создание естест-
венной системы, отражающей филогенетические взаимоотношения
микроорганизмов. До последнего времени систематика микроор-
ганизмов базировалась преимущественно на фенотипических приз-
наках: морфологических, физиологических, биохимических и
других. Поэтому существующие системы классификации носят в
значительной степени искусственный характер. Однако они по-
зволяют сравнительно легко идентифицировать некоторые вновь
выделенные штаммы микроорганизмов.
Систематика включает такие разделы, как классификация, но-
менклатура и идентификация. Классификация определяет поря-
док помещения индивидуумов, обладающих заданной степенью
•однородности, в определенные группы (таксоны). Номенклатура
представляет собой свод правил наименования таксонов. Иденти-
фикация означает определение принадлежности изучаемого орга-
низма к тому или иному таксону.
Термин «таксономия» часто используют как синоним система-
тики, однако иногда под ним понимают раздел систематики, вклю-
чающий теорию классификации, учение о системе таксономичес-
ких категорий, границах и соподчинении таксонов.
Основной таксономической категорией в микробиологии, как
и в других биологических науках, является вид. Вид — это со-
вокупность особей, характеризующихся рядом общих морфологи-
ческих, физиолого-биохимических, молекулярно-генетических приз-
наков.
Под термином «штамм» понимают чистую культуру микроор-
ганизма, выделенную из определенного места обитания (воды,
почвы, организма животного и т. д.). Разные штаммы одного ви-
да микроорганизмов могут различаться по некоторым признакам,
например, чувствительности к антибиотикам, способности синтези-
ровать некоторые продукты метаболизма и т. д., но эти различия
меньше чем видовые ’. Виды микроорганизмов объединяют в так-
1 Понятая «штамм» в микробиологии и генетике несколько различаются: в
микробиологии оно является более широким.
189
сономические категории более высокого порядка: роды, семейст-
ва, порядки, классы, отделы, царства. Эти категории называют
обязательными. Предусмотрены также необязательные катего-
рии: подкласс, подпорядок, подсемейство, триба, подтриба, под-
род, подвид. Однако в систематике необязательные категории ис-
пользуются довольно редко.
Номенклатура микроорганизмов подчиняется международным
правилам. Так, имеется Международный кодекс номенклатуры
бактерий. Для дрожжевых грибов основным руководством явля-
ется «The Yeasts. A Taxonomic Study», для мицелиальных грибов
и водорослей — Международный кодекс ботанической номенкла-
туры.
Для наименования объектов в микробиологии, как в зооло-
гии и ботанике, используют бинарную или биноминальную (от
лат. bis — дважды) систему номенклатуры, в соответствии с ко-
торой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских
слов. Первое слово означает род, а второе — определяет конкрет-
ный вид этого рода и называется видовым эпитетом. Родовое на-
звание всегда пишется с заглавной буквы, а видовое — со
строчной даже в том случае, если видовой эпитет присвоен в
честь ученого, например Clostridium pasteurianum. В тексте с ла-
тинской графикой все словосочетание обычно выделяют курсивом.
При повторном упоминании названия микроорганизма родовое
название можно сократить до одной или нескольких начальных
букв, например С. pasteurianum. Если в тексте встречаются на-
звания двух микроорганизмов, которые начинаются с одной и той
же буквы (например, Clostridium pasteurianum и Citrobac-
ter freundii, то сокращения должны быть разными (С. pasteuria-
num и Ct. freundii). Если микроорганизм идентифицирован толь-
ко до рода, вместо видового эпитета пишут слово sp. (species —
вид), например Pseudomonas sp. В этом случае при повторном
упоминании названия микроорганизма в тексте родовое название
следует всегда писать полностью; Pseudomonas sp.
Для наименования подвида используют словосочетание, состо-
ящее из названия рода, а также видового и подвидового эпитетов.
Для разграничения этих эпитетов между ними пишут буквенное
сочетание, представляющее собой сокращенное слово subspecies —
«subsp.» или реже «ss». Например, Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus.
Для каждого штамма указывают также аббревиатуру назва-
ния коллекции культур микроорганизмов, в которой он хранится,
и номер, под которым он там значится. Например, Clostridium
butyricum АТСС 19398 означает, что штамм хранится в американ-
ской коллекции типовых культур (American Type Culture
Collection, АТСС) под номером 19398. Список коллекций микро-
организмов, пользующихся мировой известностью, приводится в
Руководстве Берги по систематике бактерий (Bergey’s Manual of
190
Systematic Bacteriology, 1984—1989), в Каталоге культур микро-
организмов (Пущино, 1992) и других справочных изданиях.
Описание любого нового вида микроорганизма базируется на
типовом штамме, который хранится в одной из коллекций мик-
роорганизмов и на основании совокупности свойств которого ха-
рактеризуется данный вид в оригинальной статье или определи-
теле. Например, Bacillus subtilis АТСС 6051. Типовой штамм яв-
ляется номенклатурным типом вида, поскольку за ним закреплено
видовое название. Если какие-либо штаммы, первоначально вклю-
ченные в тот же вид, в дальнейшем будут признаны заслуживаю-
щими выделения в особые виды, они должны получить новые на-
звания, а старое видовое название сохраняется за типовым и род-
ственными ему штаммами. При этом номер переименованного
штамма сохраняется прежним. Для рода номенклатурным типом
является специально обозначенный типовой вид, обладающий на-
бором наиболее характерных для представителей данного таксо-
на признаков. Например, в роде Bacillus типовым видом является
В. subtilis.
В некоторых определителях и каталогах указывают старые на-
звания переименованных микроорганизмов, а также приводят фа-
милии авторов, которые первыми выделили данный микроорга-
низм, и год первой публикации. Например, вид дрожжей, называ-
емых в настоящее время Candida magnoliae (Lodder et Kreger-
van Rij, 1952) Meyer et Yarrow 1978 BKM — 1685, впервые был
выделен и описан Lodder и Kreger-van Rij в 1952 г. и назван
Torulopsis magnoliae.
Кроме понятия «штамм» в микробиологии применяют термины
«вариант», «тип», «форма». Они обычно используются для обозна-
чения штаммов микроорганизмов, отличающихся по некоторым
признакам от типового штамма. Штамм, отличающийся от типо-
вого по морфологическим особенностям, называют морфовар
(морфотип), физиолого-биохимическим свойствам — биовар (био-
тип, физиологический тип), способности синтезировать определен-
ные химические соединения — хемовар (хемоформа, хемотип), ус-
ловиям культивирования — культивар, типответа на внедрение
бактериофага — фаговар (фаготип, лизотип), антигенным харак-
теристикам — серовар (серотип) и т. д.
В работах по генетике микроорганизмов часто используют тер-
мин «клон», под которым подразумевают популяцию генетически
родственных клеток, полученную неполовым путем из одной роди-
тельской клетки. В молекулярной биологии клоном называют мно-
жественные копии идентичных последовательностей ДНК, полу-
ченные при их встраивании в клонирующие векторы (например,
плазмиды). Под термином «генетически модифицированные», или
«рекомбинантные», штаммы понимают штаммы микроорганизмов,
полученные в результате генно-инженерных манипуляций. Часто
новые штаммы микроорганизмов получают с помощью мутагенов.
Каждый новый штамм микроорганизмов, выделенный из при-
191
родных или техногенных источников, должен быть охарактеризо-
ван для получения полного набора данных о свойствах микроор-
ганизма в чистой культуре. Эти данные могут быть использованы,
например, для составления паспорта ценных в промышленном от-
ношении штаммов, а также для их идентификации.
Цель идентификации — установить таксономическое положе-
ние исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с
изученными и принятыми (официально зарегистрированными) ви-
дами. Поэтому результатом идентификации обычно является
отождествление исследуемого микроорганизма с каким-нибудь ви-
дом или отнесение к определенному роду. Если исследуемый
штамм или группа штаммов отличаются по своим свойствам от
представителей известных таксонов, то они могут быть выделены
в новый таксон. Для этого дают описание нового таксона, вклю-
чающее, например, в случае бактерий следующее: перечень штам-
мов, входящих в таксон; характеристику каждого штамма; пере-
чень свойств, рассматриваемых в качестве существенных в таксо-
не; перечень свойств, которые квалифицируют таксон для предста-
вительства в ближайшем более высоком таксоне; перечень диаг-
ностических характеристик, дифференцирующих предлагаемый
таксон от близко родственных таксонов; отдельное описание ти-
пового (для вида) штамма; фотографию микроорганизма.
Чтобы вновь предлагаемый таксон мог быть официально при-
нят, его описание дложно быть опубликовано в соответствии с
определенными правилами. Например, действительное опублико-
вание таксона бактерий предусматривает помещение статьи с его
описанием в Международном журнале по систематике бактерий
«International Journal of Systematic Bacteriology» (USB) или в
другом журнале с последующим направлением оттиска статьи с
его описанием в USB. Культура типового штамма нового вида
микроорганизмов передается на хранение в одну из коллекций
микроорганизмов мирового значения. В случае утери типового
штамма возможна его замена на так называемый неотиповой
штамм. При этом должно быть подтверждено, что свойства ново-
го штамма хорошо совпадают с описанием утерянного. Чтобы по-
казать, что таксон предлагается впервые, после названия нового
рода добавляется сокращенная комбинация «gen. nov», а для но-
вого вида — «sp. nov». Например, в 1970 г. В. М. Горленко пред-
ложил новый род бактерий — Prosthecochloris gen nov. и его вид
Р. aestuarii sp. nov. В дальнейшем при первичном использовании
этих названий в публикации другими исследователями вместо
указанных комбинаций ставится фамилия ученого, выделившего и
описавшего микроорганизм, в данном случае Prosthecochloris
aestuarii Gorlenko, 1970. Однако такая информация о виде дается
не всегда, обычно приводится только его родовое название и ви-
довой эпитет. Информацию об авторе, выделившем штамм, и да-
те первой публикации штамма при необходимости берут из оп-
ределителей и каталогов.
192
112. ОПИСАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Как уже отмечалось выше, принципы классификации и иденти-
фикации разных групп прокариот и эукариотных микроорга-
низмов имеют существенные различия. Идентификация грибов до
классов, порядков и семейств основана на характерных чертах
строения и способах образования в первую очередь половых
структур. Кроме того, используется характеристика бесполых спо-
роношений, строение и степень развития мицелия (зачаточный,
хорошо развитый, септированный или несептированный), культу-
ральные (колония) и физиологические признаки. Дифференциа-
ция родов внутри семейств и идентификация видов проводятся с
применением морфологических признаков, полученных с исполь-
зованием электронной микроскопии, а также фенологических и
культуральных особенностей. Единого определителя для иденти-
фикации всех грибов не существует, поэтому вначале определяют
класс или порядок идентифицируемого гриба и далее пользуются
соответствующим определителем для этого класса или порядка.
Идентификация дрожжевых грибов, которые относятся к чис-
лу широко используемых объектов разных микробиологических
исследований, основана на культуральных (макроморфологичес-
ких), цитологических, физиолого-биохимических особенностях, ха-
рактеристике жизненных циклов и полового процесса, специфичес-
ких признаках, связанных с экологией, и проводится с использо-
ванием специальных определителей для дрожжей.
В основе систематики микроскопических форм водорослей ле-
жит строение их клеток и состав пигментов. Определение систе-
матического положения простейших проводится с использованием
морфологических особенностей и жизненных циклов. Таким об-
разом, идентификация эукариот базируется главным образом на
особенностях их морфологии и циклов развития.
Идентификация прокариот, которые морфологически менее
разнообразны, чем эукариоты, основана на использовании широ-
кого спектра фенотипических, а во многих случаях и генотипичес-
ких признаков. Она в большей степени, чем идентификация эука-
риот, основывается на функциональных признаках, поскольку
большинство бактерий можно идентифицировать не по их внешне-
му виду, а только выяснив, какие процессы они способны осуще-
ствлять.
При описании и идентификации бактерий изучают их культу-
ральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-
биохимические особенности, химический состав клеток, содержа-
ние гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК и другие фено- и генотипи-
ческие признаки. При этом необходимо соблюдать следующие пра-
вила. работать с чистыми культурами, применять стандартные
методы исследования, а также использовать для инокуляции
клетки, находящиеся в активном физиологическом состоянии.
Культуральные свойства, т. е. характерные особенности роста
бактерий на плотных и жидких питательных средах (см. гл. 9)
193
обычно используют для их характеристики, однако для идентифи-
кации применяют довольно редко.
Морфологическая характеристика и организация клеток бак-
терий (см. гл. 6) включает такие признаки, как форма и размеры
клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования,
способность к спорообразованию. Полезным может оказаться
также выявление в клетках характерных мембранных систем и
органелл (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом, газовых вакуо-
лей и т. д.), присущих отдельным группам бактерий, а также
включений (параспоральных телец, гранул волютина, поли-^-гид-
роксибутирата, полисахаридов и т. д.). Первостепенное значение
для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и
строению их клеточных стенок.
Физиолого-биохимические свойства включают прежде всего
установление способа питания исследуемой бактерии (фото/хемо-,
авто/гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способ-
ность к брожению, аэробному или анаэробному дыханию или фо-
тосинтезу). Важно определить такие признаки, как отношение
бактерии к молекулярному кислороду, температуре, pH среды, со-
лености, освещенности и другим факторам среды В данную груп-
пу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в
качестве источников углерода, азота и серы, потребность в вита-
минах и других факторах роста, образование характерных про-
дуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого
используют специальные тесты (см. гл. 9).
Многие тесты, применяемые для обнаружения перечисленных
признаков (их иногда называют рутинными тестами), важны для
диагностики и широко используются в медицинской микробиоло-
гии. Их постановка требует значительных затрат времени, боль-
шого количества сложных сред и реактивов, соблюдения стан-
дартных условий проведения. Для ускорения и облегчения про-
цесса идентификации некоторых микроорганизмов, имеющих
главным образом медицинское значение, разработаны различные
тест-системы: API-20E, Enterotube, Mycotube, Parho-Tec, СИВ,
ПБДЭ и другие. Например, система Enterotube, предназначенная
для идентификации энтеробактерий, представляет собой пласти-
ковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагно-
стические среды. Засев всех сред производится поступательно-
вращательными движениями через камеру петли с посевным ма-
териалом. Инкубацию проводят в течение 24 ч при 37°. О поло-
жительном или отрицательном результате теста судят по измене-
нию цвета среды, разрыву агара (тест на газообразование), или
после введения специальных реактивов (тест на образование ин-
дола, реакция Вогес—Проскауэра). Каждый признак обозначают
определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести
в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о
таксономическом положении исследуемого штамма.
194
При идентификации симбиотических и паразитических (пато-
генных) бактерий важно установить специфичность симбионта к
хозяину, а также устойчивость к антимикробным веществам и фа-
гам (фаготипирование).
Определение состава клеток бактерий также имеет значение
для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические ме-
тоды могут быть важными, в частности, для тех групп бактерий, у
которых морфологические и физиологические характеристики ши-
роко варьируются и недостаточны для проведения их удовлетво-
рительной идентификации. В состав клеточных стенок разных
прокариот входит несколько классов уникальных гетерополиме-
ров: муреин (или псевдомуреин), липополисахариды, миколовые и
тейхоевые кислоты. Состав клеточной стенки определяет и серо-
логические свойства бактерий. Это лежит в основе иммунохими-
ческих методов их идентификации.
В качестве хемотаксономического маркера иногда используют
также липидный и жирнокислотный состав клеток бактерий. Ин-
тенсивное изучение жирных кислот стало возможным с развити-
ем метода газо-хроматографического анализа. Различия в Соста-
ве липидов используют для идентификации бактерий на уровне
рода и даже вида. Однако этот метод имеет определенные огра-
ничения, поскольку содержание жирных кислот в клетках может
зависеть от условий культивирования и возраста культуры.
В систематике некоторых бактерий учитывается состав хино-
нов и других переносчиков электронов, а также пигментов.
Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть
получена при изучении клеточных белков — продуктов трансля-
ции генов На основании изучения мембранных, рибосомных, сум-
марных клеточных белков, а также отдельных ферментов сфор-
мировалось новое направление — белковая таксономия. Спектры
рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и ис-
пользуются для идентификации бактерий на уровне семейства
или порядка Спектры мембранных белков могут отражать родо-
вые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характе-
ристики химических соединений клетки не могут использоваться
для идентификации бактерий изолированно от других данных, опи-
сывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости
фенотипических признаков.
Нередко при идентификации бактерий, а иногда и других
микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумери-
ческой (или адансоновской) таксономии. В ее основе лежат идеи
французского ботаника М. Адансона (М. Adanson), предложив-
шего различные фенотипические признаки, поддающиеся учету,
считать равноценными, что позволяет количественно выразить
таксономические дистанции между организмами в виде отноше-
ния числа положительных признаков к общему числу изученных.
Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется
путем количественной оценки возможно большего числа (обычно
195
не менее ста) фенотипических признаков, которые подбирают так,
чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться
знаками «минус» или «плюс». Степень сходства устанавливается
ла основании количества совпадающих признаков и выражается
в виде коэффициента сходства (S):
__ а—|—Ь
a-j-b-j-c-pi '
где а и d — суммы признаков, по которым штаммы А и В совпа-
дают (а — оба штамма с положительными признаками; d — оба
с отрицательными); b — сумма признаков, по которым штамм А
положителен, а В — отрицателен; с — сумма признаков, по ко-
торым штамм А отрицателен, а штамм В положителен. Значение
коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1
означает полную идентичность, а 0 — полное несходство. Оценки
комбинаций признаков производят с помощью компьютера. Полу-
ченные результаты представляют в виде матрицы сходства и/или
в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может приме-
няться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов
только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать
непосредственные выводы относительно генетического родства мик-
роорганизмов, однако в известной степени отражает их филогене-
тические свойства. Так, установлено, что фенотипические призна-
ки бактерий, поддающиеся изучению в настоящее время, отра-
жают от 5 до 20% свойств их генотипа.
Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в ре-
зультате успешного развития молекулярной биологии и привело к
возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основан-
ное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность
построить со временем естественную (филогенетическую) систему
микроорганизмов. Филогенетические взаимоотношения бактерий
оценивают определением содержания ГЦ в ДНК, ДНК—ДНК и
ДНК—рРНК гибридизацией, с помощью ДНК-зондов, а также
изучением последовательности нуклеотидов в 5S, 16S и 23S рРНК
(см. гл. 8).
Молекулярное содержание ГЦ от общего количества основа-
ний ДНК у прокариот, как уже указывалось, колеблется от 25 до
75%. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным средним
содержанием ГЦ. Однако поскольку генетический код вырожден,
а генетическое кодирование основано не только на содержании
нуклеотидных оснований в единицах кодирования (триплетах), но
и на их взаимном расположении, то одинаковое среднее содер-
жание ГЦ в ДНК двух видов бактерий может сопровождаться
их значительным генотипическим разделением. Если два организ-
ма очень блдзки по нуклеотидному составу ДНК, то это может
являться свидетельством их эволюционного родства только при
условии, что они обладают большим числом общих фенотипичес-
ких признаков или генетическим сходством, подтвержденным
196
другими методами. В то же время расхождение (более 10—15%)
в нуклеотидном составе ДНК двух штаммов бактерий с общими
фенотипическими свойствами показывает, что они относятся по
крайней мере к разным видам.
Метод ДНК—ДНК гибридизации является более важным для
оценки генетического родства бактерий. При тщательном прове-
дении экспериментов можно получить ценную информацию о сте-
пени их генетической гомологии. Внутри одного вида бактерий
степень генетической гомологии штаммов достигает 70—100%. Од-
нако если в результате эволюционной дивергенции последователь-
ности нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различа-
ются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК—
ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению. В
таком случае гибридизация ДНК—рРНК позволяет значительно
увеличить круг организмов, у которых можно определить степень
генетической гомологии благодаря тому, что на относительно не-
большом участке бактериального генома, кодирующем рибосом-
ные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется
значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге
методом ДНК—рРНК гибридизации часто обнаруживают доволь-
но высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация
ДНК—ДНК не выявляет заметной гомологии.
Для идентификации бактерий иногда используют также метод
ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью мето-
да молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридиза-
ции ведется в этом случае не между двумя препаратами тоталь-
ной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательно-
сти ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), от-
ветственный за какую-то определенную функцию (например, ус-
тойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бак-
терии. Самым распространенным способом создания генных зон-
дов является выделение специфических фрагментов путем моле-
кулярного клонирования. Для этого вначале создают «банк ге-
нов» изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами
рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов
ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетичес-
ких свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее вы-
бранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в
состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную
плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (напри-
мер, Escherichia coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд,
выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной
меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК
бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют мето-
дом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации ге-
нетического маркера с хромосомой той или иной бактерии дела-
ют заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуе-
мым штаммом.
197
Однако наиболее широкое распространение и значение для
идентификации бактерий и создания филогенетической системы их
классификации получил метод анализа нуклеотидных последова-
тельностей в рибосомальных РНК- Молекулы 5S, 16S и 23S
рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической
стабильности. Считают, что они находятся вне механизма дейст-
вия естественного отбора и эволюционируют только в результате
спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. Так
как накопление мутаций зависит только от времени, то информа-
ция о нуклеотидной последовательности этих молекул является
наиболее объективной для определения филогенетического родст-
ва организмов на уровне от подвида до царства. В случае анали-
за 5S рРНК обычно определяют полную последовательность нук-
леотидных последовательностей, которая в этой молекуле у прока-
риот составляет 120 нуклеотидов. При исследовании 16S и 23S
рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, час-
то проводят анализ олигонуклеотидов, полученных из этих моле-
кул с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции. Наибо-
лее широкое распространение получило изучение последователь-
ности олигонуклеотидов в 16S рРНК. Изучение структуры 16S
рРНК представителей разных бактерий привело к выявлению сре-
ди прокариот группы архебактерий. Значения коэффициента сход-
ства Зав, отделяющие 16S рРНК эубактерий и архебактерий, ле-
жат в пределах 0,1, в то время как значение Зав, равное 1,0, соот-
ветствует полной гомологии нулеотидных последовательностей, а
0,02 — уровню случайного совпадения.
Все чаще для идентификации бактерий предлагают дендро-
граммы, показывающие взаимоотношения между бактериальными
родами, видами или штаммами на основании изучения последо-
вательности нуклеотидов (или олигонуклеотидов) в рРНК, а так-
же ДНК—ДНК и ДНК—рРНК гибридизации. Однако различия
в темпе эволюции у разных групп организмов, а также трудоем-
кость и дороговизна этих методов, не дают возможность использо-
вать только филогенетический подход для систематики бактерий.
Более того, идентификация бактерий до родов на основании толь-
ко генетических методов без предварительного изучения их фено-
типических характеристик часто вообще невозможна. Поэтому
лучшим подходом в работе по систематике бактерий является изу-
чение как генотипических, так и фенотипических свойств. В слу-
чае несоответствия между филогенетическими и фенотипическими
данными приоритет временно отдают последним.
Идентификацию бактерий проводят обычно с помощью опре-
делителя Берги (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology).
Первое издание этого пособия было осуществлено в 1923 г. под
руководством известного американского бактериолога Д. Берги
(D. Н. Bergey, 1860—1937). С тех пор оно регулярно переиздается
с участием ведущих ученых-микробиологов мира. В последнем,
9-м издании Определителя Берги (1993), все бактерии разделены
198
на 35 групп по легко определяемым фенотипическим признакам.
Эти признаки вынесены в названия групп. Таксономическое поло-
жение бактерий внутри групп определяется с помощью таблиц и
ключей, составленных на основе небольшого числа фенотипичес-
ких признаков.
Более полная информация о таксономическом положении бак-
терий содержится в 4-томном Руководстве Берги по систематике
бактерий (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1984—
1989). Для каждой группы бактерий дается описание входящих в
него родов и видов, в том числе с неясным таксономическим ста-
тусом. Помимо подробного фенотипического описания, включаю-
щего морфологию, организацию и химический состав клеток, анти-
генные свойства, вид колоний, особенности жизненного цикла и
экологии, в характеристике родов приводятся также сведения о
содержании ГЦ в ДНК, результатах гибридизации ДНК—ДНК и
ДНК—рРНК- Ключи и таблицы позволяют идентифицировать
бактерии не только до рода, но и до вида.
Помимо определителя Берги имеется ряд статей и книг, в ко-
торых предлагаются оригинальные ключи для идентификации от-
дельных групп бактерий, например бацилл, псевдомонад, актино-
мицетов, энтеробактерий. Для иллюстрации приведем схему
идентификации некоторых видов бацилл (табл. 14)
Таблица 14
Ключ для определения бактерий рода 1. Каталаза 2. Реакция Вогес-Проскауэра 3. Рост в анаэробном агаре 4. Рост при 50° 5. Рост в МГ1Б с 7% NaCl 6. Кислота и газ на среде с глюкозой 7. Восстановление NO^ до NO^ 8. Параспоральиые тельца 9. Гидролиз крахмала 10. Рост при 65° 11. Гидролиз крахмала 12. Кислота и газ на среде с глюко- зой Bacillus — есть — нет —- положительная — отрицательная — есть — нет .... — есть — нет . . — - есть В. licheniformis — нет ...... В. coagulans — есть В. polymyxa — нет . — есть ........... — нет . В. alvei — есть В thuringiensis — нет ........ В. cereus — есть В. subtilis — нет ....... В. pumilus — есть .... В. stearothermophilus — нет . . — есть — нет . — есть В. macerans — иет . 2 17 3 10 4 9 5 6 7 8 11 12 15 13
1 Приводится по книге: Избранные биологии. М.. Изд-во Моск ун-та, 1985. задачи большого практикума по микро-
199
Окончание табл. 14
13. Ширина клеток 10 мкм и больше — да . . . . . В. megaterium 14
— нет
14. pH в среде для образования
ацетоина меньше 6,0 — да В circulans
— нет . . В. firmus
15. Рост в анаэробном агаре — есть . . . . . . В. laterosporus
— нет 16
16. Кислота на среде с глюкозой — есть В. brevis
— нет В. sphaericus
17. Рост при 65° — есть . . . В. stearothermophilus
— нет 18
18. Гидролиз казеина — есть . . . . . В. larvae
— нет 19
19. Параспоральные тельца
— есть В. popilliae
— нет . . . ... В. lentimorbus
Следует отметить, что для описания новых штаммов бактерий
изучают, как правило, больше признаков, чем необходимо для их
идентификации, так как ключи и таблицы включают не все приз-
наки идентифицируемых бактерий, а только те, которые отлича-
ются у разных видов (табл. 15).
Таблица 15
Минимальный перечень данных, необходимых для
описания новых штаммов бактерий (по Truper, Schleifer, 1992)
Свойства Основные признаки Дополнительные признаки
Морфология клеток форма, размер; под- вижность; внутриклеточ- ные и внеклеточные структуры; взаимное рас- положение клеток; кле- точная дифференциров- ка; тип клеточного деле- ния; ультраструктура клетки цвет; характер жгутикова- ния; споры капсулы, чехлы, выросты; жизненный цикл, гетероцисты, гормогонии; ульстраструктура жгутиков, оболочки, клеточной стенки
Характер роста особенности роста на плотных и в жидких пи- тательных средах; мор- фология колоний. цвет колоний, суспензии
Окраска по Граму на кислотоустойчивость, окраска спор, жгутиков
Состав клетки состав ДНК; запасные вещества гомология нуклеиновых кислот; клеточные пигменты; состав клеточной стенки; типичные ферменты
200
Окончание табл. 15
Свойства Основные признаки Дополнительные признаки
Физиология отношение к темпера- туре; к pH среды; тнп метаболизма (фототроф, хемотроф, литотроф, органотроф); отношение к молекулярному кисло- роду; акцепторы электро- нов; источники углеро- да; источники азота; источники серы потребность в солях или осмотических факторах; пот- ребность в факторах роста; типичные продукты метабо- лизма (кислоты, пигменты, антибиотики, токсины); ус- тойчивость к антибиотикам
Экология условия обитания патогенность, круг хозяев; образование антигенов; се- рология; восприимчивость к фагам; симбиоз
ПРИЛОЖЕНИЕ
СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ
микроорганизмов
Среды, обеспечивающие рост различных хемоорганогетеротрофных бактерий
1. Мясо-пептонный бульон.
2. 4—8 ° Б сусло.
3. Среда состава (г): пептон — 10,0; дрожжевой экстракт — 1,0; глюкоза —
1,0—4,0; вода дистиллированная — 1000 мл; pH — 6,8—7,0.
4. Крахмало-аммиачная среда (г): растворимый крахмал— 10,0;
(NH4)ZSO4 —2,0; К2НРО4—l,0;MgSO4-7HzO—1,0; NaCI—1,0; САСО3 — 3,0;
агар — 15; вода водопроводная — 1000 мл.
5. Среда Чапека (г): сахароза — 30,0 или глюкоза — 20,0; NaNO3—2,0;
К2НРО4— 1,0; MgSO4-7HzO— 0,5; КС1 — 0,5; FeSO4-7H2O — 0,1; вода дистилли-
рованная — 1000 мл.
6. Среда БСА (бульон—сусло—агар). Мясо-пептонный бульон смешивают с
равным объемом 6 °Б сусла и добавляют 2 г/л агара.
Среды стерилизуют при 1.0 или 0,5 ати в зависимости от наличия в них
витаминов или других термолабильных факторов. Сахара стерилизуют отдельно
при 1,0 ати в виде концентрированных растворов (обычно 40%) и добавляют в
среды при посеве.
Среды для сахаролитических клостридий
1. Картофельная среда с мелом (см. с. 50).
2. Среда состава (г): глюкоза — 10,0; пептон — 10,0; К2НРО4 — 1,0;
СаСОз — 3,0—5,0; вода водопроводная — 1000 мл.
Мел стерилизуют отдельно и добавляют к стерильной среде.
Среды для молочнокислых бактерий
1. 8—10 °Б сусло с дробиной. К стерильной среде добавляют в избытке сте-
рильный мел.
2. Обезжиренное молоко (обрат). Часто его разбавляют водой в отношении
2:1.
3. Среда MRS состава (г): гидролизат казеина — 10,0; мясной экстракт —
10,0; дрожжевой экстракт — 5,0; глюкоза — 20,0; ацетат натрия — 5,0; цитрат
аммония (двузамещенный) — 2,0; твин-80 — 1,0; К2НРО4 — 2,0; MgSO4-7HzC)—
0,2; MnSO4-4H2O — 0,05; вода дистиллированная — 1000 мл.
Среда для сапрофитных коринебактерий
Состав (г): гидролизат казеина — 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0: глю-
коза — 5,0; NaCI — 5,0; дистиллированная вода — 1000 мл; pH — 7,2—7,4.
202
Среды для пропионовокислых бактерий
Компоненты, г/л дистиллированной воды I II III IV
Глюкоза* 20,0 20,0 20,0
Лактат Na или Са — 10.0 — ——
Дрожжевой экстракт 4,9 10,0 —. — -
Кукурузный экстракт — — 20,0
Гидролизат казеина 10,0 10,0 —— —
(NH4)2SO4 3,0 — 3,0 3,0
КН2РО4 — 2,5 —— 1,0
MgSO4-7H2O — — — 0,2
СоС12-6Н2О 0,005 — 0,005 0,005
MnSO4-4H2O 0,005 —. —— —.
Биотин* — — — 1,0 мкг
Пантотенат Са — — — 1000 мкг
Тиамии — — — 200 мкг
pH 6,8—7,0 6,8—7,0 6,8—7,0 6,8—7,0
* Глюкозу и витамины стерилизуют отдельно и вносят в стерильную среду
перед посевом.
При использовании глюкозы жирные кислоты, образуемые пропионовокис-
лыми бактериями, необходимо ежедневно нейтрализовыв!ать стерильным раство-
ром 10%-ного NaHCO3.
Среда для сапрофитных микобактерий и нокардий
1. Овсяный агар (ISP — 3) (г): овсяная мука (или хлопья) — 20,0; агар —
3,0 г.
Среды для актииомицетов
1. Овсяный агар (ISP — 3) (г): овсяная мука (или хлопья) —20,0; агар —
20,0—25,0; вода дистиллированная — 1000 мл; следы солей — FeSO4 — 0,1;
МпС13 — 0,1; ZnSO4 — 0,1. Вместо дистиллированной воды и солей можно ис-
пользовать водопроводную воду. Для приготовления среды овсяную муку (или
хлопья) варят в 1 л воды 20 мин, фильтруют и доводят объем до 1 л. Среду
применяют для хранения и определения культуральных, а также морфологичес-
ких признаков.
2. Синтетические и полусиитетичеокие среды для актииомицетов
Компоненты, г/л водопроводной воды Красиль- никова № 1 № 6 № 71 Га узе № 1 Вакс- мана
Глюкоза 20,0 ——
Крахмал растворимый — 10,0 15,0 20,0 —
Глицерин —— — — — 3,0
Кукурузный экстракт — 10,0 10,0 — —
KNO, 1,0 —— — 1,0 —
(NH4)2SO4 — 3,0 4,0 — —
К2НРО4 0,5 — 2,0 0,5 1,0
NaNO3 — —— — — 2,0
MgSO4-7H2O 0,5 — — 0,5 0,5
КС1 — — — — 0,5
NaCl 0,5 3,0 •— 0,5 —
СаСОз 1,0 3,0 3,0 — —
FeSO4-7H2O следы — — следы 0.01
pH 7,0-7,2 7,0—7,2 6,6—7,2 7,2—7,4 7,0
203
Указанные среды используют как с агаром, так и без него. Среды с кукуруз-
ным экстрактом применяют для определения антибиотических свойств. Часто для
этой цели используют также среду Гаузе № 2 состава (г): триптон — 2,5 или
бульон Хоттиигера — 30 мл; пептон — 5,0; NaCI •— 5,0; глюкоза — 10,0; вода
водопроводная — 1000 мл; 'pH — 7,0—7,4. Среду можно использовать и с ага-
ром.
Среды для бактерий, использующих целлюлозу
1. Среда Хетчинсона и Клейтона для аэробных бактерий (г), целлюлоза —
кусочки фильтровальной бумаги; NaNO3 — 2,5; КгНРО4 — 1,0; MgSO4-7H2O —
— 0,3; NaCI — 0,1; CaCl2-4HsO — 0,1; FeCl3-6H2O — 0,01; вода дистиллирован-
ная — 1000 мл.
2. Среда Имшенецкого для (анаэробных бактерий (г): фильтровальная бума-
га — 45,0; NaNH4HPO4 — 1,5; К2НРО4 — 0,5; КН2РО4 — 0,5. MgSO4 7Н2О —
0,4; NaCI — 0,1; пептон — 5,0; MnSO4-4H2O— следы; FeSO4 — следы;
СэСОз — 2,0; вода дистиллированная — 1000 мл; pH 7,0—7,4.
Среды для уксуснокислых бактерий
1. 4—6 °Б сусло — 100 мл; этанол (ректификат) — 4—5 мл
2. Среда состава (г): глюкоза —400,0; дрожжевой экстракт — 10,0' СаСОз—
20,0; агар —15,0; вода дистиллированная — 1000 мл; pH 6,8.
3. Среда состава (г): дрожжевой экстракт — 5,0; пептон — 3,0; маинит —
25,0; агар — 15,0; вода дистиллироваииая — 1000 мл.
3- ю среду используют для культивирования бактерий рода Gluconobacter.
Среды для бактерий рода Caulobacter
1. Картофельный агар.
2. Среда Красильникова и Беляева состава (г): пептон — 1,0; дрожжевой
автолизат — 1,0 мл; MgSO4-7H5O — 0,2; агар — 15,0; вода водопроводная —
1000 мл.
Среда Хирш и Коити для метилотрофов
Состав: (NH4)2SO4 — 0,5 г; КН2РО4 — 1,36 г; Na2HPO4-7H2O — 2,13г;
MgSO^HjO — 0,2 г; СаС12-2НгО — 10,0 мг; MnSO-4H2O — 2,5 мг; FeSO4-
•7Н2О — 5,0 мг; Na2MoO4-2H2O — 2,5 мг; гидрохлорид метиламина — 6,75 мг;
агар — 18,0 г.; вода дистиллироваииая — 1000 мл; pH — 7,2. Непосредственно
в питательную среду добавляют 4 г/л метанола. В качестве источника азота
цместо (NH4)2SO4 можно использовать KNO3 или мочевину в концентрации
100 мМ.
Более простой средой является среда Мевиуса состава (г); NaNO3— 4,0;
К2НРО4 — 1,0; NaCI — 0,5; MgSO4-7H/) — 0,5; вода водопроводная — 1000 мл.
К 20 мл стерильной среды добавляют несколько капель метанола или после
посева колбы помещают в эксикатор, в который ставят открытую пробирку с
метаиолом.
Среды для азотфиксаторов
1. Среда Эшби для азотобактера и олигоиитрофилов (г): сахароза или маи-
нит — 20,0; К2НРО4 — 0,2; MgSO4-7H2O — 0,2; NaCI — 0,2; FeSO* — 0,1;
СаСОз — 5,0; вода дистиллированная — 1000 мл. В среду рекомендуется вносить
смесь микроэлементов — 1 мл/л. Раствор микроэлементов (по Федорову) (г):
НзВО, — 5,0; (NH4)2 МоО4-2Н2О — 5,0; ZnSO4-7HeO — 0,2; KI и NaBr — по
0,5; A12(SO4)318H2O — 0,3; вода дистиллированная — 1000 мл.
204
2. Среда Виноградского для анаэробных <азотфиксагоров рода Clostridium
(г): глюкоза — 20,0; К2НРО4 — 1,0; MgSO4-7H2O — 0,5; СаСОз — 20,0;
NaCl, MnSO4, FeSO4 — среды; вода дистиллированная — 1000 мл. В среду реко-
мендуется добавлять дрожжевой экстракт — 10 мг/л и раствор микроэлементов
по Федорову (см. выше) — 1 мл/л.
3. Среда Федорова в модификации Калининской для выделения азотфикса-
торов (г): глюкоза —10,0—15,0; KsHPO4 —11,74; КН2РО4—0,91; MgSO4-7H2O—
0,3; СаС12-6Н2О — 0,1; NaCl — 0,5; FeCl3-6H2O — 0,01; дрожжевой эк-
стракт — 0,015; смесь микроэлементов по Федорову — 1 мл; вода дистиллиро-
ванная — 1000 мл.
4. Бобовый агар для клубеньковых бактерий. Состав среды (г): бобовый
отвар — 1000 мл; сахароза — 2,0; КН2РО4 — 1,0; MgSO4’HsO >— 0,3; агар —
15; pH — 7,0—7,2.
Бобовый отвар готовят следующим образом: 50 г бобов (белой фасоли или
гороха) заливают 1 л водопроводной воды и варят до набухания и растрескива-
ния кожуры, но ие до полного разваривания. Отвар фильтруют через вату или
несколько слоев марли и доводят объем до 1 л.
5 Маниитно-дрожжевая среда для клубеньковых бактерий (г): маннит —
10,0; дрожжевой экстракт — 1,0; К2НРО4 — 0,5; MgSO4-7H2O — 0,2; NaCl —
0,1—0,2; РеОз-бНгО — 0,002; агар — 45,0; вода дистиллированная — 1 000 мл;
pH 6,8-7,0.
Среда Траутвейна для Thiobacillus denitrificans
Состав (г): Na2S2O3-5H2O — 2,0; NH4C1 — 0,1; Na2HPO4-2H2O — 0,1;
MgCU-OH^—0,1; KNO3—4,0; NaHCO3— 0,1; раствор микроэлементов по
Древсу — 5 мл; pH — 7,0.
Раствор микроэлементов по Древсу (Drews, 4976), мг: ЭДТА Na — 800;
МпС12-4Н2О — 10; СоС12-6Н2О — 4; CuSO4 — 1; Na2MoO4-2H2O — 3; ZnCl2 — 2,
LiCl — 0,5; SnCl2-2HzO — 0,5; H3BO3 — 1; KBr -^2; KJ — 2; BaCl2 — 0,5;
вода дистиллированная — 1000 мл; pH 6,0. На I л среды добавляют от 5 до
10 мл этого раствора.
Среда Сильверм|ана и Люндгреиа 9К для Thiobacillus ferrooxidans
) й раствор: в 700 мл дистиллированной воды растворяют (г): (NH4)2SO4 —
3,0; К2НРО4 — 0,5; КС1 — 0,4; MgSO4-7H2O — 0,5; Ca(NO3)2-4H2O—0,01.
2-й раствор: в 300 мл дистиллированной воды растворяют 44,2 г FeSO4-7H2O и
добавляют 1 мл 10 и. серной кислоты. Растворы стерилизуют отдельно и смеши-
вают перед посевом. pH среды 2,5.
Среда Казерера для во-
дородокисляющнх бак-
терий
Состав (г): NH4C1 —
1,0; К2НРО4 — 0,5;
MgSO4-7H2O — 0,2;
NaHCO3 — 0,5; раствор
микроэлементов по
Древсу — 10 мл; pH
7,0, вода дистиллиро-
ванная — 1000 мл.
После посева колбы
помещают в эксикатор,
заполненный газовой
смесью состава (%):
СО2 — 10; О2 — 5—30;
Н2 — 60—85; все газо-
вые смеси для водород-
Среды для денитрифицирующих бактерий
Компоненты, г/л дистиллированной воды Гильтея Березовой
Цитрат К или Na (трехзамещенный) 5,0 20,0
KNO3 2,0 1,0
Аспарагин 1,0 —
КН2РО4 2,0 1,0
К2НРО4 —. 1,0
MgSO4-7H2O 2,0 2,0
СаС12-6Н2О 0,2 0,2
FeCl3-6H2O следы следы
pH 6,8—7,2 6,8—7,2
205
ных бактерий взрывоопасны, поэтому при работе необходимо строго соблю-
дать правила техники безопасности!
Среды для сульфатвосстанавливающих бактерий
Компоненты, г/л дистиллированной воды Баар Постгейта В
Лактат Na 3,5 мл 3,5 мл
Дрожжевой экстракт — 1,0
NH4C1 1,0 1,о
CaSO4-H2O 1,0 1,0
КН2РО4 0,5 0,5
MgSO4-7H2O 2,0 2,0
FeSO4-7H2O* —— 0,5
(NH4)2Fe(SO4)2-6H2O (соль Мора) 0,5 —
Раствор микроэлементов по Пфеннигу (состав см.
с. 207)** — 1 мл
1%-ный раствор Na2S 5—8 мл О.з мл
в 1%-ном растворе NaHCO3**
pH 7,0—7,5 7,0—7,5
* Сернокислое железо растворяют в 1%-ной НС1, стерилизуют и добавляют
в стерильную среду перед посевом.
** Стерилизуют отдельно и добавляют в стерильную среду перед посевом.
Среды для тионовых бактерий
Компоненты, г/л дистиллированной воды Среда Вак- смана для Thiobacillus thiooxidans Среда Старки для Thiobacillus thioparus
Сера (серный цвет)* 10,0 или
Na2S2O3-5H2O** 5,0 5,0
(NH4)2SO4 0,3 0,2
КН2РО4 3,0 3,0
СаС12-6Н2О 0,25 0,25
MgSO4-7H2O 0,5 0,5
FeSO4-7H2O 0,01 0,01
Раствор микроэлемен-
тов по Древсу 10 мл 10 мл
рн 4,0—5,0 7,5—8,0
* Серу стерилизуют текучим паром или спир-
том 2 ч, затем спирт испаряют в сушильном шкафу
при 50°.
** Стерилизуют отдельно и вносят в среду пе-
ред посевом.
206
Среды для выделения
бактерий, окисляющих
железо и марганец
1. Среда Лиске
для железобактерий
(г): (NH4)2SO4 - 1,5;
К2НРО4 — 0,05; КС1 —
0,05; MgSO4-7H2O —
0,05; Ca(NO3)2-4H2O —
0,01; вода дистиллиро-
ваииая — 1000 мл, pH
7,0.
Среду после стерили-
зации оставляют стоять
2—3 дня для насыщения
кислородом и углекис-
лотой, затем добавляют
Среды Виноградского для нитрификаторов
Компоненты, г/л водопроводной воды* I фаза II фаза
нитрис эикации
(NH4)2SO4 2.0
NaNO2 — 1,о
К2НРО4 1,0 0,5
MgSO4-7H2O 0,5 0,5
NaCI 2,0 0,5
FeSO4-7H2O 0,05 0,4
CaCO3 5,0 —
Na2CO3 — 1,0
* К средам рекомендуется добавлять раствор
микроэлементов по Пфеннигу (см. с. 207) — 1 мл
на 1 л среды.
стерильную железную
проволоку или свеже-
осаждеииое сернистое
железо.
2. Среда Дубининой для Metallogemum: крахмал гидролизованный — 1 г;
нормальная лошадиная сыворотка — 1 мл; ДНК — 10 мкг; свежеосаждениый
МпСОз — избыток; вода дистиллированная — 1000 мл.
Среды для фототрофных бактерий
1. Среда для зеленых и пурпурных серобактерий (г): NH4C1 — 1,0;
NaHCOg — 2,0—5,0; КНгРО4 — 1,0; MgCh-OHzO — 0,5; СаС12-2Н2О — 0,1;
NaCI добавляют к средам для морских штаммов; Иа^-ЭНгО1 — 1,0; витамин
В}2 — 1 мкг; раствор микроэлементов (по Пфеннигу) — 1 мл; вода дистиллиро-
ванная — 1000 мл; pH 7,0—8,0.
Раствор микроэлементов по Пфеннигу (Pfennig, 1965), мг: ЭДТА — 500;
Ре8О4-7НгО - 200; ZnSO4-7HEO — 10; МпС12-4НгО — 3; Н3ВО3 — 30; СоСЬХ
Х2Н2О —20; СиС1г2НгО — 1; NiCl2-6H2O — 2; Na2MoO4-2H2O — 3; вода
дистиллированная — 1000 мл. На 1 л среды добавляют от 1 до 10 мл.
2. Среда для пурпурных несерных бактерий (г): NH4C1 .— 0,4; дрожжевой
экстракт—0,2; соединение углерода — 1,0; MgSO4-7H2O — 0,2; NaCI — 0,4;
витамин Bi2 (1 мг/100 мл)1 — 1 мл; цитрат Fe (0,ili г/100 мл)1 .— 5 мл;
СаС12’2Н2О — 0,05; КН2РО4 — 0,5; NaHCOg — 2,0; раствор микроэлементов
(по Пфеннигу)1 — 1 мл, вода дистиллированная — 1000 мл; pH 6,8—7,3.
3. Среда Кратца и Мейерса для цианобактерий (г): Ca(NO3)2-4H2O —
0,025; KNO3 — 1,0; MgSO^HzO — 0,25; КгНРО4 — 1,0; Na2CO3—1,5;
FeNH4 цитрат — 1,0; FeCl3-6H2O — 0,001; раствор микроэлементов — 1 мл;
вода дистиллироваииая — 1000 мл; pH 6,8—7,0.
Состав раствора микроэлементов (г): Н3ВО3 — 2,86; МпС12-4Н2О — 1,81;
ZnSO4-7H2O — 0,222; Na2MoO4-2H2O — 0,03; CuSO4-5H2O — 0,079; вода дис-
тиллированная — 1000 мл.
Среды для дрожжей
1. 61—8 °Б сусло.
2. Глюкозо-пептонная среда (среда Сабуро) состава (г): глюкоза — 40;
пептон — 10; агар — 20; вода водопроводная — 1000 мл.
3. Глюкозо-аммонийная среда состава (г): глюкоза — 20,0; (NH4)2SO4 — 5,0;
КН2РО4 — 0,85; К2НРО4 — 0,15; MgSO4-7H2O — 0,5; NaCI — 0,1; СаС12-4Н2О —
0,1; вода дистиллированная — 1000 мл.
1 Стерилизуют отдельно и вносят в среду перед посевом.
207
к двум последним средам для обогащения их факторами роста добавляют
иногда дрожжевой или мясной экстракты в количестве 2—5 г на 1 л среды.
Среды для мицелиальных грибов
1. 3—4 °В сусло.
2. Пептонио-декстрозный апар Ваксмана состава (г): глюкоза — 10,0; пеп-
тон — 5,0; КН2РО4 — 1,0; MgSO4-7H2O — 0,5; вода водопроводная — 1000 мл.
3. Среда Чапека—Дакса состава (г): сахароза —30,0; —3,0; К2НРО4 —1,0;
MgSO4-7H2O — 0,5; КС1 — 0,5; FeSO4-7H2O - 0,01; агар — 15,0; вода дис-
тиллированная — 1000 мл.
4. Среда Ван-Итерсоиа для грибов, использующих целлюлозу. Двойной кру-
жок фильтровальной бумаги сворачивают в виде фильтра и ставят острием вверх
з колбу Эрленмейера на 100 мл с 50 мл водопроводной воды, содержащей 0,75 г/л
КН2РО4 и 0,1 г/л MgSO4. Стерилизуют при 1,0 ати; pH до стерилизации уста-
навливают 7,0—7,4.
Среда Сегала для выделения галофилов
Жидкая среда (г/л): казаминовые кислоты — 7,5; дрожжевой автолизат —
10,0; 3-замещенный цитрат натрия — 3,0; КС1— 2,0; MgSO4-7H2O — 20,0;
FeCl3 — 0,023; NaCl — 250,0; вода дистиллированная — 1000 мл. Компоненты
среды последовательно растворяют в 800 мл воды, доводят pH до 7,5—7,8 с по-
мощью 1 М КОН, затем смесь автоклавируют при 1 ати 5 мии, среду охлаждают
и фильтруют от осадка. Доводят pH до 7,4 с помощью 1 М НС1, а объем до
1000 мл и стерилизуют автоклавированием при 0,5 аги.
Если необходима твердая среда, то к жидкой среде после первого автокла-
вирования и доведения pH добавляют 20 г/л агара, нагревают до его расплавле-
ния, а затем автоклавируют. Среду разливают в чашки Петри при 60—70°, чтобы
предотвратить преждевременное затвердение.
Среды для генетических экспериментов с Е. coli
Минимальная среда А (г/л): КаНРО4—41,0,5; КН2РО4 — 4,5; (NH4)2SO4 — 0,5;
После автоклавирования добавляют 1 мл 1 М раствора MgSO4-7H2O и 10 мл
20%-иого раствора глюкозы. Аминокислоты добавляют до конечной концентрации
40 мкг/мл (в случае D, L-формы) и 20 мкг/мл (в случае L-формы). Витамины
добавляют до конечной концентрации 1 мкг/мл.
Богатая среда LB (г/л): триптон — 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0;
NaCl — 5,0.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ДОПУСТИМЫЕ СРОКИ ПЕРИОДИЧЕСКИХ
ПОСЕВОВ НЕКОТОРЫХ ГЕТЕРОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Микроорганизмы Питательная среда Темпе- ратура хране- ния, °C Число пересевов в год
1 2 3 4
Acetobacter aceti A. xylinum 6° Б сусло-|-6 % этанола 18—20* 12
Azotobacter agile A. chroococcum A. vinelandii агаризованная среда Эшби 18—20* 6
Средняя комнатная температура.
208
Продолжение табл.
1 2 3 4
Bacillus cereus В. mesenterlcus В. polymyxa В. subtilis картофельный arap 18—20* 4
Caulobacter sp. агаризованиая среда с дрожжевым автолизатом 4—6 2—3
Citrobacter freundii Escherichia coli МПА МПА МПБ+0,2% агара 18—20 18—20 18—20 6 12 6—8
Lactobacillus acidophilus L. casei снятое молоко 18—20 18—20
Lactobacillus delbrueckii L. pentoaceticum Leuconostoc mesenteroides 8—10 °Б сусло+ 4-дробииа+мел 8—10 °Б сусло+ 4-дробииа4-мел 18—20 18—20 18—20 18—20
Micrococcus luteus M. lysodeikticus МПА 18—20 6
Mycobacterium flavum M. mucosutn M. phlei M. smegtnatis Nocardia sp. МПА4-3 °Б сусло (1:1) та же 18—20 4—6 18—20 3—4 2—3 3—4
Pseudomonas aeruginosa P. fluorescens P. putida МПА 18—20 6—8
Propionibacterium shermanii среды с кукуруз- ным экстрактом или лактатом 4—6 4-5
Proteus vulgaris P. mirabilis МПА 18—20 9
Staphylococcus aureus МПА 18—20 6
209
Окончание табл.
1 2 3 4
Streptotnyces griseus S. spheroides S. violaceus агаризованиая среда Чапека овсяный агар та же 18—20 4
Saccliaromyces cerevisiac 4—5 ° Б сусло— агар 18—20 4—5
Candida guilliermondii C, utilus та же 18—20 6
Rkodotorula glutinis R. rubra » 18—20 6
Schizosaccharoinyces pombe 18—20 4—5
Endomyces magnusii 18—20 4—5
Saccharomycodes ludwigii * Средняя комнатная темпе эатура 18—20 4—5
РЕЦЕПТЫ КРАСИТЕЛЕЙ, ИНДИКАТОРОВ И РАСТВОРОВ
Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор
Фуксин основной—ГО г; этанол — 96°-иый—100 мл.
Фуксин основной карболовый (фуксии Циля)
5%-иый водный раствор свежеприготовленного фенола — 100 мл; насыщен-
ный спиртовой раствор фуксина основного —110 мл. Приготовленную смесь через
48 ч отфильтровывают. Краситель отличается устойчивостью.
Фуксии основной, водный раствор
Карболовый фуксин Циля — 1 мл; вода дистиллированная — 9 мл. Водный
фуксин готовят непосредственно перед употреблением, так как он нестоек.
Метиленовый синий, насыщенный раствор
Метиленовый синий — 3 г.; 90-иый этанол — 100 мл. Раствор оставляют
на 2—3 дия, несколько раз перемешивают (взбалтывают), затем фильтруют.
Раствор устойчив.
Метиленовый синий 1:40
Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего — 1 мл; вода дистил-
лированная >— 40 мл.
Метиленовый синий (по Леффлеру)
Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего — 30 мл; вода дистил-
лированная — 100 мл; КОН, 1%-ный водный раствор — 1 мл.
Генциановый фиолетовый карболовый
Раствор 1. Генциановый фиолетовый — 1 г; этанол 96°-ный—10 мл.
Раствор 2. 5%-ный водный раствор свежеприготовленного фенола .— 100 мл.
После полного растворения геицианового фиолетового растворы смешивают.
Кристаллический фиолетовый, водный раствор
Кристаллический фиолетовый — 20 мг; вода дистиллированная — 100 мл.
210
Эритрозин карболовый
Эритрозин — Зг; вода дистиллированная — 100мл; фенол свежеперегиан-
ный — 5 г. После растворения эритрозина и фенола смеси дают отстояться.
Сафранин, водный раствор
2,5%-иый раствор сафранина в 96°-иом этаноле — 1,0мл; вода дистиллиро-
ванная — 100 мл.
Реактивы для окраски жгутиков
Протрава. 12 г таннина растворяют при нагревании в 48 мл дистиллирован-
ной воды, к раствору прибавляют 30 мл насыщенного водного раствора железного
купороса (FeSO<) и 6 мл насыщенного спиртового раствора фуксина. Раствор
отфильтровывают и сохраняют в банке с притертой пробкой. Протрава бывает
готовой к употреблению через несколько дней после приготовления и может хра-
ниться в течение нескольких месяцев.
Краситель. Карболовый фуксин Циля и вода дистиллированная в соотноше-
нии 1:1.
Протраву и карболовый фуксии Циля готовят заранее. Разбавленный фук-
сии следует готовить незадолго до употребления. Непосредственно перед работой
протраву и разбавленный фуксии необходимо отфильтровать через складчатый
бумажный фильтр, так как осадки красок, легко образующиеся на стенке при
наличии даже небольших количеств белка, будут сильно мешать окрашиванию в
рассмотрению объекта.
Реактивы для окраски жгутиков по методу Фонтана
Протрава: таииин — 5 г; фенол кристаллический — 1 г; вода дистиллиро-
ванная — 100 мл.
Реактивы для серебрения: серебро азотнокислое — 5 г; вода дистиллиро-
ванная — 100> мл.
Раствор серебра следует готовить без фильтрования и хранить в темной
склянке. К 3—4 мл 5°/о-иого раствора азотнокислого серебра по каплям прибав-
ляют раствор аммиака до помутнения и образования осадка, а затем осторож-
но — до растворения осадка. После этого вновь прибавляют раствор серебра до
появления легкой опалесценции. Полученный раствор аммиачного серебра разво-
дят дистиллированной водой в ГО раз.
Анилиновый черный
Анилиновый черный — 1,5 г; этанол 96°-иый — 50 мл; уксусная кислота
80%-иая — 10 мл; вода дистиллированная <— 40 мл. После растворения краску
фильтруют и через 3 дня она готова к употреблению.
Красители для выявления липидов
1. Судан III — 0,5 г; молочная кислота коицеитрированиая — 100 мл.
2. Судан черный В — 0,3 г; этиловый спирт 70°-ный горячий — 100 мл.
Раствор выдерживают в течение иеокольких часов при 60° в закупоренной
склянке, затем охлаждают и фильтруют.
Малахитовый зеленый, водный раствор
Малахитовый зеленый — 7,5 г; вода дистиллированная — 100 мл.
Раствор Люголя в модификации Грама
Иод кристаллический — 1 г; калий йодистый — 2 г; вода дистиллирован-
ная — 300 мл.
В ступку емкостью 30—50 мл помещают навеску йода и йодистового калия,
растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды и, продол-
жая растирать кристаллы, добавляют еще 5 мл воды- Иод растворяется в йодис-
211
том калии. Раствор количественно переносят в склянку и доводят общий объем
До 300 мл. Срок годности раствора не более 30 дней;хранят его в темной посуде,
Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы
Йод кристаллический — 1 г; калий йодистый — 3 г; вода дистиллированная —
300 мл. Раствор готовят так же, как предыдущий.
Приготовление тушн для негативного контрастирования
Тушь черная — 10 мл; вода дистиллированная — 30 мл.
Разведенную тушь центрифугируют, надосадочный слой разливают в
пробирки и стерилизуют при 0,5 ати. Сохранить тушь можно также добавляя к
ней раствор тимерсола (1:1 000) в соотношении 1:2 и твин-80 (1:100) — 1 капля
на 100мл раствора.
Бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца
Нарезают полоски фильтровальной бумаги, погружают их на 5—10 мин в
5%-иый водный раствор уксуснокислого свинца, высушивают на воздухе и стери-
лизуют в чашке Петри автоклавированием при 0,5 ати.
Реактив Фолина для определения белка по Лоури
В колбу объемом 1500 мл вносят 700 мл дистиллированной воды, 100 г воль-
фрамовокислого натрия (Na2WO4-2HzO), 25 г молибденовокислого натрия
(НагМоО4-2Н2О), 50 мл 85%-ной Н3РО4 и 100 мл конц. НС1. Полученную смесь
кипятят на слабом огне в течение 10ч с обратным водяным холодильником. К
охлажденной смеси добавляют 150 г сернокислого лития, (Li2SO4), 50 мл дистил-
лированной воды и 15 капель брома. Избыток брома удаляют кипячением в тече-
ние 15 мин без холодильника. Раствор охлаждают. Он должен быть желтым.
Если раствор зеленый, добавляют еще несколько капель брома и вновь выпари-
вают избыток последнего. Объем раствора доводят до 1000мл и хранят в холо-
дильнике в темной склянке с притертой пробкой. Основной раствор обычно бы-
вает 2н. Белок определяют с помощью 1н. раствора Фолина. Для этого титро-
ванием 0,1н. NaOH с фенолфталеином определяют концентрацию основного раст-
вора и разбавляют его дистиллированной водой до 1и.
Реактив Эрлиха
77ара-диметиламинобензальдегид — 1 г; 96°-ный этанол — 95 мл. НС1
концентрированная — 20 мл.
Реактив Эрлиха в модификации Ковача
/7ара-диметиламинобензальдегид — 1 г; амиловый или изоамиловый спирт —
15 мл; НС1 концентрированная — 10 мл.
Реактив Несслера
KI—70 г; Hgl2—100 г; КОН — 100 г.
Раствор 1. Навески KI н Hgl2 растворяют в 400 мл дистиллированной воды.
Раствор 2. Навеску КОН растворяют в 500 мл дистиллированной воды.
Растворы 1 и 2 смешивают и доводят общин объем до 1 л. В случае образования
осадка верхний прозрачный слой декантируют. Раствор хранят в темной стек-
лянной посуде. В продаже имеется готовый реактив Несслера.
212
Реактив Грисса
Раствор 1. 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 30 мл ледяной ук-
сусной кислоты. Добавляют 100» мл дистиллированной воды и фильтруют. Раст-
вор сульфаниловой кислоты устойчив в течение месяца.
Раствор 2. 0,1 г а-нафтнламина растворяют в 100 мл кипящей дистиллиро-
ванной воды. Охлаждают и добавляют 30 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор
а-нафтиламина фильтруют н хранят не более недели. Непосредственно перед ис-
пользованием смешивают равные объемы этих растворов.
Реактивы для крахмало-йодной пробы на нитриты
1. Крахмал — 0,4 г; ZnCl2— 2,0 г; Н2О — 100 мл.
ZnCl2 растворяют в 10 мл воды, кипятят и добавляют крахмал. Доводят
объем до 100 мл и оставляют стоять неделю. Затем раствор фильтруют и добав-
ляют равный объем 0,2%-ного раствора KI.
2. Раствор соляной кислоты: концентрированная НС1 — 10 мл; вода — 84 мл.
Фиксирующие жидкости
1. 96°-ный этиловый спирт; время фиксации — 10—15 мин.
2. Метиловый спирт, безводный; время фиксации — 3—5 мин.
3. Смесь Никифорова; этиловый спирт и серный эфир в равных объемах,
время фиксации — 5—10 мин.
4. Спнртформол — 40%-ный формалин — 5 мл; 96°-ный этиловый спирт —
95 мл; время фиксации — 5—,15 мин.
5. 1—2%-ный водный раствор осмиевой кислоты; фиксация в парах 3—5 мин.
Раствор осмиевой кислоты хранят в темном флаконе с притертой пробкой. При
работе соблюдать осторожность, так как пары осмия могут повредить глаза.
6. 40%-ный формалин, фиксация в парах — несколько секунд.
7. Фиксатор Карнуа: 96°-ный спирт — 60 мл„ хлороформ — 30 мл, ледяная
уксусная кислоты — 10 мл; время фиксации — 15 мин.
8. Жидкость Руге: 40%-ный формалин — 20 мл, ледяная уксусная кислота —
1 мл, вода дистиллироваииая — 1000 мл; время фиксации — 5 мии. Рекоменду-
ется для фиксации клеток, выращенных в жидких средах неопределенного сос-
тава.
9. Фосфорномолибденовая кислота, 5%-ный водный раствор; время фикса-
ции — 5 мин.
Чернила по стеклу
Раствор 1. 1 г фуксина основного растирают в ступке с 15 мл этилового
спирта.
Раствор 2. К 2 г таннина добавляют 15 мл воды н нагревают до кипения.
Растворы 1 и 2 смешивают в равных объемах.
Перегонка фенола
Фенол перегоняют из колбы Вюрца, закрытой корковой пробкой. Колбу
помещают непосредственно на сетку. В качестве приемника используют заранее
взвешенную сухую фарфоровую чашку. В нее отгоняют некоторое количество
фенола, и когда он застывает, определяют его массу, исходя из которой готовят
соответствующий объем раствора или необходимого реактива. Перегонку фенола
осуществляют в вытяжном шкафу. При работе с фенолом следует соблюдать
большую осторожность, так как он вызывает сильные ожоги.
213
Важнейшие кислотно-основные индикаторы (по Лурье, 1967)
Индикатор Концент- рация, % Растворитель Интер- вал пе- рехода pH Окраска индикатора
1 2 3 4 5
Метиловый фиолетовый (метилвиолет, 1-й переход) 0,1 и 0,05 вода 0,1—0,5 желтая — зеленая
Метиловый зеленый 0,05 вода 0,1—2,0 желтая — зелено- голубая
Метиловый фиолетовый (2-й переход) 0,1 вода 1,0—1,5 зеленая — синяя
льКрезоловый пурпурный (1-й переход) 0,04 20°-ный раствор 1,2—2,8 красная — желтая
Тимоловый синий (тимолблау, 1-й переход) 0,1 а) 20°-ный спирт б) вода с добавле- нием 4,3 мл 0,05 и. NaOH на 100 мг индика- тора 1,2—2,8 красная — желтая
Метиловый фиолетовый (3-й переход) 0,1 вода 2,0-3,0 синяя — фиолетовая
Метиловый оранжевый (метилоранж, оранж. III, геллантин) 0,1 вода 3,1—4,4 красная — оранжево- желтая
Бромфеноловый синий (бромфенолблау) 0,1 а) 20°-ный спирт, б) вода с добавле- нием 3 мл 0,05 и. NaOH на 100 мг индикатора 3,0—4,5 желтая1— синяя
Конго-красный (конгорот) 0,1 и 1,0 вода 3,0—5,2 сине-фио- летовая — красная
Бромкре.озоловый синий (бромкреозолгрюн, бромкреозолблау, бромкреозоловый зеленый) 0,1 а) 20°-ный спирт, б) вода с добавле- нием 2,9 мл 0,05 и. NaOH на 100 мг индика- тора 3,8—5.4 желтая — синяя
Метиловый красный (метилрот) 0,1 и 0,02 60с-иый спирт 4,2—6,4 красная — желтая
Бромфеноловый красный (бромфенолрот, дибромфенолсульфоф- талеин) 0,1 и 0,04 а) 20°-ный спирт б) вода с добавле- нием 3,9 мл 0,05 и. NaOH на 100 мг индика- тора 5,0—6,8 желтая — красная
214
Окончание табл.
1 2 3 4 5
Бромкрезоловый пурпур- ный (бромкрезолпурпур, дибром-о-крезол-суль- фофталеин) 0,1 а) 20°-ный спирт б) вода с добавле- лением 3,7 мл 0,05 н. NaOH на 100 мг инди- катора 5,2—6,8 желтая — пурпурная
Бромтимоловый синий (бромтимолблау, днбромтимолсуль- фофталенн) 0,05 0,1 а) 20°-ный спирт б) вода с добавле- нием 3,2 мл 0,05 н. NaOH на 100 мг инди- катора 6,0—7,6 желтая — синяя
Нейтральный красный (иейтральрот) 0,1 б0°-ный спирт 6,8—8,4 красная — янтарно- желтая
Феноловый красный (фенолрот; фенолсуль- фофталеин) 0,1 и 0,05 а) 20°-ный спирт б) вода с добавле- нием 5,7 мл 0,05 н. NaOH на 100 мг инди- катора 6,8—8,4 желтая — красная
Крезоловый красный (крезолрот; о-крезол- сульфофталенн) 0,1 а) 50°-иый спирт б) вода с добавле- нием 5,3 мл 0,05 и. NaOH на 100 мг инди- катора 7,2—8,8 янтарно- желтый пурпурно- красная
м-Крезоловый пурпур- ный (2-й переход) 0,04 20°-ный спирт 7,4—9,0 желтая — пурпурная
Тимоловый синий (2-й переход) 0,1 а) 20с-ный спирт б) вода с добавле- нием 4,3 мл 0,05 н. NaOH на 100 мг инди- катора 8,0—9,6 желтая1— синяя
Фенолфталеин 0,1 и 1/) 60°-ный спирт 8,2—10,0 бесцвет- ная — пурпурная
Тимолфталеин 0,1 н 0,04 90°-ный спирт 9,3—1,0,5 бесцвет- ная — синяя
Оранжевый ж 0,1 вода 11,5—14,0 желтая — красная
Примечание. Вода дистиллироваииая.
215
Буферные растворы для приготовления и разведения суспензий
микроорганизмов. Схема приготовления буферных растворов
Буферный раствор Компонент А Компонент Б
Фосфатный 0,1 М Na2HPO4-2HaO 17,8 г/л 0,1 М NaH2PO4-2H»O 15,6 г/л
Трис-НС1 0,1 М НС1 8,5 мл 36%-ной НС1+ 991,5 мл Н2О 0,1 М трнс (оксиметнламинометан) 12,1 г/л
pH Количество компонента А, мл
фосфатный буфер трнс-HCl буфер
6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 61,5 92,5 132,5 187,5 245,0 305,0 360,0 405,0 435,р 457,5 473,5 221,0 207,0 192,0 162,5 134,0
Количество компонента Б, мл 500—А 500
Довести до объема дистиллированной водой 1 л 1 л
Физические свойства некоторых буферных растворов
Нанменованне pKa(20cC) ApKa/°C Молярная масса Молярность насыщен- ного ра- створа при 0 °C
MES 6,15 —0,011 195,23 0,65
ADA 6,60 —0,011 212,15 —
BIS—TRIS PROPANE 6,80 —0,016 282,35 2,30
PIPES 6,80 —0,009 342,26 1,40
ACES 6,90 —0,020 182,20 0,22
MOPS 7,20 —0*006 209,26 3,00
TES 7,50 —0,200 229,25 2,60
HEPES 7,55 —0,014 238,31 2,30
HEPPS 8.00 —0,007 252,33 2,50
TRICINE 8,15 —0,021 179,18 0,80
TRIS 8,30 —0,310 121,13 2,40
BICINE 8,35 —0,018 163,17 1,10
Г лицил-глнциновый 8,40 —0,028 132,13 1,10
CHES 9,50 —0,009 207,30 0,85
CAPS 10,40 —0,009 221,32 0,85
216
Физиологический раствор
Готовят 0,85%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде. При необходи-
мости стерилизуют 30 мин при |1 атн.
Подготовка предметных и покровных стекол для приготовления препаратов
Предметные и покровные стекла считаются чистыми, когда капля воды рас-
текается по нх поверхности. Новые стекла обычно кипятят в 1 % -ном растворе
соды, промывают дистиллированной водой, слабым раствором соляной кислоты и
затем опять дистиллированной водой. Стекла, бывшие в употреблении, кипятят в
мыльной воде и затем не менее суток выдерживают в растворе хромовой смеси.
От бихромата стекла отмывают дистиллированной водой Чистые стекла хранят
в 96°-ном этаноле.
Обработка предметных стекол по Цеттнову
1. Стекла кипятят 10 мин в следующем растворе: бихромата калия — 20 г;
дистиллированной воды — 200 мл; концентрированной серной кислоты — 20 мл.
2. Промывают в течение 5 мин, слабым раствором едкого натра.
3. Тщательно промывают водой.
4. Промывают спиртом.
При отсутствии заранее приготовленных обезжиренных стекол можно быстро^
подготовить стекла, натирая их в сухом виде хозяйственным мылом и очищая
затем чистой хлопчатобумажной тканью.
Средства для мытья посуды
Хромовые смеси. 1. В концентрированную серную кислоту добавляют около
5% (от объема серной кислоты) размельченного в порошок кристаллического
двухромовокислого калия (КаСггО?) и осторожно нагревают в фарфоровой чашке
на водяной бане до его растворения.
2. Двухромовокислый калий растворяют в воде, затем в раствор осторожно-
добавляют серную кислоту. Смесь тотовят из расчета: вода —- 100 мл; двухро-
мово-кислый калий — 6 г; серная кислота (плотность 1,84) — 100 мл.
После многократного употребления темно-оранжевый цвет хромовой смеси
меняется на темно-зеленый. Такая смесь не обладает моющнмн свойствами.
Хромовой смесью не следует мыть посуду, загрязненную парафином, керосином,
минеральными маслами и другими продуктами перегонки нефти.
Хромовая смесь сильно разрушает ткани животного и растительного проис-
хождения, поэтому работать с ней следует осторожно. Если она попала на руки
или одежду, то пораженное место немедленно обмывают большим количеством
воды, затем разбавленным раствором аммиака или соды, а затем снова водой.
Спиртовой раствор КОН — также хорошее моющее средство. Его готовят
растворением -40—50 г КОН в 500 мл воды. После остывания раствора к нему
добавляют спирт-сырец в таком количестве, чтобы общий объем составил 1 л.
ЛИТЕРАТУРА
Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.: Мир, 1987.'
Б а б ь е в а И. П., А г р е Н. С. Практическое руководство по биологии
почв. М.: Изд-во Моск, ун-та, 197'1.
Б а б ь е в а И. П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации
дрожжей. М.: Пищевая пром-ть, 1979.
Блохина И. Н., Леванова Г. Ф., Антонов А. С. Систематика
бактерий (с основами геносистематики), Н. Новгород, 1992.
Водоросли. Справочник/ Вассер С. П., Кондратьева Н. В;, Маслюк Н; Б.'
Киев, 1989. л „
Глазер В. М., Зинченко В. В., Каменева С. В; Большой практи-
кум по генетике микроорганизмов. М.: Изд-во Моск, ун-та, 11985.
Громов Б. В. Строение бактерий. Л., 1985.
Громов Б. В., Павленко Г. В. Экология бактерий: Л:, 1989:
Г у с е в М. В., М и и е е в а Л. А. Микробиология: М:: Изд-во Моск: ун-та,
1992.
Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Изд-во Моск, ун-та,
1994.
Зубжицкий Ю. Н. Метод люминесцентной микроскопии. Л.: Медицина,
1964.
Каталог культур микроорганизмов. Институт биохимии и физиологии мик-
роорганизмов РАН, Всероссийская коллекция микроорганизмов. Пущино-иа-Оке:
Наука, 1992.
КожевинП. А. Микробные популяции в природе. М.: Изд-во Моск; ун-та,
1984.
Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980.
Кузнецов С. И., Дубинина Г. А. Методы изучения водных микроор-
ганизмов. М.: Наука, 1989.
Курс низших растений/Под ред: М. В. Горленко. М.: Высшая школа,, 1981:
Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.
М а з и н А. В. Методы современной генетики и генной инженерии. Новоси-
бирск, 1990.
Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: Изд-во
Моск, ун-та, 1980. '
Международный кодекс ботанической номенклатуры/Под ред. Ф.А. Стафле
и др. Л.: Наука, 1980.
Международный кодекс номенклатуры бактерий. М.: Мир, 1980.
Методы общей микробиологии/Под ред. Ф. Герхардта.’ М.: Мир 1983
Т. 1—3.
Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д. Г. Звягинцева
М.: Изд-во Моск, ун-та, 1991.
Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.
Практикум по микробиологии /Под ред. Н. С. Егорова. М.: Изд-во Моск.
Ун-та, 1976.
Промышленная микробиология/ Под ред. Н. С. Егорова. М.: Высшая школа,
1989.
Световая микроскопия в биологии. Методы/Под ред. А. Лейси: М.: Мир,
1982.
Семенов С. М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.:
Агропромиздат, 1990.
СтейниерР., ЭдельбергЭ., Ингрэм Дж. Мир микробов: М.:
Мир, 1979. Т. 1—3.
Стент Г., КэлиндарР. Молекулярная генетика. М.: Мир, 1976.
218
Теппер Е. 3., Шильникова В. К., Переверзева К. И.- Практи-
кум по микробиологии: М.: Колос, 1994.
Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975.
Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1986.
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed/Eds J. G. Holt et al.
Baltimore, 1993.
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1—4. 8 th ed. Baltimore,
1984, 1986, 1989.
S t a n i e r R. Y., I n g r a h a m J. L., W h a e 1 i s M; L;, P a i n t e r P: R:
The Microbial World. 5 ed. Prentice — Hall, Englewood Cliffs, 1986.
The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology,
Isolation, Identification, Application. 2 nd Ed/ Eds A. Balows et al. Berlin:
Heidelberg; New York: Springer—Verlag, 1992. Vol. 1—4.
The Yeasts. A taxonomic Study. Amsterdam, 1984.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Из предисловия к первому изданию.................................... 3
Из предисловия к третьему изданию .................................. 3
Глава 1. Общая характеристика микроорганизмов....................... 5
1.(1. Прокариоты .................................... 6
1.2К Эукариоты ..................................... 13
1.3. Влияние физических и химических факторов на рост
микроорганизмов ................................... 18
il.4. Обмен веществ ................................ 19
,1.5. Микроорганизмы в природе и биотехнологии...... 20
Глава 2. Микробиологическая лаборатория и правила работы в ней...... 22
2.1. Подготовка микробиологической лаборатории к рабо-
те ............................................. 23
2.2. Правила работы е культурами микроорганизмов ... 24
Глава 3. Методы стерилизации ...................... 29
3.1. Стерилизация питательных сред.............. 29
3.2. Стерилизация стеклянной посуды ............. 37
3.3. Стерилизация инструментов и приборов .......... 38
Глава 4. Культивирование н хранение микроорганизмов ............. 43
4.1. Принципы составления сред для культивирования
микроорганизмов ................................ 43
4.2. Условия культивирования микроорганизмов ....... 56
4.3., Хранение микроорганизмов ................... 65
Глава 5. Выделение чистых культур микроорганизмов ............... 71
5.1. Получение накопительной культуры............... 71
5.2. Выделение чистой культуры ..................... 73
5.3. Определение чистоты выделенной культуры ....... 69
Глава 6. Морфология и цитология микроорганизмов ................. 81
6.1. Микроскопия .................................. 81
6j2. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.. 97
6.3. Приготовление препаратов для люминесцентной мик-
роскопии ............................................ 112
6.4. Методы приготовления препаратов микроорганизмов
для электронной микроскопии ....................... 114
Глава 7. Количественный учет микроорганизмов ..................... 117
7.1. Определение количества клеток ................ 117
7.2. Определение биомассы взвешиванием ............ 129
7 3. Определение количества клеток и биомассы нефело-
метрическим методом ................................ 130
Глава 8. Определение состава клеток микроорганизмов .............. 133
8 4. Методы разрушения клеток ................... 133
8 2. Определение белка ............................ 133
8.3. Анализ нуклеиновых кислот .................... 142
8.4. Определение полн-р-оксимасляной кислоты (ПБОМК) 147
220
8.5. Выделение и анализ полисахаридов ............. 147
8.6. Изучение состава клеточных стенок микроорганизмов. 148
Глава 9. Культуральные и физиолого-биохимические свойства микро-
организмов ....................................................... 151
9.1. Культуральные свойства........................ 151
9.2. Физиолого-биохимические свойства ............. 155
Глава 10. Генетика микроорганизмов .............................. 172
10.1. Основные понятия ............................ 173
10.2. Мутагенез ................................... 173
10.3. Отбор мутантов .............................. 179
10.4. Перенос генетической информации у бактерий.... 182
Глава И. Систематика и идентификация микроорганизмов ........... 189
11.1. Основные понятия и правила наименования...... 189
11.2. Описание н идентификация .................... 193
Приложение
Среды для культивирования различных микроорганизмов ...............202
Условия хранения и допустимые сроки периодических пересевов неко-
торых гетеротрофных микроорганизмов ...........................208
Рецепты красителей, индикаторов и растворов................... 210
Литература ....................................................... 218
Учебное издание
РУКОВОДСТВО к ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО
МИКРОБИОЛОГИИ
Зав. редакцией И. И. Щехура
Редактор Г. М. Полехова
Художественный редактор Л. В. Мухина
Переплет художника Л. Е. Безрученкова
Технический редактор И. И. Смирнова
Корректоры И. В. Бабаева, В. В. Конкина
ИБ № 8168
ЛР № 040414 от 27.03.92
Сдано в набор 28.06.95. Подписано в печать 10.11.95.
Гарнитура литературная. Бумага офс, кн.-журн.
Усл. печ. л. 14. Уч.-нзд. л. 15,71. Тираж 1000.
Формат 60X90'/ie
Печать высокая.
Заказ 1356.
Ордена «Знак Почета» издательство Московского университета.
103009, Москва, ул. Б. Никитская, 5/7.
Серпуховская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома
проезд Мишина, д. 2/7

Источник

libcats.org

Главная →

Руководство к практическим занятиям по микробиологии

В «Руководстве к практическим занятиям по микробиологии» сохранена общая структура предыдущего издания (1-е изд. вышло в 1971 г,, второе — в 1983). Существенно переработаны главы об общей характеристике микроорганизмов, их морфологии; включены новые главы о генетике, химическом составе клеток, систематике и идентификации микроорганизмов; с учетом последних достижений в области микробиологаи пересмотрены и другие разделы учебного пособия, В книге приведены обобщенные .данные отличительных признаков эукариотических и прокариотических организмов, типы энергетического и конструктивного метаболизма.

Популярные книги за неделю:

Только что пользователи скачали эти книги:

Источник