Инструкция 1135 73 статус на 2021 год

Утверждаю

Заместитель Министра

здравоохранения СССР,

Главный государственный

санитарный врач СССР

П.Н.БУРГАСОВ

20 декабря 1973 г. N 1135-73

ИНСТРУКЦИЯ

О ПОРЯДКЕ РАССЛЕДОВАНИЯ, УЧЕТА И ПРОВЕДЕНИЯ

ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В УЧРЕЖДЕНИЯХ

САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ

ПРИ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ <*>

———————————

<*> С изданием настоящей Инструкции утрачивает силу «Инструкция о порядке расследования и учета пищевых отравлений с методикой бактериологических исследований при пищевых отравлениях», утвержденная Главным государственным санитарным инспектором СССР 25 июля 1961 г. N 373-61.

I. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ

Общие положения

1. С целью установления причины и принятия необходимых мер по ликвидации пищевых отравлений, а также разработки мероприятий по их профилактике подлежит обязательному расследованию и учету органами и учреждениями санитарно-эпидемиологической службы каждый случай возникшего пищевого отравления.

2. Врач или средний медицинский работник, оказавший медицинскую помощь пострадавшим и установивший или заподозривший пищевое отравление, обязан:

а) немедленно известить о пищевом отравлении по телефону, телеграфу или с нарочным местную санитарно-эпидемиологическую станцию;

б) изъять из употребления остатки подозреваемой пищи и немедленно запретить дальнейшую реализацию этих продуктов;

в) изъять образцы подозреваемой пищи, собрать рвотные массы (промывные воды), кал и мочу заболевших, при наличии показаний — взять кровь для посева на гемокультуру (в случае оказания помощи врачом) и направить их на исследование в лабораторию санитарно-эпидемиологической станции.

Примечание. В лечебных учреждениях, в первую очередь на станциях скорой помощи, а также в больницах, поликлиниках, здравпунктах и т.д. должен иметься необходимый запас стеклянной стерильной посуды. В случае отсутствия стерильной посуды используется чисто вымытая стеклянная посуда, которую перед заполнением следует прокипятить.

3. Пищевые отравления, происшедшие в полосе отвода железнодорожного транспорта (или на предприятиях, принадлежащих этому ведомству), а также в предприятиях системы гражданской авиации, расследуются и учитываются санитарно-эпидемиологическими станциями указанных ведомств.

В случае, когда продукт, вызвавший отравление, изготовлен на предприятиях, не принадлежащих железнодорожному транспорту или гражданской авиации, территориальная санитарно-эпидемиологическая станция должна принять участие в расследовании пищевого отравления и в организации необходимых оперативных мер по ликвидации заболеваний.

Санитарно-эпидемиологическое расследование

4. Расследование пищевых отравлений производится немедленно по получении извещения.

Расследование должен производить санитарный врач по гигиене питания или главный врач санитарно-эпидемиологической станции, а также по поручению главного врача другие специалисты санэпидстанции.

Примечание. Расследование единичных случаев заболеваний в быту с диагнозом «пищевое отравление», «пищевая токсикоинфекция», «пищевая интоксикация», поставленным лечащим врачом лишь по клиническим симптомам (не связанным с подозрением на ботулизм или с летальным исходом), проводится врачами-эпидемиологами наравне со случаями инфекционных кишечных заболеваний. В случае надобности, выявившейся в процессе эпидемиологического обследования, к расследованию единичных случаев привлекается санитарный врач по гигиене питания. Если при этом диагноз пищевого отравления подтверждается, случай подлежит учету как пищевое отравление.

5. Санитарный врач при расследовании пищевого отравления обязан:

а) установить связь с медицинским работником и учреждением, оказавшим первую помощь заболевшим, и выяснить количество пострадавших, время и обстоятельства возникновения вспышки, клинические симптомы заболевания, а также какие материалы собраны и направлены в лабораторию для исследования и какие меры приняты по предупреждению дальнейших заболеваний.

При получении перечисленных сведений от медицинских работников в поликлинике, здравпункте, станции скорой помощи санитарный врач может также ознакомиться с историями болезни с записями в регистрационном журнале;

б) опросить (в поликлинике, здравпункте, больнице, по месту работы или на дому у пострадавшего) лично больных (при массовом отравлении выборочно) с целью выявления общего для всех пострадавших продукта, а также для выявления общих клинических симптомов у заболевших.

При опросе больных санитарный врач должен выяснить:

— чем питались пострадавшие в течение 2-х суток до начала заболевания;

— имеются ли аналогичные заболевания среди членов семьи пострадавших, чем и где они питались;

— время, прошедшее с момента употребления подозреваемого продукта до появления признаков заболевания.

Путем сопоставления полученных по схемам опроса данных устанавливаются продукты, общие для пострадавших, общая клиническая картина заболевания и инкубационный период заболевания (см. схемы опроса — Приложения N 1, 2 и 3);

в) обследовать пищевой объект, с которым связано пищевое отравление, изъять остатки подозреваемого пищевого продукта, запретить его реализацию.

При обследовании пищевого объекта санитарный врач должен проверить меню и раскладки к ним (как правило, за 2 — 3 дня, предшествующих заболеванию), а также документы, по которым продукты поступили со склада в кухню, сопоставляя полученные данные с результатами личного опроса больных и выявленными при опросе сведениями о продуктах, общих для всех пострадавших.

Если подозреваемый пищевой продукт поступил с базы или другого пищевого предприятия в данном населенном пункте, санитарный врач, по мере необходимости, обследует все объекты, задерживает отпуск продукта, направляет образцы в лабораторию санэпидстанции.

В случае, когда продукт, послуживший причиной отравления, изготовлен и поступил из другого населенного пункта, района, города, санитарный врач немедленно сообщает о заболевании соответствующей санитарно-эпидемиологической станции для организации на месте необходимых мероприятий, с сообщением в дальнейшем о принятых решениях и мерах санэпидстанции по месту возникших заболеваний;

г) установить связь с лабораторией и определить совместно с работниками лаборатории (микробиологами, химиками) объем и направление необходимых исследований;

д) привлечь в необходимых случаях к участию в расследовании и ликвидации отравлений квалифицированных отраслевых специалистов-эпидемиологов, микробиологов, химиков, санитарных врачей других отраслей гигиены, сотрудников санитарно-гигиенических институтов и кафедр, клиницистов, токсикологов, работников ветеринарной службы и др. При наличии на предприятии ведомственного санитарного врача последний привлекается к расследованию;

е) в процессе расследования санитарный врач должен:

— тщательно проанализировать с участием лечащих врачей всю клиническую картину заболевания, с учетом первичных симптомов, дальнейшего течения и исхода. При этом санитарный врач использует материалы учреждений, оказывавших первую медицинскую помощь, а также материалы больниц, в которые госпитализированы пострадавшие. При анализе необходимо исключить заболевания иной этиологии, напоминающие по отдельным признакам пищевое отравление (катар или язва желудка, воспаление желчного пузыря, почечные и печеночные колики, обострение хронического энтерколита и другие). Анализируя имеющиеся данные по клиническим симптомам заболевания, санитарный врач пользуется Приложением N 4, в котором приводятся ориентировочные данные о связи клинических симптомов с отдельными видами возбудителей;

— проверить, правильно ли отобраны медицинским работником, оказавшим первую медицинскую помощь пострадавшим, необходимые материалы для лабораторных исследований, и направить, если это еще не сделано, на исследование в лабораторию подозреваемые продукты, кал, рвотные массы, промывные воды, мочу заболевших, смывы с оборудования, инвентаря (при подозрении на бактериальную этиологию отравления); организовать, при показаниях, через медицинское учреждение, оказывающее первую помощь, взятие и отсылку в лабораторию крови заболевших для посева на гемокультуру и серологическое исследование.

6. Отбор проб, подлежащих лабораторному исследованию, санитарный врач может производить с привлечением работников лаборатории (микробиологов, химиков) или сам, в зависимости от конкретных условий.

Собранные материалы должны быть направлены нарочным в наиболее квалифицированную санитарно-бактериологическую лабораторию. (Порядок отбора и направления проб в лабораторию см. Приложение N 7.)

7. Направляя для исследования в лабораторию пробы пищевых продуктов, санитарный врач должен исходить из конкретных материалов расследования. Например, при подозрении на бактериальное происхождение вспышки нецелесообразно направлять пробы на химическое исследование (определение пестицидов, мышьяка и др.), а также не следует направлять в этом случае продукты, неблагоприятные по своей природе для развития микробов (соль, сахар, крупа и т.п.).

При подозрении на отравление пестицидами и др. химическими веществами не следует направлять пробы пищевых продуктов и выделения больных для бактериологического исследования.

8. При подозрении на бактериальную этиологию пищевого отравления в лаборатории санитарно-эпидемиологической станции, а также в лабораториях больниц, по месту госпитализации пострадавших производятся необходимые бактериологические и серологические исследования (см. методику бактериологических исследований).

В число исследований входят:

— посев крови пострадавших на гемокультуру (в остром периоде заболевания);

— при подозрении на ботулизм исследуется взятая до введения лечебной противоботулинической сыворотки кровь пострадавших на наличие токсина и определяется его тип путем постановки реакции нейтрализации с диагностическими противоботулиническими сыворотками;

— серологические реакции (по подозрении на сальмонеллез и другие пищевые токсикоинфекции) с сывороткой крови заболевших производятся дважды (в динамике): на 1 — 3 и далее на 7 — 10 день заболевания или на 7 — 10 и далее на 15 — 18 день. При большом количестве пострадавших серологическому исследованию подвергается кровь наиболее тяжело заболевших, при этом рекомендуется взятие крови у не менее 10 — 15 человек, а при небольшом количестве больных по возможности кровь всех переболевших.

9. В лаборатории санитарно-эпидемиологической станции производятся бактериологические исследования промывных вод, рвотных и каловых масс пострадавших при отравлении, остатков пищи и проб пищевых продуктов, изъятых и направленных в лабораторию в процессе расследования пищевого отравления.

При подозрении на ботулизм, связанный с употреблением баночных консервов, в лаборатории подвергаются исследованию, в первую очередь, остатки и бомбажные консервы.

10. Если при расследовании возникает подозрение о связи пищевого отравления с употреблением продуктов, содержащих химические вещества, в лабораториях санитарно-эпидемиологических станций производятся санитарно-химические исследования остатков пищи, проб пищевых продуктов, выделений больных и промывных вод.

Определение химических веществ (ядохимикаты, соли тяжелых металлов, мышьяк, нитриты и др.) производится по методикам, указанным в специальных стандартах, а также утвержденным Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Министерства здравоохранения СССР.

При отсутствии утвержденных используются принятые в практике методики, указанные в специальных руководствах по лабораторным исследованиям.

При оценке результатов химических исследований необходимо учитывать:

а) естественное содержание минеральных элементов (мышьяк, медь, цинк и др.) в пищевых продуктах;

б) предельно допустимые остаточные количества пестицидов в пищевых продуктах;

в) допустимые примеси в пищевых продуктах (см. Приложение N 5).

11. Лабораторные исследования при расследовании пищевых отравлений рекомендуется проводить в наиболее квалифицированных и оборудованных лабораториях городских, областных, краевых и республиканских санитарно-эпидемиологических станций.

Следует привлекать для проведения исследований соответствующие по профилю научно-исследовательские институты, а также специальные лаборатории (например, при необходимости определения алкалоидов исследования целесообразно поручить лаборатории судебно-медицинской экспертизы).

12. В случае летальных исходов принимаются во внимание результаты патологоанатомического вскрытия и производится лабораторное исследование (бактериологическое, химическое) трупного материала: паренхиматозных органов, содержимого желудка и кишечника, крови из сердца.

13. Для выяснения путей инфицирования или загрязнения химическими веществами пищевого продукта, послужившего причиной отравления, санитарный врач должен проверить санитарные условия производства подозреваемых пищевых продуктов (в столовой, промышленном и др. пищевом предприятии), условия перевозки, сроки и условия хранения сырья полуфабрикатов и готовой продукции, наличие клейма на мясе, заключения ветеринарного надзора, сертификата на партию продукта, сроки и условия обработки ядохимикатами сельскохозяйственных культур.

Примечание. Если подозреваемым продуктом являются консервы, в акте расследования должна быть указана маркировка консервов, имеющаяся на крышке, донышке жестяной банки или на этикетке стеклянной тары с внешней и оборотной стороны, а также название завода и его местонахождение.

14. Санитарный врач должен ознакомиться с результатами обследований персонала на бактерионосительство, с данными осмотра на наличие гнойчиковых заболеваний, с заболеваниями среди персонала кишечными инфекциями (ознакомление с больничными листами, с табельным учетом выхода на работу). В случае необходимости имеющиеся на объекте данные проверяются и дополняются сведениями по учету бактерионосителей и заболевших, имеющимися в санитарно-эпидемиологической станции.

15. В процессе расследования санитарный врач принимает в соответствии с действующим положением о государственном санитарном надзоре необходимые оперативные меры:

а) запрещает использование или в необходимых случаях устанавливает порядок реализации пищевых продуктов, послуживших причиной отравления;

б) немедленно отстраняет от работы или дает указания о переводе на работу, не связанную с переработкой, хранением и транспортировкой пищевых продуктов, лиц, которые могли быть источником инфицирования пищевых продуктов;

в) предлагает и контролирует проведение необходимых санитарных мероприятий: временное или постоянное запрещение эксплуатации, дезинфекция, ремонт пищевого предприятия, с которым связано расследуемое пищевое отравление;

г) лиц, виновных в производстве, выпуске или реализации продукта, вызвавшего пищевое отравление, привлекает к административной ответственности или передает материалы расследования прокуратуре для привлечения к уголовной ответственности.

Примечание. Перечисленные оперативные меры санитарный врач по гигиене питания осуществляет путем подготовки соответствующих постановлений и других материалов для оформления главным врачом санитарно-эпидемиологической станции и вручения их по назначению.

16. По окончании санитарно-эпидемиологического расследования санитарный врач составляет акт, в котором излагается собранный материал расследования (см. Приложение N 6).

На основании полученных при расследовании данных и результатов лабораторных исследований санитарный врач подготавливает заключение о характере и причине заболевания. Рекомендуется предварительное обсуждение материалов с работниками лаборатории и другими специалистами, участвовавшими в расследовании.

Извещение и представление материалов расследования

17. Санитарно-эпидемиологическая станция по получении извещения о пищевом отравлении обязана немедленно донести о нем в вышестоящий орган или учреждение санитарно-эпидемиологической службы.

Районная, городская (городов областного, краевого подчинения) портовая, линейная на водном транспорте санитарно-эпидемиологическая станция по получении сообщения о пищевом отравлении обязана немедленно сообщить по телеграфу или телефону в установленном порядке в вышестоящий орган или учреждение санитарно-эпидемиологической службы о каждом случае пищевого отравления, связанном с пищевым продуктом, изготовленным и выпущенным государственным и кооперативным предприятием пищевой промышленности, общественного питания, торговли, детским учреждением и др. объектами организованного питания, а также о каждом случае группового (семейного) пищевого отравления в быту с числом пострадавших 5 человек и более и о каждом случае единичного отравления в быту (1 чел. и более) при подозрении на ботулизм, отравление химическим веществом или с летальным исходом.

Извещение об остальных случаях пищевых отравлений в быту с числом пострадавших менее 5-ти (с легким течением) в вышестоящую инстанцию не направляется.

Городские (городов республиканского подчинения), областные, краевые, республиканские (АССР) бассейновые санитарно-эпидемиологические станции, получив извещение, сообщают о возникновении пищевого отравления Главному государственному санитарному врачу союзной республики и оказывают необходимую помощь санэпидстанции по месту заболеваний.

Главный государственный санитарный врач союзной республики тем же путем (по телефону или телеграммой) сообщает Главному государственному санитарному врачу СССР сведения о пищевом отравлении (не позднее 24 часов с момента получения извещения).

18. Материалы окончательного расследования пищевого отравления (акт, результаты лабораторных исследований, заключение или донесение, составленное на основании этих материалов, районной, городской, портовой линейной на водном транспорте санитарно-эпидемиологической станцией) направляются в установленном порядке в вышестоящую инстанцию санитарно-эпидемиологической службы не позднее 30 дней со дня возникновения пищевого отравления.

Примечание. Материалы расследования пищевых отравлений в домашнем быту с числом пострадавших менее 5-ти и легким течением (за исключением случаев ботулизма и отравлений химическим веществом, или с летальным исходом) в вышестоящую инстанцию не направляются.

Вышестоящая инстанция санитарно-эпидемиологической службы должна немедленно ознакомиться с донесением и в случае необходимости срочно сообщить санитарно-эпидемиологической станции, направившей материал, свои замечания и требования о дополнительных сведениях, которые должны быть немедленно представлены.

19. Республиканские, краевые, областные, городские (городов республиканского подчинения) бассейновые санитарно-эпидемиологические станции по получении всех материалов о пищевом отравлении должны не более чем в 3-дневный срок направить их в установленном порядке главному санитарному врачу союзной республики.

Главные государственные санитарные врачи союзных республик представляют в Главное санитарно-эпидемиологическое управление Министерства здравоохранения СССР в установленном порядке заключительное донесение, с приведением данных расследования и окончательного заключения в 3-дневный срок со дня получения.

20. Если при расследовании пищевое отравление не подтвердилось, об этом немедленно сообщается в вышестоящие инстанции санитарно-эпидемиологической службы.

Регистрация и учет

21. Каждый случай пищевого отравления, подтвержденный расследованием, подлежит строгому учету.

22. Регистрация производится в специальных журналах, прошнурованных, пронумерованных и скрепленных печатью, хранящихся в санитарно-эпидемиологических станциях.

23. Регистрация в журнале производится на основании экстренных извещений, актов расследования и дополнительных материалов к ним (протоколы лабораторных исследований, заключения и др.).

24. Районные, городские (городов без районного деления) портовые, линейные на водном транспорте санитарно-эпидемиологические станции в журнал регистрации вносят все случаи пищевых отравлений, подтвержденные расследованием, в том числе и бытовые с числом пострадавших менее 5-ти и легким течением.

Отчетность

25. Санитарно-эпидемиологические станции (районные, городские, портовые, линейные на водном транспорте, областные, краевые, республиканские (АССР)), главные санитарно-эпидемиологические управления (СЭУ) союзных республик составляют годовой отчет об имевших пищевых отравлениях и проведенной работе по их профилактике и включают его в соответствующий раздел отчета по форме 36. Цифровые данные должны включать в себя и случаи пищевых отравлений в домашнем быту с числом пострадавших менее 5-ти и легким течением.

26. В пояснительной записке к отчету по ф. 36 дается анализ пищевых отравлений за отчетный год, характеризующий имевшие место случаи, а также принятые при этом меры и санкции (результаты дел, переданных в прокуратуру, и др.).

27. В анализе отражаются причины отравлений и их связь с отдельными видами продуктов. Случаи отравлений, связанные с предприятиями и учреждениями и возникшие в домашних условиях, анализируются раздельно.

28. На основании представленных органами санитарно-эпидемиологической службы союзных республик донесений и материалов расследования пищевых отравлений Главное санитарно-эпидемиологическое управление Министерства здравоохранения СССР составляет анализ пищевых отравлений по СССР за отчетный год.

Приложение N 1

СХЕМА ОПРОСА ПОСТРАДАВШЕГО ПРИ ПИЩЕВОМ ОТРАВЛЕНИИ

1. Фамилия, имя, отчество.

2. Возраст.

3. Место работы.

4. Где питался пострадавший в течение последних двух суток.

5. Имеются ли заболевания среди членов семьи, где они питались.

6. Дата, время начала заболевания.

7. Какой продукт, блюдо подозревается (опрос по схеме Приложения N 2).

8. Клинические симптомы (опрос по схеме Приложения N 3).

9. Место, время приема в пищу подозреваемого продукта.

10. Длительность периода от приема в пищу подозреваемого продукта до начала заболевания (инкубация).

Приложение N 2

СХЕМА ОПРОСА

ДЛЯ ВЫЯСНЕНИЯ ОБЩЕГО ПРОДУКТА

ПРИ ГРУППОВОМ ПИЩЕВОМ ОТРАВЛЕНИИ

┌───┬─────────────┬──────────────────────────────────────────────┐

│ N │Фамилия, и.о.│ Наименование продуктов и дата употребления │

│п/п│ ├──────────────────────────────┬─────────┬─────┤

│ │ │ продукт │ │ │

│ │ ├───────┬───────┬───────┬──────┼────┬────┤ │

│ │ │котлета│рыба в │творог │блин- │дата│дата│ │

│ │ │мясная │марина-│со сме-│чики с│ │ │ │

│ │ │ │де │таной │мясом │ │ │ │

│ │ ├───────┼───────┼───────┼──────┤ │ │ │

│ │ │ дата │ дата │ дата │ дата │ │ │ │

├───┼─────────────┼───────┼───────┼───────┼──────┼────┼────┼─────┤

│1. │ │ + │ + │ │ │ │ │ │

│2. │ │ — │ + │ + │ │ │ │ │

│3. │ │ — │ + │ │ │ │ │ │

│4. │ │ + │ + │ │ │ │ │ │

│5. │ │ + │ + │ │ │ │ │ │

│6. │ │ — │ + │ + │ + │ │ │ │

│7. │ │ — │ + │ │ │ │ │ │

│8. │ │ + │ + │ │ │ │ │ │

│9. │ │ — │ + │ │ + │ │ │ │

│10.│ │ + │ + │ │ │ │ │ │

└───┴─────────────┴───────┴───────┴───────┴──────┴────┴────┴─────┘

Примечание. Результаты опроса отмечаются знаком плюс (+) или минус (-).

Приложение N 3

СХЕМА АНАЛИЗА СИМПТОМОВ ЗАБОЛЕВАНИЯ

┌─┬─────┬─────┬────────────────────────────────────────────────────────────────

│N│Фами-│Дата,│ Основные симптомы

│ │лия, │час ├────┬────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬─────┬────┬──────┬────┬

│п│имя, │нача-│тош-│рво-│по-│за-│бо-│боли│тем-│оз-│го- │общая│го- │рас- │опу-│

│/│от- │ла │нота│та │нос│пор│ли │под │пе- │ноб│лов-│сла- │ло- │строй-│ще- │

│п│чест-│забо-│ │ │ │ │в │ло- │ра- │ │ная │бость│во- │ство │ние │

│ │во │лева-│ │ │ │ │об-│жеч-│тура│ │боль│ │кру-│зрения│век │

│ │боль-│ния, │ │ │ │ │ла-│кой │тела│ │ │ │же- │(двое-│ │

│ │ного │дата │ │ │ │ │сти│ │ │ │ │ │ние │ние и │ │

│ │ │гос- │ │ │ │ │жи-│ │ │ │ │ │ │др.) │ │

│ │ │пита-│ │ │ │ │во-│ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │лиза-│ │ │ │ │та │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ции │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├─┼─────┼─────┼────┼────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼─────┼────┼──────┼────┼

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│

────┬─────┬─────┬───┬───┬────┬─────┬────┬────┬─────┬─────┬───┬──────────────┤

рас-│су- │за- │из-│су-│циа-│сер- │мы- │боли│грип-│кровь│ │ Тяжесть │

ши- │хость│труд-│ме-│до-│ноз │деч- │шеч-│в │поз- │в ис-│ │ заболевания │

ре- │во │нение│не-│ро-│ │ная │ные │сус-│ные │праж-│ ├────┬─────┬───┤

ние │рту │гло- │ние│ги │ │сла- │боли│та- │явле-│нени-│ │лег-│сред-│тя-│

зра-│ │тания│го-│ │ │бость│ │вах │ния │ях │ │кое │нее │же-│

чка │ │ │ло-│ │ │ │ │ │ │ │ │те- │ │лое│

│ │ │са │ │ │ │ │ │ │ │ │че- │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ние │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

────┼─────┼─────┼───┼───┼────┼─────┼────┼────┼─────┼─────┼───┼────┼─────┼───┤

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

Примечание. Выявленные симптомы отмечаются знаком плюс (+) или минус (-), температура тела отмечается в градусах C.

Приложение N 4

НЕКОТОРЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ СИМПТОМЫ

ПРИ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ

┌───────────┬─────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│Клинические│ Возбудители │

│ симптомы ├─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬────────┬──────┬─────┤

│ │саль-│ши- │энте-│бак- │пато-│ B. │коагу-│энтеро- │боту- │Cl. │

│ │мо- │геллы│ропа-│терии│ген- │cereus│лазо- │кокки │лини- │per- │

│ │неллы│ │то- │рода │ные │ │поло- │(Sir. │ческая│frin-│

│ │ │ │ген- │Pro- │гало-│ │жи- │faecalls│палоч-│ges │

│ │ │ │ные │teas │филы │ │тель- │var. li-│ка │ │

│ │ │ │серо-│ │ │ │ные │quefac- │ │ │

│ │ │ │типы │ │ │ │стафи-│lens │ │ │

│ │ │ │бак- │ │ │ │локок-│var. zy-│ │ │

│ │ │ │терий│ │ │ │ки │mogenes │ │ │

│ │ │ │груп-│ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │пы │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │кише-│ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │чной │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │па- │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │лочки│ │ │ │ │ │ │ │

├───────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼────────┼──────┼─────┤

│1. Инкуба- │6 — │от 3 │4 — │4 — │6 — │4 — 16│4 — 18│8 — 24 │от 2 │8 — │

│ционный пе-│24 │до 5 │10 │20 │24 │час. │час. │час. │час. │23 │

│риод │ │дней │час. │час. │часа │ │ │ │до │час. │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │нес- │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │коль- │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ких │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │суток │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│2. Темпера-│высо-│высо-│высо-│высо-│высо-│норма,│норма,│норма │норма,│норма│

│тура │кая │кая │кая │кая │кая │редко │редко │ │редко │ │

│ │повы-│повы-│повы-│повы-│повы-│суб- │суб- │ │суб- │ │

│ │шен. │шен. │шен. │шен. │шен. │фебр. │фебр. │ │фебр. │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│3. Озноб │++ │+ │+/- │-/+ │-/+ │- │+/- │- │- │- │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│4. Тошнота │+ │+ │+/- │+ │+ │+ │++ │+/- │+/- │-/+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│5. Рвота │+ │++ │+/- │+ │+ │-/+ │+++ │- │+/- │-/+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│6. Боли в │+/- │+/- │+/- │+/- │++ │++ │+/- │+/- │-/+ │+ │

│эпигаст- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ральной об-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ласти │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│7. Боли в │+++ │+++ │++ │++ │++ │++ │-/+ │++ │- │+++ │

│области жи-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│вота │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│8. Жидкий │+++ │+++ │+++ │+++ │+++ │++ │-/+ │++ │- │++ │

│стул │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│9. Стул с │-+ │+++ │-/+ │-/+ │-/+ │+/- │- │- │- │- │

│кровью │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│10. Стул со│-+ │+++ │+ │-/+ │-/+ │- │- │- │- │+/- │

│слизью │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│11. Запор │- │- │- │- │- │- │- │- │++ │- │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│12. Метео- │- │- │- │- │- │- │- │- │+/- │++ │

│ризм │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│13. Общая │+++ │++ │++ │+ │+ │+/- │+ │+/- │+++ │+/- │

│слабость, │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│головокру- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│жение │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│14. Голов- │+++ │+++ │+/- │-/+ │-/+ │- │+ │+/- │-/+ │-/+ │

│ная боль │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│15. Рас- │- │- │- │- │- │- │- │- │+++ │- │

│стройство │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│зрения, ди-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│плопия, │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│птоз, мид- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│риаз и др. │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│16. Рас- │- │- │- │- │- │- │- │- │+++ │- │

│стройство │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│речи, гло- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│тания │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│17. Сухость│- │- │- │- │- │- │- │- │+++ │- │

│во рту │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│18. Потеря │-/+ │+/- │-/+ │+/- │- │-/+ │-/+ │- │- │- │

│сознания │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│19. Судоро-│-/+ │+/- │-/+ │- │- │- │-/+ │- │- │- │

│ги │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│20. Упадок │-/+ │-/+ │-/+ │-/+ │-/+ │-/+ │-/+ │- │++ │-/+ │

│сердечной │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│деятельнос-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ти │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│21. Рас- │- │- │- │- │- │- │- │- │+++ │- │

│стройство │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│дыхания │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

└───────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴────────┴──────┴─────┘

Условные знаки:

«+++» — симптомы выражены резко;

«++» — симптомы выражены сильно;

«+» — симптомы выражены умеренно;

«+/-» — симптомы наблюдаются редко;

«-/+» — симптомы наблюдаются очень редко;

«-» — симптомы не наблюдаются.

Приложение N 5

ДОПУСТИМЫЕ ПРИМЕСИ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

┌────────────┬──────────────────────────────────────────┬────────┐

│Наименование│ Продукт, в котором допущена примесь │Содержа-│

│ примеси │ │ние (мг/│

│ │ │кг не │

│ │ │более) │

├────────────┼──────────────────────────────────────────┼────────┤

│Медь │Томат-пюре 40% │120 │

│ │Консервы: печень тресковых рыб, рыбные │ │

│ │паштеты, сардины в томате │15 │

│ │Халва, драже, ирис, карамель │12 │

│ │Джем, повидло, варенье, пастила, мармелад │10 │

│ │Сливки сухие, консервы мясные, гуляш, поч-│ │

│ │ки в томате, солянка из капусты с мясом │8 │

│ │Молоко сгущенное (консервы) │5 │

│ │ │ │

│Олово │Молоко, сливки сгущенные, соки в жестяных │ │

│ │банках │100 │

│ │Все другие консервы в жестяных банках │200 │

│ │ │ │

│Никель │Маргарин │Следы │

│ │ │ │

│Свинец │В пищевых продуктах не допускается │ │

│ │ │ │

│Мышьяк │В пищевых продуктах не допускается <*> │ │

│ │В пищевых кислотах и ароматических эссен- │ │

│ │циях │1,4 │

└────────────┴──────────────────────────────────────────┴────────┘

———————————

<*> Естественное содержание мышьяка: в мясе домашнего скота и в растительных продуктах — в пределах 1 мг/кг;

в мышечной ткани пресноводных рыб до 2 мг/кг;

в мышечной ткани морской рыбы и в продуктах моря 2 мг/кг и более.

Приложение N 6

УКАЗАНИЯ

К СОСТАВЛЕНИЮ АКТА РАССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВОГО ОТРАВЛЕНИЯ

1. Необходимо указать место работы, фамилию и должность санитарного врача, составляющего акт, дату его составления, кто участвовал в расследовании пищевого отравления.

2. Подробно описать начало заболевания, его дату, число поступивших больных на протяжении первых 3 — 4 часов и затем в последующие часы и дни; указать, не было ли аналогичных заболеваний в предшествовавшие дни, клиническую картину (по схеме опроса, Приложение N 4), тяжесть заболевания и предварительный диагноз, общее число употреблявших в пищу подозреваемый продукт и число пострадавших с приложением поименного списка заболевших, госпитализированных, умерших с указанием возраста, а также обстоятельства, связанные с возникновением пищевого отравления.

Указать в акте, какие материалы получены от заболевших (промывные воды, рвотные, каловые массы, кровь и др.), от кого и куда направлены для лабораторного исследования.

При наличии случаев с летальным исходом указать, какой материал взят при вскрытии трупов (внутренние органы, содержимое желудка и др.) и куда направлен для исследования.

3. Указать место потребления пищи или приобретения пищевого продукта; описать подробно раскладки к блюдам и меню пострадавших за последние 48 часов до отравления. Следует привести в акте также меню не пострадавших, но питавшихся одновременно в том же буфете, столовой и т.д.

Указать, через сколько времени после приема подозреваемой пищи появились симптомы заболевания. По результатам опроса (Приложение N 3) и проверки меню и др. документов указать, какой пищевой продукт подозревается как причина отравления.

Отразить оценку заболевшими органолептических свойств пищевого продукта, явившегося причиной заболевания: запах, вкус, температура блюда и т.п., а также количество (приблизительный вес) съеденного продукта.

4. Указать, когда и откуда получен подозреваемый продукт или сырье для изготовления этого продукта, наличие сертификатов, ветеринарного удостоверения, дать санитарную характеристику продукта в момент расследования.

5. Дать краткое описание санитарного состояния пищевого предприятия, изготовившего продукт, подозреваемый как причина пищевого отравления. Подробно описать технологический процесс, санитарные условия изготовления подозреваемого продукта, а также условия его хранения, реализации. Описать условия транспортировки, хранения сырья.

Примечание. Подробный акт санитарного обследования пищевого объекта, на котором произошло отравление или на котором изготовлен подозреваемый пищевой продукт, следует приложить к акту расследования пищевого отравления.

6. Указать, какие продукты задержаны, изъяты или уничтожены, когда, куда и какие продукты и другие материалы направлялись для лабораторного исследования.

7. Изложить результаты химического, бактериологического, серологического, биологического и патологоанатомического исследования всех материалов.

8. Дать обоснованные выводы, подтверждающие, что в указанном случае действительно имеется пищевое отравление. В выводах указать, какой пищевой продукт явился причиной, какой установлен возбудитель бактериальных отравлений или какое обнаружено вредное химическое вещество, какие нарушения в технологии, хранении или реализации продукта обусловили возникновение пищевого отравления.

Если причина пищевого отравления не установлена, то указать, какой продукт, оказавшийся общим для всех пострадавших, подозревается.

9. Описать меры, принятые органами государственного санитарного надзора, по ликвидации и профилактике подобных заболеваний, а также указать санкции, примененные в данном случае.

Приложение N 7

ОТБОР, НАПРАВЛЕНИЕ И ПОДГОТОВКА ПРОБ

ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. На исследование направляются те материалы, которые, по предварительным данным санитарно-эпидемиологического расследования, связаны с предполагаемой этиологией отравления.

2. Объектами исследования могут быть:

а) остатки подозреваемой пищи, употребленной заболевшими, а также исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовались при ее приготовлении;

б) суточные пробы готовой пищи (если установлен порядок обязательного их хранения) в детских учреждениях и др. при обязательном условии их хранения на холоде;

в) рвотные массы, промывные воды, испражнения и моча пострадавших;

г) кровь для получения гемокультур и для постановки серологических реакций.

При подозрении на ботулизм кровь берут до введения лечебной противоботулинической сыворотки;

д) слизь из зева и носа, выделения гнойчиковых поражений кожи персонала, занятого приготовлением готовой пищи;

е) смывы и соскобы с инвентаря, оборудования, тары, рук персонала;

ж) вода питьевая из графинов, питьевых бачков, резервуаров и других точек;

з) содержимое желудка, отрезок тонкого кишечника, паренхиматозные органы (печень, селезенка), кровь из сердца, костный мозг, мезентериальные лимфатические узлы, желчь — при летальных исходах заболевания.

3. Отбор проб для бактериологического исследования следует производить в стерильные широкогорлые банки с притертыми пробками емкостью 200 — 300 мл или закрываемые пергаментной бумагой и обвязанные бечевкой либо резиновыми обхватками.

Отбор проб продуктов плотной консистенции или сыпучих можно выполнять путем затаривания в несколько слоев стерильной пергаментной бумаги. Листы бумаги стерилизуются вместе со стеклянной посудой в сухожаровых шкафах, для чего их складывают в виде конвертов и завертывают по несколько штук в общий пакет.

При отсутствии стерильной посуды отбор проб допускается в любые стаканы, металлические или стеклянные банки, предварительно подвергнутые кипячению в течение 45 минут. Обработка посуды дезинфицирующими средствами не допускается. Остатки консервов направляются на исследование непосредственно в той банке, из которой они использовались в пищу. При отсутствии остатков консервов исследованию подлежит содержимое нескольких невскрытых банок с маркировкой, полностью идентичной маркировке вскрытой банки. Если в партии консервов одноименной маркировки имеются бомбажные банки, их отбирают и исследуют в первую очередь. Маркировочные знаки, поставленные на донышке и крышке банок, регистрируют в лабораторном журнале с тем, чтобы впоследствии использовать при оформлении протоколов исследования.

4. Пищевые продукты для исследования изымают в количествах, указанных в «Правилах выемки проб пищевых продуктов, напитков и вкусовых веществ», утвержденных Главным государственным санитарным инспектором СССР 2 сентября 1949 года. В тех случаях, когда это невыполнимо, отбор проб производят в количествах менее установленных.

Мясо берут для анализа в количестве 500 г, при этом пробу отбирают из различных мест туши с обязательным взятием мезентериальных лимфатических узлов, а также участков трубчатой кости. Если возможно, то следует от животных отбирать кровь из сердца, содержимое кишечника, желчь и стенки желчного пузыря. Для исследования могут быть использованы также смывы с поверхности туши. Птицу берут целой тушкой или ее остатки, включая анальное отверстие. Мелкую рыбу отбирают в количестве 2 — 3 штук, от крупной рыбы — 2 — 3 куска, в том числе из спинки, ближе к голове и из участков вблизи анального отверстия.

Солонину и соленые продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. В отдельную посуду набирают 100 — 200 мл рассола.

Пробы жидких и полужидких объектов (супы, соусы, кремы, молочные продукты) отбирают после тщательного перемешивания в количестве около 200 г.

Молочные продукты заводского изготовления отбирают в оригинальной упаковке.

Для вторых блюд норма выемки 1 — 2 порции.

Суточные пробы направляют для исследования непосредственно в той посуде, в которой они хранились в холодильнике.

Остатки фактически употребленной пищи берут для анализа непосредственно в той посуде, в которой они были обнаружены. Допускается их доставка также в стерильных банках, куда остатки пищи должны быть перемещены с соблюдением правил асептики.

5. Пробы испражнений отбирают из последней, более жидкой порции, поступающей из верхних отделов кишечника. Наиболее полноценным материалом исследования являются испражнения, собранные непосредственно после дефекации в количестве 5 — 10 г.

При наличии в испражнениях слизи, гноя или крови их необходимо включать в отбираемый материал.

Отбирать пробы необходимо стерильными деревянными шпателями или стеклянными палочками, вмонтированными в ватные пробки пробирок, из судна, горшка, специального лотка или пеленки.

Испражнения можно забирать и непосредственно из прямой кишки с помощью ректальной трубки.

При отсутствии возможности немедленного посева собранные порции испражнений или ректальные трубки с материалом помещают в пробирки с консервирующим раствором. В качестве консерванта лучше всего применять глицериновую смесь (pH 7,2 — 7,4). Соотношение испражнений и консерванта должно быть 1:5.

6. Рвотные массы отбирают в количестве 50 — 100 мл, но могут быть взяты и в меньшем количестве; промывные воды — в количестве 100 — 200 мл, причем они должны быть взяты от каждого пострадавшего отдельно до применения каких-либо лекарственных средств. Нежелательно собирать промывные воды желудка от нескольких больных в одну посуду. Консервирующие вещества добавлять нельзя.

7. Кровь у заболевших забирают из локтевой вены в стерильную сухую пробирку в количестве не менее 8 — 10 мл. Допускается брать кровь с 4% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 1:3, но цитратную кровь при постановке биологической пробы можно вводить мышам только внутрибрюшинно.

8. Пробу мочи на исследование берут в количестве 20 — 30 мл в стерильную посуду (банки, флаконы) с соблюдением необходимых условий, исключающих внесение посторонней флоры.

9. Желчь и содержимое 12-перстной кишки берут на исследование при помощи дуоденального зонда. Зондирование производят в лечебном учреждении или на бактерионосительском пункте санитарно-эпидемиологической станции. Возможность применения этого метода исследования в каждом конкретном случае решается клиницистом строго индивидуально.

10. Пунктат воспалительных очагов (гной, эксудат) собирают в стерильные пробирки.

11. Для проведения анализа спинномозговой жидкости последняя должна быть взята в стерильную пробирку в количестве 5 — 10 мл.

12. При контроле поверхностей инвентаря, оборудования, различной утвари и рук их тщательно протирают ватным тампоном на стеклянной или деревянной палочке или небольшими марлевыми салфеточками (5 x 5 см). Для увлажнения тампона используют стерильный физиологический раствор или водопроводную воду в количестве 2 мл, тампоны необходимо увлажнять непосредственно перед взятием смывов.

При обработке жирной поверхности следует пользоваться сухими тампонами.

13. Соскобы необходимо производить стерильным или прокаленным в пламени горелки ножом или скальпелем. Их собирают в стерильную банку или чашку Петри с небольшим количеством (2 — 3 мл) физиологического раствора.

14. Выемку проб воды производят в количестве не менее 1 литра. Указанное количество воды обеспечит возможность проведения санитарного анализа и соответствующих посевов для выявления патогенных энтеробактерий.

При необходимости исследования воды из графинов ее можно доставлять в лабораторию непосредственно в графинах.

15. Забор материала из зева и носа производят стерильными ватными тампонами, укрепленными на металлических палочках.

16. Пробы из секционного материала забирают в количестве 50 — 60 г каждого органа или ткани. Взятие пробы необходимо производить в стерильных условиях: поверхность органа прижигают раскаленным шпателем, кусочки вырезают из глубины стерильными ножницами.

Из желудка и кишечника содержимое забирают пастеровской пипеткой путем прокола их стенки. Место прокола предварительно прижигают раскаленным шпателем. Пробы от каждого органа необходимо помещать в отдельные стерильные банки, желательно с притертыми пробками. В лаборатории каждая взятая проба подвергается исследованию раздельно.

17. При необходимости обследования животных подлежащий исследованию материал: кровь, моча, испражнения, секционный материал (в случае гибели или вынужденного забоя), забирают так же, как от людей.

18. На пробы накладываются этикетки, пробы нумеруют, опечатывают сургучной печатью или пломбируют и упаковывают так, чтобы гарантировать целость материала, исключить возможность обсеменения или распространения инфекции. На каждой банке должна быть сделана наклейка с надписью: рвотные массы (первичные, повторные), промывные воды (первичные, повторные) и др. Обязательно на каждой наклейке указать фамилию, имя, отчество больного, дату взятия пробы.

19. Пересылку проб в лабораторию следует производить в кратчайший срок, так как время от забора проб до начала исследования может отразиться на достоверности результатов анализа. Если взятые на бактериологическое исследование пробы не могут быть доставлены в лабораторию немедленно, их разрешается хранить в холодильнике при температуре 4 — 6 град. не более одних суток.

В теплое время года пробы должны доставляться в охлажденном виде, в ящике со льдом. В холодное время года доставляемый в лабораторию материал следует предохранять от замерзания.

20. В лабораторию пробы доставляют в опечатанном виде. Вид упаковки, в которой доставлена в лабораторию проба на исследование, отмечается в соответствующем журнале.

21. В сопроводительном документе к материалам от заболевших (умершего) указывается: фамилия, имя, отчество, возраст обследуемого или умершего, если препровождается секционный материал, адрес, место работы, должность (для ребенка необходимо указывать, посещает ли он детское учреждение и какое), дата заболевания, диагноз или показания к обследованию, дата и время сбора материала, фамилия и должность лица, направившего материал.

22. При направлении в лабораторию пищевых продуктов в сопроводительном документе необходимо указать:

а) наименование предприятия или учреждения, где произведены выемки проб, его адрес, перечень проб с указанием их веса, характера тары и упаковки (стерильность посуды, охлаждение проб, наличие печати и т.д.), дату и час выемки и направления в лабораторию;

б) основные данные санитарно-эпидемиологического расследования: дата пищевого отравления, срок появления симптомов заболевания после приема подозреваемой пищи, описание клинических явлений у заболевших, число пострадавших, госпитализированных, наличие случаев со смертельным исходом, предварительный диагноз;

в) при направлении проб нескольких продуктов необходимо отметить, какой из них подозревается как причина пищевого отравления;

г) цель исследования;

д) должность и подпись лица, произведшего выемку и направившего пробы в лабораторию.

23. При направлении в лабораторию материала, взятого от животных, указывается: его наименование, дата забора пробы, вид животного, его возраст (молодняк, взрослые), название и адрес хозяйства или предприятия, из которого направляется материал, и повод для его обследования.

24. При приеме проб лаборатория должна выдать расписку и указать время получения проб.

25. Исследование материалов, доставленных в лабораторию в процессе расследования пищевого отравления, производится немедленно по их получении. Во время регистрации доставленного в лабораторию материала последний хранится в холодильнике.

26. Непосредственно перед посевом исполнителю необходимо ознакомиться с состоянием упаковки всего материала и каждой отдельной пробы, при этом обратить внимание на целость упаковки, наличие пломб и печатей, отметить количество доставленного материала.

В связи с тем, что большинство проб направляют в лабораторию для бактериологического и для химического исследования, указанный выше осмотр можно проводить совместно с химической лабораторией.

Необходимо перед анализом отметить органолептические качества доставленных проб: внешний вид, запах, консистенцию.

27. Продукты подвергают бактериологическому исследованию независимо от признаков порчи.

28. Бактериологические исследования пробы начинают с подготовки навески, которая должна охарактеризовать всю доставленную пробу. Материал для навески продуктов плотной консистенции (мясо, колбаса и др.) берут из разных мест доставленной пробы: с поверхности и из глубины. Если это тушка птицы — из мест, прилегающих к кишечнику; если рыба — вблизи жаберных дужек и анального отверстия.

Возможно использование для приготовления навески всей доставленной пробы, если даже ее вес достигает 600 — 800 г. Имеет определенное значение исследование навески, состоящей из кусочков, отобранных только из глубины доставленной пробы. В этом случае при отборе материала для навески производят стерилизацию поверхности металлическим шпателем или ножом.

Возможно исследование навески продукта, состоящей из кусочков, отобранных только из поверхностных слоев пробы, т.к. это позволяет установить вторичное загрязнение продукта. В этом случае небольшие кусочки пищевых продуктов засевают непосредственно, при этом поверхность пробы не обжигают раскаленным шпателем или ножом, т.к. это может привести к уничтожению патогенной формы.

Навеска продукта должна быть не менее 25 — 30 г.

29. Стерильно взятую навеску продукта плотной консистенции перед посевом гомогенизируют с небольшим количеством 0,1% пептонной воды или питательной среды (в соотношении от 1:2 до 1:5, в зависимости от консистенции исследуемого продукта). Для получения однородного гомогенизированного посевного материала рекомендуется пользоваться гомогенизатором (размельчителем тканей) РТ-1 Одесского завода.

При отсутствии гомогенизатора навеску продукта нарезают мелкими кусочками, помещают в стерильную банку, добавляют необходимое количество 0,1% пептонной воды и подвергают встряхиванию в течение 10 — 15 минут в аппарате для встряхивания.

30. Крем, масло сливочное, мороженое и т.п. перед посевом подвергают расплавлению. Для этого навеску в количестве 25 — 30 г отбирают в стерильную стеклянную банку и помещают либо в термостат при температуре 43 град., либо в водяную баню при той же температуре.

После расплавления производят посев, причем при посевах масла и сливочного крема необходимо использовать нижний слой.

31. Костный мозг перед посевом извлекают из трубчатых костей и эмульгируют в подогретом до 43 град. физиологическом растворе.

32. Жидкие объекты (молоко, напитки, супы, промывные воды) засевают без предварительной обработки. Пищевые продукты, имеющие кислую реакцию, а также рвотные массы перед посевом нейтрализуют 10% стерильным раствором двууглекислого натрия до слабощелочной реакции (pH 7,2 — 7,4). Реакцию среды проверяют по универсальной индикаторной или лакмусовой бумажке.

33. Невскрытые консервы в банках перед посевом осматривают, отмечают внешний вид, наличие бомбажа, ржавчины и т.п., затем обмывают теплой водой с мылом и проверяют на герметичность арбитражным способом (ГОСТ 10444-63). Непосредственно перед посевом банки протирают спиртом, а крышки обжигают.

34. Посев испражнений, если они доставлены в ректальных трубках, производится без предварительной подготовки.

Если испражнения были доставлены в лабораторию без консерванта, то их перед посевом суспендируют в физиологическом растворе в соотношении 1:10.

35. Для получения гемокультуры производят посев сгустка крови на соответствующие питательные среды в зависимости от цели исследования. Постановку серологической реакции производят с сывороткой крови. С целью лучшего формирования сгустка кровь выдерживают 30 — 40 минут при комнатной температуре или в термостате при 37 град., после чего стерильной пастеровской пипеткой или прокаленной петлей отделяют сгусток от стенок пробирки и помещают в холодильник при температуре 5 — 8 град. для окончательного формирования сгустка; сыворотку отсасывают и используют для постановки серологических реакций, а кровяной сгусток используют для посева.

36. Ватные тампоны на стеклянных или деревянных палочках или марлевые салфеточки перед посевом должны быть тщательно отмыты в жидкости, используемой для увлажнения тампона, в момент взятия смывов.

37. Посевным материалом является вся жидкость, используемая при производстве смывов. Кроме того, посев может быть произведен непосредственно тампоном на плотные или жидкие дифференциальные среды. При этом существенное значение имеет тщательное растирание материала досуха по всей поверхности плотной среды.

38. Изложенная выше методика подготовки проб к посеву дополняется отдельными методическими приемами, указанными в соответствующих разделах настоящей Инструкции.

Необходимо отметить, что, как правило, направление бактериологических исследований определяется клинической картиной заболевания и данными эпидемиологических исследований с учетом возможного выявления других приведенных в настоящей Инструкции возбудителей пищевых отравлений.

II. МЕТОДИКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

БАКТЕРИИ РОДА САЛЬМОНЕЛЛА

Общие сведения

Среди возбудителей пищевых токсикоинфекций одно из ведущих мест занимают бактерии, относящиеся к обширному роду сальмонелла семейства кишечных, который насчитывает в настоящее время более 1600 представителей серологических типов, и все они являются потенциально-патогенными для людей.

По последнему решению Международного номенклатурного комитета (1970) род сальмонелла подразделяют на четыре вида, обозначаемые как S. kauffmanil, S. salamae, S. arizonae и S. hotenae, отличающиеся друг от друга своими биохимическими характеристиками. Каждый из видов, в свою очередь, подразделяется на большее или меньшее количество серотипов, которые характеризуются определенной антигенной структурой, лежащей в основе их идентификации.

Бактерии сальмонелла имеют форму палочек с закругленными концами, длина которых варьирует от 1 до 3 мю, а ширина от 0,5 мю до 0,6 мю. Все они, за некоторым исключением, подвижны, благодаря наличию перитрихиально расположенных жгутиков. Спор и капсул сальмонеллы не образуют, они хорошо красятся анилиновыми красками, к окраске по Граму относятся отрицательно.

Сальмонеллы являются факультативными анаэробами. Они хорошо растут на обычных питательных средах, за исключением отдельных серологических типов (S. paratyphi A., S. cholerae — suis, S. typhi — suis, S. sendai, S. pullorum и некоторые другие). Оптимальной температурой роста для сальмонелл является 37°, а реакция среды слабощелочная (pH 7,2 — 7,4). При более низкой температуре (20°) или более высокой (42°) и при другой реакции среды (pH от 5,0 до 8,0) размножение их также может происходить, но значительно медленнее, чем при оптимальных условиях.

Большинству свежевыделенных штаммов S. paratyphi B, S. abortus equi, S. typhi suis и некоторых других при росте на агаре свойственна способность к валообразованию, которая выражается в том, что колонии по наружному краю слегка возвышаются, образуя слизистый вал. Способность к валообразованию у S. paratyphi B нередко используют при дифференциации этого серотипа от S. java, имеющей аналогичную с S. paratyphi B антигенную формулу, но не дающей вала при росте на агаре.

Преобладающее большинство сальмонелл не расщепляет салицина. Они не ферментируют адонит, лактозу, сахарозу, не расщепляют мочевину и не образуют индол. Все они быстро ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, хотя у таких серологических типов, как S. typhi murium, S. derby, S. thompson, могут встречаться и «безгазовые» варианты. Постоянно не образуют газа S. typhi и S. galli narum. Маннит сальмонеллы ферментируют почти аналогично глюкозе, за исключением отдельных штаммов S. enteritidis и S. typhi suis, которые могут его не ферментировать. Почти все сальмонеллы быстро ферментируют сорбит. Как правило, они не разжижают желатин. Все сальмонеллы редуцируют нитраты, дают отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и положительную пробу с метилрот. Большинство из них образует сероводород.

Отношение сальмонелл к арабинозе, дульциту, инозиту, ксилозе, рамнозе, трегалозе, а также kd-, i- и l-тартрату, к цитрату и мукату неодинаково даже в пределах одного и того же серологического типа, что позволяет подразделять их на различные биохимические типы. Такое биохимическое типирование может быть с успехом использовано в эпидемиологических целях.

Сальмонеллы обладают двумя основными антигенными комплексами, представляющими различные структурные части бактериальной клетки.

Соматические — O-антигены — термостабильные, сохраняющиеся при кипячении культуры в течение 2 — 5 часов.

Жгутиковые — H-антигены — термолабильные.

O-антигены представляют собой сложные липополисахаридно-пептидные комплексы, структура которых изучена достаточно полно. H-антигены имеют белковую природу.

Помимо указанных двух основных антигенных комплексов, у бактерий рода сальмонелла доказано наличие также антигенов из группы так называемых K-антигенов — поверхностных или капсульных (A, B, Z, Vi и др.), которые встречаются у многих представителей семейства кишечных бактерий.

У бактерий рода сальмонелла доказано наличие трех K-антигенов: 5, Vi и M. Антиген 5 — встречается у S. paratyphi B, S. typhi murium, а также у ряда других серологических типов и отличается от упоминавшихся соматических антигенов этих микробов не только отношением к нормальной соляной кислоте (разрушается) и несколько меньшей термоустойчивостью, но и углеводными соединениями.

Vi — термолабильный соматический антиген, является самостоятельным антигенным комплексом, присущим только двум серологическим типам сальмонелл — S. typhi и S. paratyphi C. Структурно Vi-антиген представляет собой полимер ацетиламиногексуроновой кислоты.

M-антиген (слизистый) обнаружен у слизистых штаммов S. paratyphi B, S. potsdam и некоторых других.

Антигенная структура сальмонелл лежит в основе их подразделения на серологические группы и типы.

На основании общности строения O-антигенов сальмонеллы объединяются в серологические группы (A, B, C, D, E, F, H и др.), которые включают в себя серологические типы, отличающиеся между собой структурой H-антигенов.

Широко известная диагностическая схема Кауфмана — Уайта является до некоторой степени каталогом тех компонентов антигенов бактерии сальмонелла, которые имеют диагностическое значение и отражают современное состояние знаний об антигенах сальмонелл и их комплексах.

В настоящее время схема Кауфмана — Уайта включает в себя 56 O-групп, отличающихся различными комбинациями более 20 различных комплексов H-антигенов первой фазы и более 10 различных комплексов H-антигенов второй фазы.

Определение антигенной формулы сальмонелл производится в реакции агглютинации с сальмонеллезными монорецепторными (монофакторными) сыворотками.

С помощью специфических типовых бактериофагов некоторые из серологических типов сальмонелл (S. typhi murium, S. enteritidis, S. thompson) могут быть подразделены на ряд фаготипов.

Сальмонеллы обладают сравнительно высокой степенью устойчивости к воздействию различных факторов внешней среды. В жидкой среде (физиологический раствор, бульон) при прогревании до 70° они погибают через 5 — 10 минут, а при кипячении погибают моментально. В молоке могут сохраняться при комнатной температуре до 5 суток. Они хорошо сохраняются при низких температурах. Соление и копчение оказывает на сальмонеллы относительно слабое действие. В мясном рассоле, содержащем до 29% поваренной соли, и при температуре 6° — 12° они могут оставаться жизнеспособными до 4 месяцев, а в соленом и копченом мясе погибают через 2,5 — 3 месяца.

Факторами распространения сальмонеллезов, как правило, являются продукты животного происхождения. Чаще всего заболевания возникают при употреблении в пищу инфицированного мяса и мясных продуктов. Преобладает при этом мясо крупного рогатого скота и свинина. Мясо домашних птиц (утки, куры, индейки, гуси) также нередко является причиной заболевания людей сальмонеллезом.

Определенную роль в распространении сальмонеллеза играют яйца, в т.ч. куриные. Особую опасность представляют яичные продукты: меланж, яичный порошок. Молоко и молочные продукты занимают более скромное место в распространении сальмонеллезов, однако при их инфицировании они оказываются причиной возникновения весьма значительных вспышек.

Эпидемиологическая роль рыбы и рыбных продуктов относительно невелика, вместе с тем известны случаи, когда рыба горячего копчения, различные рыбные блюда и даже сельдь пряного посола оказывались причиной возникновения заболеваний сальмонеллезом. Необходимо отметить также, что некоторые из холоднокровных животных, которые употребляются в отдельных странах в пищу, могут оказаться причиной заболеваний (устрицы, черепахи, змеи, лягушки и пр.). Инфицированными могут оказаться продукты не только животного происхождения, но и растительного (овощи, фрукты, ягоды, белковые концентраты из сои, различные злаки, сушеные фрукты и др.). Описаны случаи, когда причиной вспышек сальмонеллезов оказывались пищевые дрожжи, кондитерская краска кармин и др.

Естественно, что наибольшую опасность представляют такие продукты и блюда, которые после приготовления не подвергаются термической обработке и, особенно, если они длительно хранятся при комнатной температуре. Готовые блюда и продукты могут быть как первично инфицированы (мясо, молоко, яйца больных животных и птиц), так и вторично зараженными в процессе их кулинарной обработки (руками готовящих или раздающих пищу, через инфицированный кухонный инвентарь, при неправильном хранении и транспортировке).

Следует помнить, что даже при интенсивном размножении сальмонелл в пищевых продуктах они не изменяют ни вкуса, ни запаха, ни их внешнего вида.

Бактериологические исследования

Первый день

При исследовании плотных пищевых продуктов (мясо, колбаса, винегреты, творог и другие) подготовленную навеску в количестве не менее 25 г засевают в среду обогащения в соотношении 1:5, т.е. на 25 г навески берут 100 мл среды обогащения. В качестве сред обогащения могут применяться селенитовый бульон по Лейфсону, магниевая среда, среда Мюллера, Кауфмана. Однако лучшей из них является селенитовый бульон. Кроме того, производят посевы на поверхность хорошо подсушенных чашек с дифференциально-диагностическими средами (Плоскирева, Эндо, Вильсон — Блер).

Жидкие и полужидкие пищевые продукты (молоко, первые блюда, яичный меланж и др.) засевают в среду обогащения в количестве 25 мл (при этом используется среда с двойной концентрацией селенита) или магниевую среду двойной концентрации и на дифференциально-диагностические среды.

Кровь засевают в желчный бульон или среду Раппопорт.

Испражнения засевают в чашки Петри с плотными дифференциально-диагностическими средами и одновременно в среду обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду или среды Мюллера или Кауфмана).

Если испражнения доставлены в консерванте, каплю взвеси их наносят на поверхность плотной среды у края чашки и тщательно растирают стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности среды.

В том случае, если испражнения забирались ректальной трубкой, ее содержимое после перемешивания с консервирующей жидкостью наносят той же трубкой в чашку и материал тщательно растирают по поверхности среды.

При посеве испражнений в среды обогащения необходимо соблюдать соотношение посевного материала и среды — 1:5.

Мочу (осадок после центрифугирования или отстаивания) засевают в чашки Петри с плотными средами и в среды обогащения.

Дуоденальное содержимое (желчь) засевают в чашки с плотной средой и во флаконы с мясопептонным бульоном в соотношении 1:10. В последующие 3 дня делают высевы на плотные среды как из бульона, так и из пробирок с дуоденальным содержимым, которые в течение всех трех дней содержат в термостате при температуре 37°.

Рвотные массы и промывные воды засевают на плотные среды и в среды обогащения.

Спинномозговую жидкость засевают таким же образам, как и промывные воды или мочу.

Пунктат воспалительных очагов засевают в плотные среды и в среды обогащения в соответствии 1:5.

При исследовании секционного материала кусочки органов, мезентериальные узлы и отмытые от содержимого кусочки кишечника тщательно размельчают с добавлением нескольких миллилитров физиологического раствора. После отстаивания взвеси надосадочную жидкость засевают пипеткой на плотные среды и в среды обогащения. Отдельно проводят посев содержимого кишечника и крови.

Все посевы помещают в термостат при температуре 31° на 18 — 20 часов.

Второй день

Через 18 — 20 часов производится просмотр посевов в плотных питательных средах в чашках Петри и пересев 3 — 5 подозрительных колоний в пробирки с комбинированными средами — средой Ресселя или «скошенный столбик с мочевиной» или трехсахарный агар с мочевиной. Посев делают сначала штрихами по скошенной поверхности, а затем уколом вглубь столбика.

Пробирки с посевами инкубируют в термостате при температуре 37° до следующего дня.

На среде Эндо сальмонеллы растут в виде круглых, бесцветных или слегка розоватых прозрачных нежных колоний. На среде Плоскирева колонии бактерий сальмонелл также бесцветны, но более плотные и несколько меньших размеров. На среде Вильсона — Блер сальмонеллы, как правило, растут в виде черных колоний, с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют S. paratyphi A и некоторые серологические типы из группы «C» и других групп, которые при росте на этой среде образуют нежные, светлые зеленоватые колонии.

Посевы на среду Вильсона — Блер просматривают дополнительно через 48 часов.

Если на чашках подозрительные колонии отсутствуют, ответ выдают только после учета результатов высевов из сред обогащения.

Производят высев из среды обогащения на плотные питательные среды.

Из посевов желчи в бульон и исходной желчи, содержащихся в термостате, делают первый высев на чашки со средами Плоскирева и Вильсона — Блер.

Из посева крови в желчный бульон (среду Раппопорт) делают высев на чашку со средой Эндо либо с обычным питательным агаром (pH 7,2 — 7,4), а исходный посев крови снова помещают в термостат.

В случае, если в результате прямого посева испражнений не выросло ни одной колонии, необходимо произвести повторный высев, увеличив порцию засеваемого материала. При повторном отсутствии роста следует получить материал для исследования еще раз.

Третий день

Производят идентификацию культур, высеянных накануне на среду Ресселя или трехсахарный агар с мочевиной, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины, а также по серологическим свойствам, которые определяют в реакции агглютинации на стекле с поливалентными и монорецепторными сыворотками.

Если культуры сбраживают лактозу и глюкозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелла.

Культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа), подвергаются дальнейшему изучению.

Культуры, ферментирующие глюкозу без газообразования, подозрительны как брюшнотифозные или дизентерийные, и их дальнейшее изучение проводят соответствующим образом.

Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа (дающие в среде пузырьки), могут принадлежать к роду сальмонеллла.

Все подозрительные культуры пересевают на «пестрый ряд», состоящий из полужидких или жидких (с поплавком) сред с маннитом и сахарозой, полужидкий агар для определения подвижности, а также в бульон для определения образования индола и сероводорода.

Одновременно производят серологическую идентификацию культур в реакции агглютинации с поливалентными сыворотками (ABCDE и редких групп), а также с монорецепторными сыворотками.

Серологическую идентификацию сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле со смесью O-сывороток (смесь (ABCDE)), включающей в себя агглютинины к O-антигенам 2, 4, 7, 8, 9 и 3 — 10. При отсутствии реакции агглютинации с указанной смесью культуру испытывают со смесью O-сывороток к редким группам сальмонелл, включающих антитела к антигенам 11, 13, 15, 19, 22, 23 и др.

При получении положительных результатов агглютинации со смесью O-сывороток культуру испытывают с каждой из O-сывороток, входящих в состав смеси отдельно, для определения принадлежности ее к одной из O-групп.

После установления принадлежности культуры к определенной O-группе ее испытывают с H-сыворотками сначала первой фазы, а затем — второй. Начинать следует с H-сывороток, соответствующих более распространенным серологическим типам сальмонелл данной группы.

После определения H-антигена первой фазы определяют H-антигенные компоненты второй фазы и таким образом устанавливают антигенную формулу выделенной культуры, т.е. ее серологический тип.

Для агглютинации с O-сывороткой культуру следует брать с верхней части роста на скошенном агаре, для агглютинации с H-сыворотками — из самой нижней части роста культуры или из конденсата, где располагаются особи с наиболее развитым H-антигеном.

На третий день исследования производят также просмотр чашек с посевами из сред обогащения и подозрительные колонии отсевают на среду Ресселя или «скошенный столбик» с мочевиной или трехсахарный агар с мочевиной.

Если при первичном посеве и при высеве из сред обогащения подозрительных колоний не обнаружено, может быть дан ответ об отрицательном результате исследования.

Посевы на среду Вильсона — Блер (из среды обогащения) независимо от результатов просмотра оставляют в термостате еще на 24 часа. В этот же день просматривают чашки с первым высевом из флакона с засеянной кровью с дуоденальным содержанием, подозрительные колонии пересевают на среду Ресселя или «скошенный столбик» с мочевиной или трехсахарный агар с мочевиной и делают второй высев на чашки.

Кроме перечисленных выше методов идентификации выделенных культур и пересевов, на третий день производят посев выделенной культуры для испытания ее на чувствительность к сальмонеллезному O-фагу.

Для этого две капли четырех- или восемнадцати-часовой бульонной культуры испытуемого штамма наносят тонкооттянутой пастеровской пипеткой или петлей (диаметр 0,4 — 0,5 мм) на хорошо подсушенный слабощелочной агар в чашки Петри. После подсыхания на одну из капель петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра наносят O-бактериофаг, а на другую, в качестве контроля, — каплю бульона.

Фаг наносят в рабочем разведении, указанном на этикетке.

На одной чашке, таким образом, можно испытать одновременно 5 — 6 культур.

Чашки с нанесенными культурами и O-бактериофагом помещают в термостат при 37° на 18 — 20 часов, после чего учитывают результаты.

Появление на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного лизиса или большего или меньшего числа негативных колоний, отчетливо видимых невооруженным глазом, свидетельствует о чувствительности культур к O-бактериофагу.

При отсутствии лизиса в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле.

О-фаг может быть использован для предварительного испытания культуры из колонии с чашки с дифференциальной средой.

Культура, лизировавшаяся O-фагом, является подозрительной как сальмонелла и может быть прямо с чашки испытана в реакции агглютинации со смесью сальмонеллезных O-сывороток.

Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к O-фагу, в то время как культуры, лишь сходные с сальмонеллами по биохимическим свойствам (например, лактозонегативные E. coli), как правило, не лизируются этим фагом.

Четвертый день

Производят учет результатов посевов на «пестрый ряд» (ферментация маннита и сахарозы, образование индола, сероводорода и подвижности).

При выделении культур грамотрицательных подвижных палочек, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием или без образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, не образующих индола, образующих сероводород и обладающих четкой серологической характеристикой, выдают ответ о выделении сальмонелл.

Если выделяются культуры, имеющие отклонения от типичных, они подвергаются дальнейшему изучению.

В этот же день производят просмотр чашек со вторым высевом дуоденального содержимого из бульона и третий высев из последнего на плотные среды.

При отрицательных результатах первых двух высевов из желчного бульона с посевом крови высевы повторяются в 5-й и 10-й дни.

При идентификации культур, подозрительных на сальмонеллы, чаще всего вызывают затруднение бактерии, биохимически сходные с сальмонеллами, но не агглютинирующиеся с сальмонеллезными сыворотками, либо дающие агглютинацию, но отклоняющиеся по биохимическим свойствам.

В таких случаях, прежде всего, необходимо убедиться в чистоте культуры, для чего следует произвести ее рассев в чашку со слабощелочным агаром или средой Эндо, отобрать наиболее типичные колонии и подвергнуть их дополнительному изучению.

Посев культуры в жидкую среду, содержащую повышенное количество лактозы (4%) и пониженное количество пектона (0,3 — 0,5%), позволяет в более ранние сроки выявить отношение к лактозе.

В случае выделения культур, агглютинирующихся смесью O-сывороток редких групп, но не агглютинирующихся ни одной из O-сывороток, входящих в смесь, можно рекомендовать испытание таких культур на способность ферментировать салицин, малонат натрия, адонит, дульцит, сорбин, а также в реакции Фогес-Проскауэра и с метилрот. С помощью этих тестов удается дифференцировать бактерии рода сальмонелла от представителей других родов семейства кишечных, имеющих общие антигенные комплексы с сальмонеллами.

Для выявления отсутствующей фазы жгутикового антигена следует сделать посев в U-образную трубочку, заполненную полужидким (0,2%) агаром. Для выявления наиболее подвижных особей нужно просматривать рост через 4 — 6 часов и на следующее утро. При появлении роста в другом колене сразу же делают пересев из последнего на свежескошенный агар. Так улавливаются наиболее подвижные особи. Для определения отсутствующей фазы H-антигена используют также посев по Свену — Гарду. Принцип его заключается в том, что на рыхлом агаре (0,9 — 1%) роятся все подвижные микробы.

Если добавить к агару 1 — 2 капли сыворотки известной нам фазы, т.е. той фазы, которая была определена, то он свяжет выявленный антиген, а особи микробов, богатые другим, неизвестным антигеном, будут бурно роиться. Этот антиген легко может быть выявлен при испытании культуры, взятой с края макроколонии, в реакции агглютинации.

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ

РОДОВ СЕМЕЙСТВА КИШЕЧНЫХ

┌──────────────────────────┬───────┬───────┬────────┬───────┬──────┬──────┐

│ │Сальмо-│Шигелла│Эшерихиа│Цитро- │Клеб- │Протей│

│ │нелла │ │ │бактер.│сиелла│ │

├──────────────────────────┼───────┼───────┼────────┼───────┼──────┼──────┤

│салицин │- │- │x │x │+ │+/- │

│сорбит │+ │x │x │+ │x │- │

│малонат натрия │-/+ │- │- │- │+ │- │

│адонит │- │- │- │- │x │-/+ │

│дульцит │+/- │x │x │x │x │- │

│р. Фогес-Проскауэра │- │- │- │- │+ │-/+ │

│р. с метилрот │+ │+ │+ │+ │- │+/- │

└──────────────────────────┴───────┴───────┴────────┴───────┴──────┴──────┘

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

+ Ферментация среды

— среда не ферментируется

+/- среда чаще ферментируется, иногда не ферментируется

-/+ среда чаще не ферментируется, иногда ферментируется

x варианты по отношению к данному признаку.

Серологические исследования

Серологическое исследование может преследовать различные цели:

1. Подтверждение клинического диагноза;

2. Подтверждение этиологической роли выделенного возбудителя;

3. Ретроспективная постановка или исключение диагноза.

В первых двух случаях решающим будет нарастание титра антител в процессе болезни. Реакция агглютинации должна быть прослежена в динамике, для чего ее ставят на 1 — 3 день заболевания (прививочная или анамнестическая реакция), а затем на 7 — 10 день и на 15 — 20 день.

Кровь для серологического исследования берут из пальца или из локтевой вены. Для постановки реакции агглютинации необходимо не менее 0,5 — 1 мл крови.

Кровь собирают в стерильную пробирку, которую помещают при 37° на 30 — 60 минут, после чего сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой и переносят пробирку в холодильник. После отстаивания сыворотку отсасывают и подвергают исследованию.

Для постановки реакции агглютинации, прежде всего, готовят первое разведение сыворотки 1:100, для чего в пробирку вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки и 9,9 мл физиологического раствора. Далее готовят ряды пробирок (по четыре в каждом) в количестве, соответствующем числу применяемых антигенов (диагностикумов). Во все пробирки, кроме первой, каждого ряда наливают по 0,5 мл физиологического раствора. Сыворотку, разведенную 1:100 по 0,5 мл, добавляют в 1 и 2 пробирки каждого ряда, при этом во второй пробирке разведение сыворотки будет 1:200. Содержимое 2-й пробирки после тщательного перемешивания в количестве 0,5 мл градуированной пипеткой переносят в 3-ю пробирку (разведение 1:400), из третьей в четвертую (разведение 1:800). Из последней пробирки после тщательного перемешивания 0,5 мл сыворотки выливают.

В каждый ряд агглютинационных пробирок с разведениями сыворотки и в контрольную пробирку, в которой содержится 0,5 мл физиологического раствора, добавляют по одной капле одного из диагностикумов. Вторым контролем (контроль сыворотки) является пробирка с сывороткой, разведенной 1:50 или 1:100, в которую диагностикум не добавляют.

После добавления диагностикумов штатив с пробирками энергично встряхивают и помещают в термостат при температуре 37° на 18 — 20 часов. Учет результатов реакции агглютинации производят с помощью агглютиноскопа или лупы.

Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается хорошо выраженная агглютинация, считают ее титром.

В настоящее время для постановки реакции агглютинации выпускаются O- (2, 4, 7, 8, 9, 3 — 10) и H- (a, b, c, d, r, ch и др.) сальмонеллезные монодиагностикумы.

Реакцию агглютинации можно поставить и со штаммом, выделенным у больного или бактерионосителя (аутоштамм). В этом случае в качестве диагностикума используют взвесь живой или убитой суточной агаровой культуры бактерий в физиологическом растворе.

Абсолютная высота титров агглютининов не может быть доказательством наличия заболевания. Получение достоверных результатов реакции агглютинации достигают при повторных испытаниях сыворотки крови в динамике инфекционного процесса.

О положительном результате серологического исследования сыворотки будет свидетельствовать отчетливое нарастание титра агглютинов.

Критерии диагностики

Известно, что при эпидемиологической расшифровке отдельных больных или вспышек сальмонеллезной этиологии (особенно обусловленных одновременно несколькими типами возбудителя), а также при обнаружении сальмонелл в каких-либо пищевых продуктах или других объектах внешней среды нередко приходится встречаться с определенными трудностями, связанными с установлением источников инфекции и факторов ее передачи.

Эти трудности могут быть связаны с необходимостью:

а) доказательства этиологической роли возбудителя, выделенного у заболевшего;

б) ретроспективного выявления ранее переболевших с целью установления масштабов распространения инфекции и возможных ее источников;

в) аргументации наличия единого или множественных источников инфекции и факторов ее передачи для всех пострадавших.

В первых двух случаях, наряду с данными эпидемиологического и бактериологического обследования, большую помощь могут оказать также и серологические исследования по обнаружению в сыворотке крови обследуемых специфических антител.

В третьем случае доказательством будет служить выделение у больных, бактерионосителей, из пищевых продуктов, воды, смывов с объектов внешней среды и у животных сальмонелл одного и того же серологического типа.

Большую помощь для установления или исключения эпидемиологических связей между отдельными случаями заболеваний сальмонеллезами, а также подтверждения или исключения эпидемиологической роли подозреваемых источников (люди или животные — больные или бактерионосители) и факторов передачи инфекции могут оказать результаты биохимического изучения или фаготипирования выделенных возбудителей.

БАКТЕРИИ РОДА ШИГЕЛЛА

Общие сведения

Известно, что пищевые продукты, содержащие бактерии рода Shigella, могут быть причиной заболеваний, протекающих по типу пищевых бактериальных отравлений.

Выживаемость шигелл Зонне и Флекснера в продуктах при комнатной температуре от 2 — 3 дней (консервированные огурцы) до 50 — 60 дней (масло, маргарин). Срок этот увеличивается при хранении продуктов в холодильнике. Среди продуктов, которые могут вызвать массовые заболевания, протекающие клинически по типу пищевой токсикоинфекции, чаще всего в настоящее время регистрируются молоко и молочные продукты, изделия из отварного мяса — студни, паштеты, мясные салаты, макароны по-флотски.

По современной классификации, принятой в СССР, шигеллы являются самостоятельным родом Shigella семейства Enterobacteriaceae. Основные дифференциальные признаки отдельных представителей этого семейства, не подразделяющихся морфологически, заключаются в отличиях метаболизма и специфичности антигенной структуры. В связи с этим идентификация кишечных бактерий базируется в определении их ферментативной активности и серологической характеристики.

К шигеллам относятся грамотрицательные микроорганизмы, имеющие форму палочек длиной от 2 до 4 мю и шириной до 0,8 мю. Шигеллы не имеют жгутиков, не образуют спор, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями.

Шигеллы — факультативные анаэробы, хорошо растут в аэробных условиях на простых питательных средах. Оптимальная температура роста 37°, однако представители вида Sh. sonnei способны размножаться при температуре от 10° до 45°. Оптимальная реакция среды при pH около 7,2.

В соответствии с предложением Подкомитета по кишечным бактериям Международной комиссии по Shigella к роду Shigella относятся бактерии, имеющие следующие химические свойства (таблица 1).

Таблица 1

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА SHIGELLA

Глюкоза кислотообразование без газа

Маннит кислотообразование непостоянно

Адонит кислота не образуется

Дульцит кислотообразование непостоянно

Инозит кислота не образуется

Лактоза кислотообразование непостоянно

Салицин кислота не образуется

Сахароза кислотообразование непостоянно

Индол образуется или не образуется

Желатин не разжижается

Сероводород не образуется

Цитрат аммония не утилизируется

Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная

Реакция с метилротом положительная

Мочевина не расщепляется

Нитраты редуцируются

Основным дифференциальным признаком шигелл является ферментация углеводов без газообразования. Исключение составляют некоторые биохимические варианты шигелл подвида Ньюкасл, сбраживающие глюкозу с образованием газа.

Современная классификация шигелл строится на комплексе биохимических и серологических свойств (таблица 2).

Таблица 2

КЛАССИФИКАЦИОННЫЕ СХЕМЫ ШИГЕЛЛ

———————————

<1> Лишены типовых антигенов, дифференцируются по групповым.

В зависимости от ферментативной активности по отношению к манниту и лактозе шигеллы подразделяются на 3 подгруппы:

не расщепляющие маннита или маннитнегативные (виды Григорьева — Шига, Штуцера — Шмитца, Лардж — Сакса, провизорные);

расщепляющие маннит или маннитпозитивные (вид Флекснера, подвиды Флекснера, Ньюкасл, Бойда);

медленно расщепляющие лактозу (вид Зонне).

Дальнейшая дифференциация шигелл внутри подгрупп проводится на основании различий в антигенной структуре (таблица 2) и ферментативной активности (таблица 3).

Таблица 3

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

РОДА SHIGELLA

┌───────┬──────┬─────┬────┬──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┬───────┬────┬────┐

│ Вид │Подвид│Под- │Ок- │ Расщепление │Образо-│Ути-│Ре- │

│микроба│ │виж- │рас-│ │вание │ли- │ак- │

│ │ │ность│ка ├────┬────┬────┬───┬─────┬────┬─────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┬────┬───┬───┬───┬────┼───┬───┤за- │ция │

│ │ │ │по │лак-│глю-│ман-│са-│маль-│адо-│дуль-│сор-│ара-│кси-│рам-│са-│цио-│гли-│же-│мо-│ли-│глю-│ин-│се-│ция │Фо- │

│ │ │ │Гра-│тозы│козы│нита│ха-│тозы │нита│цита │бита│би- │лозы│нозы│ли-│зита│це- │ла-│че-│зи-│та- │до-│ро-│цит-│гес-│

│ │ │ │му │ │ │ │ро-│ │ │ │ │нозы│ │ │ци-│ │рина│ти-│ви-│на │ми- │ла │во-│рата│Про-│

│ │ │ │ │ │ │ │зы │ │ │ │ │ │ │ │на │ │ │на │ны │ │но- │ │до-│ │ска-│

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │вой │ │ро-│ │уэра│

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │кис-│ │да │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │лоты│ │ │ │ │

├───────┼──────┼─────┼────┼────┼────┼────┼───┼─────┼────┼─────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┼────┼───┼───┼───┼────┼───┼───┼────┼────┤

│Гри- │ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │- │V │- │- │- │- │(+) │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│горьева│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│- Шига │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Штуцера│ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │V │V │- │+ │- │- │V │- │- │- │+ │+ │- │- │- │

│- Шмит-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ца │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Лардж -│ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │(+) │(+) │- │- │- │- │(+) │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│Сакса 3│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Лардж -│ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │V │(+) │- │- │- │- │(+) │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│Сакса 4│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Лардж -│ │- │- │- │+ │- │- │- │- │(+) │(+) │+ │- │- │- │- │(+) │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│Сакса 5│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Лардж -│ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │V │+ │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│Сакса 6│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Лардж -│ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │- │+ │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │+ │- │- │- │

│Сакса 7│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Прови- │ │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │- │+ │+ │- │- │- │(+) │- │- │- │+ │+ │- │- │- │

│зорные │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│8 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Прови- │ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │V │+ │- │- │- │- │(+) │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│зорные │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│9 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Прови- │ │- │- │- │+ │- │- │V │- │- │+ │+ │+ │- │- │- │- │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│зорные │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│10 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Флекс- │ │- │- │- │+ │+ │V │V │- │- │V │V │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │V │- │- │- │

│нера │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Флекс- │Флекс-│- │- │- │+ │V │- │V │- │V │V │(+) │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │- │- │- │- │

│нера │нера │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Флекс- │Нью- │- │- │- │+ │+ │- │V │V │V │V │V │V │V │- │- │(+) │- │- │- │+ │V │- │- │- │

│нера │касл │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Зонне │Бойда │- │- │(+) │+ │+ │V │V │- │- │- │+ │V │V │- │- │V │- │- │V │+ │- │- │- │- │

└───────┴──────┴─────┴────┴────┴────┴────┴───┴─────┴────┴─────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┴────┴───┴───┴───┴────┴───┴───┴────┴────┘

Условные обозначения: + расщепление в первые сутки

(+) замедленное расщепление

V вариабильные результаты

— отсутствие расщепления.

Так как пищевые отравления шигеллезной этиологии обычно обусловлены шигеллами Зонне и реже шигеллами Флекснера, дальнейшая идентификация по серологическим свойствам и описание методов внутривидового типирования дается только по шигеллам этих двух видов.

Антигенная структура шигелл отличается простотой и представлена, в основном, соматическими, термостабильными O-антигенами. Выявленный в последнее время у многих типов шигелл поверхностный K-антиген хотя и не имеет диагностического значения, но может вызвать инагглютинабильность свежевыделенных культур O-сыворотками. Этот дефект легко устраняется кипячением неагглютинабильных штаммов.

Наряду с изучением биохимических свойств идентификация маннитпозитивных дизентерийных палочек основана на изучении их антигенной структуры путем выявления типовых и групповых антигенов (таблица 2). Типовые антигены узко специфичны и определяют серологические типы подвида шигелл Флекснера (I, II, III, IV, V) и шигелл Бойда (1 — 15), а также подвид Ньюкасл (VI). Групповые антигены в различных сочетаниях входят в структуру дизентерийных палочек Ньюкасл (3, 4) и Флекснера (3, 4, 6, 7, 8), и их выявления позволяют подразделить указанные серотипы шигелл Флекснера на подтипы.

Группу дизентерийных палочек, медленно разлагающих лактозу, составляет один вид шигелл Зонне, характеризующихся серологической однородностью.

Бактериологические исследования

Первый день

Обнаружение шигелл в исследуемом материале производят параллельно с обнаружением сальмонелл в тех же посевах и на тех же элективных средах, описание которых приведено в соответствующем разделе настоящей инструкции. В качестве среды обогащения для шигелл применяют только жидкую селенитовую среду. При посеве твердого материала селенитовую среду используют обычной концентрации и соблюдают соотношение посевного материала к среде как 1:5.

При посеве материала жидкой консистенции (жидкие пищевые продукты, рвотные массы, промывные воды и др.) используют селенитовую среду двойной концентрации и соотношение посевного материала к среде как 1:1. Посевы инкубируют при температуре 37° 18 — 20 часов.

В последнее время для ускоренной диагностики и обнаружения патогенных микроорганизмов в первые сутки исследования из объектов внешней среды (вода, смывы, пищевые продукты и т.д.) применяют метод люминесцирующих антител, или люминесцентносерологический метод, относящийся к однофазовым серологическим реакциям антиген-антитело. Его отличие от других реакций этого типа заключается в том, что происходит соединение антигенов бактерий с соответствующими специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями. Для просмотра препаратов используют люминесцентные микроскопы МА-1, МЛ-2, МЛ-3, МЛД-1. Цвет свечения зависит от цвета люминисцентного красителя, применяемого для метки сыворотки. В случае положительной реакции на темном фоне препарата видны клетки характерной морфологии, светящиеся по периферии. Оценка результатов проб непосредственно из объектов внешней среды с целью обнаружения возбудителей дизентерии должна быть очень осторожной. Использование люминесцирующих дизентерийных сывороток Флекснера и Зонне (выпускаемых Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи) позволяет получить ответ, имеющий лишь сигнальное, ориентировочное значение. Основная причина этого — существование общности антигенной структуры среди непатогенных видов бактерий и, в частности, кишечной палочки с бактериями ряда Shigella, что приводит к ложноположительному окрашиванию сопутствующей микрофлоры.

Окончательное заключение может быть выдано только на основании выделения из исследуемого материала возбудителя и полной его дальнейшей идентификации.

Второй день

После инкубации просматривают чашки с посевами и лактозоотрицательные колонии, бесцветные, отсевают на двухсахарную среду Ресселя (лактоза + глюкоза) или на двухсахарный скошенный столбик (лактоза + глюкоза) с мочевиной.

С селенитовой среды накопления производят пересев на бактоагар Плоскирева. Все посевы инкубируют при 37° 18 — 20 часов.

Третий день

Просматривают чашки с пересевами из селенитовой среды обогащения и отвивают лактозоотрицательные колонии на комбинированную среду Ресселя или двухсахарный скошенный столбик с мочевиной и инкубируют при 37° 18 — 20 часов.

Проводят идентификацию выделенных накануне культур по биохимическим и серологическим свойствам в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными сыворотками.

Для дальнейшего изучения отбирают культуры грамотрицательных бесспоровых палочек с характерными свойствами для шигелл, а именно: не расщепляющие лактозу и мочевину, ферментирующие глюкозу до кислоты, неподвижные при изучении 4 — 6-часовой бульонной культуры в висячей или раздавленной капле. Следует учитывать, что среди шигелл Зонне встречаются биохимические варианты, ферментирующие лактозу до кислоты, а некоторые варианты шигелл Ньюкасл расщепляют глюкозу до кислоты и газа. Для окончательной идентификации изучаемые культуры засевают на среды Гисса с углеводами: сахарозой, мальтозой, ксилозой, арабинозой, рамнозой и многоатомными спиртами — маннитом и дульцитом, на столбик с полужидким 0,2% агаром для определения подвижности, на скошенный мясопептонный агар (1,7%), на питательную среду Кристенсена. Способность расщеплять аминокислоты до индола и сероводорода выявляется при посеве культуры на мясопептонный бульон (индолообразование) и 1% пептонную воду (сероводородообразование).

Образование индола и сероводорода учитывают по изменению цвета индикаторных бумажек, помещенных под пробки в пробирки с посевами. Инкубируют все посевы при 37° 18 — 20 часов.

Культуры, биохимические свойства которых соответствуют биохимической активности шигелл (таблица 3), испытывают в реакции агглютинации на стекле сначала со смесью N 1 (поливалентная сыворотка к шигеллам Флекснера, Ньюкасл, Зонне), а в случае отрицательной реакции — с набором поливалентных сывороток к шигеллам Бойда, Григорьева — Шига и Штуцера — Шмитца, Лардж — Сакса (3 — 7), провизорным (8 — 10).

При положительной реакции агглютинации на стекле с одной из поливалентных сывороток продолжают серологическую идентификацию культуры с адсорбированными сыворотками, входящими в поливалентную. В случае положительной реакции с поливалентной сывороткой Флекснера необходимо определить подвид, тип и подтип шигелл Флекснера (таблица 2) в реакции агглютинации на стекле с типовыми и групповыми сыворотками.

Четвертый день

Производят окончательную идентификацию культур по биохимическим свойствам (таблица 3). Отмечают изменения углеводных сред Гисса, образование индола и сероводорода, образование щелочи и кислоты на среде Кристенсена, устанавливают антигенную формулу при помощи повторной реакции агглютинации на стекле культур, снятых со скошенного агара, и выдают предварительный ответ о наличии или отсутствии в исследуемом материале дизентерийных бактерий.

При идентификации выделенных культур могут возникнуть следующие затруднения:

1. Выделение культур шигелл с отклонениями от типичной характеристики по ферментативной активности. Так, например, встречаются маннитнегативные варианты шигелл Зонне и Флекснера, маннитферментирующие разновидности шигелл Лардж — Сакса, ксилозоферментирующий вариант Флекснера: лактозоферментирующий вариант подвида Бойда.

2. Выделение инагглютинабильных дизентерийных культур.

а) из-за наличия поверхностного антигена «К». В этом случае прогревание культуры в течение 1 — 1,5 часа при 100° разрушает термолабильный K-антиген и агглютинация с O-сывороткой восстанавливается;

б) из-за утраты типоспецифического антигена шигеллами Флекснера. Селекционирование отдельных колоний с питательного агара, обладающих полным антигенным комплексом, позволяет выяснить истинный серотип культуры.

3. Выделение атипичных представителей семейства кишечных, обнаруживающих сходство по биохимическим и серологическим свойствам с шигеллами. Дифференциальные биохимические признаки некоторых представителей наиболее часто встречающихся родов семейства кишечных, которые могут оказать помощь при их идентификации, представлены в таблице в разделе «Бактерии рода Сальмонелла» — см. выше.

Дополнительно целесообразно исследовать чувствительность выделенных культур к поливалентному дизентерийному фагу. Для этого используют следующую методику: на хорошо подсушенную чашку со слабощелочным агаром (pH 7,6) наносят пастеровской пипеткой каплю смыва 18 — 20-часовой агаровой культуры. На подсохшие капли оттянутой пастеровской пипеткой наносят дизентерийный бактериофаг; после подсушивания чашки инкубируют при 37° в течение 18 — 20 часов. При положительном результате наблюдается задержка роста культуры на чашках с бактериофагом.

В затруднительных случаях при идентификации бактерий семейства кишечных рекомендуется применить кератоконъюнктивальную пробу на морских свинках. При постановке этой пробы полную петлю (диаметром 5 мм) суточной агаровой культуры вносят в конъюнктивальный мешок глаза морской свинки под нижнее веко. Подавляющее большинство свежевыделенных дизентерийных бактерий вызывает у морских свинок специфический кератоконъюнктивит на 2 — 5 сутки: конъюнктива гиперимирована, роговица мутная, набухшая, с белесоватым оттенком, обильное гнойное отделяемое.

Кроме шигелл кератоконъюнктивит могут вызывать патогенные кишечные палочки серотипа 0124:В17 и очень редко некоторые сальмонеллы (например — S. typhi murium), но эти энтеробактерии легко дифференцируются от шигелл по их биохимическим свойствам.

Наиболее важное значение при идентификации культур шигелл имеет подробное изучение их биохимических свойств. При невозможности окончательной идентификации культур на местах их необходимо направлять в Регионарные центры — опорные базы Всесоюзного центра по шигеллам. Для выдачи окончательного ответа, подтверждающего не только выделение шигелл из исследуемого материала, но и выявляющего общий источник заражения и пути передачи инфекции, требуется более углубленное изучение выделенных штаммов с использованием методов внутривидового типирования. Для этого выделенные культуры шигелл подвергают более детальному биохимическому изучению, позволяющему осуществить дальнейшую дифференциацию возбудителя внутри серологических типов, и, кроме того, используют методы, основанные на феномене колициногении.

Для определения биохимических вариантов применяют углеводы, которые позволяют подразделить серотипы на + (ферментирующие за 24 час.) и — (не ферментирующие) варианты. Например: шигеллы Флекснера серотипа 2 (любого подтипа) могут быть дополнительно подразделены на раффиноза + или — варианты, индолпозитивные и индолнегативные; шигеллы Флекснера серотипа 4 могут иметь биохимические варианты по отношению к 5 углеводам — манниту, сорбиту, ксилозе, рамнозе, рафинозе.

В таблице 4 представлены биохимические свойства шигелл вида Флекснера, подвида Флекснера.

Таблица 4

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШИГЕЛЛ ВИДА ФЛЕКСНЕРА,

ПОДВИДА ФЛЕКСНЕРА

┌────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────┐

│ Углеводы │ Серотипы │

│ ├────────┬────────┬────────┬────────┬────────┤

│ │ I │ II │ III │ IV │ V │

├────────────────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤

│Маннит │+ │+ │+ │V │+ │

│Арабиноза │(+) │(+) │V │(+) │V │

│Сорбит │- │- │(+) │V │V │

│Ксилоза │- │- │- │V │- │

│Рамноза │- │- │V │V │V │

│Рафиноза │(+) │V │V │V │V │

│Индол │V │V │V │+ │+ │

└────────────────────────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┘

Обозначения: + ферментация через 24 часа

(+) поздняя ферментация

V вариабильные результаты (+ и — варианты).

Шигеллы вида Флекснера подвида Ньюкасл в зависимости от характера ферментации глюкозы, маннита и дульцита подразделяются на 7 биотипов (таблица 5).

Таблица 5

БИОХИМИЧЕСКИЕ ТИПЫ ШИГЕЛЛ ПОДВИДА НЬЮКАСЛ

┌──────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐

│ Биотипы │ Ферментация │

│ ├─────────────────┬──────────────────┬─────────────────┤

│ │ глюкоза │ маннит │ дульцит │

├──────────────────┼─────────────────┼──────────────────┼─────────────────┤

│Бойд 68 │+ │+ │- │

│Бойд 68 │+ │+ │(+) │

│Манчестер │+ г │+ г │(+ г) │

│Манчестер │+ г │+ г │- │

│Ньюкасл │+ г │- │(+ г) │

│Ньюкасл │+ │- │- │

│Ньюкасл │+ │- │(+) │

└──────────────────┴─────────────────┴──────────────────┴─────────────────┘

Обозначения: + ферментация в первые сутки до кислоты

г газообразование

(+) поздняя ферментация

— ферментация отсутствует.

Большинство серотипов (11 из 15) шигелл подвида Бойда также подразделяются на биохимические варианты в зависимости от их ферментативной активности (таблица 6). Исключение — серотипы 1, 6, 7 и 8.

Таблица 6

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШИГЕЛЛ ПОДВИДА БОЙДА

┌─────────────┬───────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Углеводы │ Серотипы │

│ ├───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │10 │11 │12 │13 │14 │15 │

├─────────────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤

│Маннит │+ │+ │(+)│+ │+ │(+)│+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │V │+ │

│Арабиноза │+ │+ │+ │(+)│V │+ │+ │+ │V │+ │(+)│+ │+ │+ │(+)│

│Сорбит │(+)│V │(+)│V │(+)│+ │(+)│(+)│(+)│V │V │V │+ │(+)│(+)│

│Ксилоза │(+)│- │(+)│- │(+)│(+)│+ │(+)│- │V │(+)│- │- │(+)│+ │

│Рамноза │- │- │- │- │- │- │- │- │V │- │- │- │- │- │- │

│Дульцит │- │- │V │V │- │(+)│- │- │- │(+)│V │V │- │- │- │

│Глицерин │(+)│(+)│+ │(+)│(+)│(+)│(+)│(+)│V │+ │(+)│V │V │(+)│V │

│Индол │- │- │- │- │+ │- │+ │- │+ │- │+ │- │+ │- │+ │

└─────────────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┘

Обозначения: + ферментация в первые сутки

(+) поздняя ферментация

— отсутствие ферментации

V вариабильные результаты

(+ и -) варианты.

Таблица 7

СХЕМА БИОХИМИЧЕСКОГО ТИПИРОВАНИЯ ШИГЕЛЛ ЗОННЕ ПО РАМНОЗЕ,

КСИЛОЗЕ И МАЛЬТОЗЕ (СОЛОДОВНИКОВ Ю.П. С СОАВТ., 1971)

┌─────────────────────────┬───────────────────────────────────────────────┐

│ Биохимический тип │ Сроки ферментации (в сутках) │

│ ├───────────────┬───────────────┬───────────────┤

│ │ рамноза │ ксилоза │ мальтоза │

├─────────────────────────┼───────────────┼───────────────┼───────────────┤

│Ia │+ (1) │- │+ (1 — 2) │

│Ib │+ (1) │- │+ (> 2) │

│IIg │+ (> 2) │- │+ (1 — 2) │

│IIe │+ (> 1) │- │+ (> 2) │

│IIId │+ (1) │+ (1) │+ (1 — 2) │

│IIIc │+ (1) │+ (1) │+ (> 2) │

│IVf │+ (1) │+ (2 и позже) │+ (1 и позже) │

└─────────────────────────┴───────────────┴───────────────┴───────────────┘

Обозначения: + ферментация (в скобках указаны сроки ферментации);

— отсутствие ферментации.

Биохимическое типирование шигелл Зонне в нашей стране проводят по схеме, предложенной Э.М. Новгородской, основанной на ферментации рамнозы и ксилозы.

Однако она позволяет подразделить шигеллы Зонне только на 4 типа, обозначенных римскими цифрами I, II, III, IV.

Ю.П. Солодовников с соавторами (1971) предложили иную модификацию схемы типирования шигелл Зонне с использованием ксилозы, рамнозы и мальтозы, которая позволяет подразделить их на 7 биохимических типов. Преимущество этой схемы в том, что в подавляющем большинстве случаев для установления биохимического типа бактерий достаточно наблюдения в течение 2 суток. Для обозначения отдельных биохимических типов используют два вида знаков: римские цифры I, II, III, IV (соответствуют обозначениям, предложенным Э.М. Новгородской) и латинские буквы a, b, c, g, e, d, f (соответствуют обозначениям биохимических типов, принятых за рубежом).

В связи с тем, что на отдельных территориях отмечается резкое преобладание одного или двух ферментативных типов, этот метод не всегда может быть использован как самостоятельный при идентификации культур во время эпидемиологического расследования групповых заболеваний и вспышек. В этом случае необходимо проводить колицинотипирование (по чувствительности к колицину) и колициногенотипирование (по способности продуцировать колицины) выделенных культур дизентерийных палочек.

Способность продуцировать колицины или белковые вещества, неоднородные по биологическим и физико-химическим свойствам, и типы различных колицинов является стойким наследственным фактором, который определяют в микробной клетке по наличию специальных генетических элементов — колициногенных факторов.

Чувствительность к колицинам зависит от наличия на поверхности бактериальной клетки рецепторов, на которых происходит адсорбция колицинов; свойство это специфично, т.к. адсорбция различных колицинов происходит на определенных рецепторах. В зависимости от спектра действия на чувствительные бактерии и физико-химические свойства все известные в настоящее время колицины разделены на 24 типа: A; B1; B2; C; D; E1; E2; E3; E4; G; H; I; K; L; M; N; O; P; X; V1; V2; V3; V4; V5.

Широкое распространение явления колициногении и возможность использования этого феномена для внутривидового типирования и более тонкой дифференциации по биологическим свойствам патогенных представителей семейства кишечных нашло применение в практической микробиологии.

Наиболее часто отмечается явление колициногении среди шигелл Зонне (60 — 95% выделенных штаммов). Подразделение бактерий по колициногенным свойствам носит название «колициногенотипирование» и выявляется методом отсроченного антагонизма с помощью специально подобранных индикаторных культур. В процессе роста колициногенного штамма колицин диффундирует в окружающую среду, где может быть выявлен с помощью индикаторных культур, чувствительных или устойчивых к определенным колицинам.

В настоящей инструкции приводится два метода типирования шигелл на основе феномена колициногении:

1. Модифицированный метод колициногенотипирования шигелл Зонне по Абботту и Шеннону;

2. Колицинотипирование по чувствительности к колицинам по методу Фредерика (типирование неколициногенных вариантов шигелл Зонне и прочих видов дизентерийных возбудителей).

Метод колициногенотипирования шигелл Зонне по Абботту и Шеннону основан на определении с помощью индикаторных культур типа колицина, продуцируемого исследуемыми штаммами шигелл Зонне. Набор индикаторных культур (таблица состоит из 15 штаммов; из которых — 13 шигеллы Зонне, 1 — Sh. dysenteriae 2, Штуцер — Шмитца и 1 — вариант E. coli. K-12 ROW.

Таблица 8

ИНДИКАТОРНЫЕ ШТАММЫ

┌───┬─────────────────────────────────────────────────┬───────────────────┐

│ N │ Наименование оригинального штамма │ Регистрационный │

│п/п│ │ номер │

├───┼─────────────────────────────────────────────────┼───────────────────┤

│1. │Sh. sonnei 2 │100031 │

│2. │-«- 56 │100032 │

│3. │-«- <…> │100033 │

│4. │-«- 2М │100034 │

│5. │-«- 38 │100035 │

│6. │-«- 56/56 │100036 │

│7. │-«- 56/98 │100037 │

│8. │-«- R │100038 │

│ │ 1 │ │

│9. │-«- R │100039 │

│ │ 6 │ │

│10.│Sh. dysenteriae 2M19 │N ctc 8218 │

│11.│Sh. sonnei 2/7 │100040 │

│12.│-«- 2/64 │100041 │

│13.│-«- 2/15 │100042 │

│14.│-«- R │100043 │

│ │ 5 │ │

│15.│E. coli ROW K-12 │100044 │

└───┴─────────────────────────────────────────────────┴───────────────────┘

В таблице даны наименования штаммов и регистрационные номера в соответствии с перечнем Международного справочного центра по шигеллам в Лондоне, откуда получен данный набор.

При типировании можно обозначать индикаторные штаммы не по наименованию оригинального штамма, а по последним цифрам регистрационного номера. Так как часть индикаторных культур обладает идентичной чувствительностью (N 36 и 37; 38 и 42, 40 <…>) культур 34 и 35 не отличается стабильностью, достаточно использовать 10 индикаторных культур N 31, 32, 33, 36, 38, 39, 8218, 40, 43 и 44. Индикаторные культуры N 37, 42 и 41 сохраняют и используют для замены, в случае необходимости, штаммов N 36, 38 и 40.

С помощью индикаторных культур (как полного, так и сокращенного набора) удается подразделить шигеллы Зонне на 17 условных колициногенотипов и неколициногенный (обозначаемый часто как «O» тип). Типы стабильны как in vivo (в очаге или при повторном высеве от одного больного высевается 1 тип), так и in vitro при хранении в лабораторных условиях на среде Дорсэ сроком до 2-х лет и более.

Для периодической проверки стабильности индикаторных культур в набор входит 15 эталонных культур, принадлежащих к определенным условным колициногенотипам (таблица 9). Сокращенная схема типирования по колициногенности представлена в таблице 10.

Таблица 9

ЭТАЛОННЫЕ ТИПОВЫЕ КОЛИЦИНОГЕННЫЕ ШТАММЫ

┌──────────────────────────────┬─────────────────────┬────────────────────┐

│ Наименование штаммов │Регистрационный номер│Колициногенный номер│

├──────────────────────────────┼─────────────────────┼────────────────────┤

│1. Sh. sonnei │100045 │1a │

│2. -«- │100046 │1b │

│3. -«- │100047 │2 │

│4. -«- │100034 │3 │

│5. -«- │100048 │3a │

│6. -«- │100049 │4 │

│7. -«- │100050 │5 │

│8. -«- │100051 │6 │

│9. -«- │100052 │7 │

│10. -«- │100053 │8 │

│11. -«- │100054 │9 │

│12. -«- │100055 │10 │

│13. -«- │100056 │11 │

│14. -«- │100057 │12 │

│15. -«- │100058 │13 │

└──────────────────────────────┴─────────────────────┴────────────────────┘

Индикаторные и эталонные культуры необходимо хранить на среде Дорсэ при комнатной температуре под резиновыми или корковыми пробками для предотвращения высыхания среды. Пересевы эталонных культур можно делать через 3 — 4 месяца, а индикаторных через 30 — 35 дней со среды Дорсэ на среду Дорсэ без пассажа на жидких средах.

Таблица 10

СОКРАЩЕННАЯ СХЕМА КОЛИЦИНОГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШИГЕЛЛ ЗОННЕ

┌───────────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│ Колициногенотипы │ Индикаторные культуры │

│ ├────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┤

│ │ 31 │ 32 │ 33 │ 36 │ 38 │ 39 │8218│ 40 │ 43 │ 44 │

├───────────────────────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┤

│1a │+ │+ │+ │+ │- │- │+ │- │- │+ │

│1b │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │- │- │+ │

│2 │- │+ │+ │- │- │+ │- │- │- │+ │

│3 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│3a │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │

│4 │+ │+ │+ │- │+ │+ │- │+ │- │+ │

│5 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │

│6 │- │+ │- │+ │- │+ │- │- │- │+ │

│7 │- │- │+ │- │- │- │- │- │- │- │

│8 │+ │- │+ │- │+ │- │- │- │- │+ │

│9 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │- │+ │

│10 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │+ │

│11 │- │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │

│12 │+ │+ │- │+ │+ │+ │- │- │- │+ │

│13 │- │+ │+ │+ │- │+ │- │- │- │+ │

│14 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │- │+ │

│15 │+ │- │+ │- │+ │- │- │+ │+ │+ │

│»O» (не колициногенный)│- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │

└───────────────────────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┘

Обозначения: + наличие зоны торможения роста индикаторного штамма;

— отсутствие зоны торможения роста индикаторного штамма.

Для колициногенотипирования наряду с 1,5% питательным агаром на гидролизате Хоттингера, содержащего 130 — 150 мг% азота и pH — 7,4, можно использовать сухой питательный агар «Д» производства Дагестанского института питательных сред, который необходимо предварительно проверить на стабильность колицинопродукции эталонных культур и чувствительность индикаторных и для работы отобрать серию агара, результаты типирования на которой соответствуют схеме. Агар Хоттингера в такой проверке не нуждается.

Агар Хоттингера или агар «Д» заготавливают небольшими партиями в плотно закупоренных флаконах (предохранение от высыхания и изменения плотности агара).

Накануне постановки опыта агар во флаконах растапливают на водяной бане, добавляя на 100 мл среды 2 — 4 капли 0,1% спиртового раствора генцианвиолета, разливают по 20 мл в чашки Петри. Раствор генцианвиолета добавляется для подавления роста сапрофитной воздушной флоры и стабилизации колицинопродукции.

В день опыта чашки со средой слегка (20 — 30 минут) подсушивают в термостате при температуре 37°.

Колициногенотипирование проводят методом перекрестных посевов.

Первый день (подготовительный)

Приготавливают чашки Петри с питательным агаром в количестве, равном исследуемым культурам. Испытуемые культуры засевают в пробирки с мясопептонным бульоном и инкубируют при 37° 18 — 20 часов.

Второй день

На подсушенные чашки наносят бактериологической петлей 18-часовые бульонные культуры штрихом по диаметру (по одной культуре на чашку) (рис. 1). Посевы инкубируют при 37° в течение 48 часов.

Рис. 1. Рост первичного посева испытуемой культуры

Третий день

Индикаторные культуры со среды Дорсэ пересевают на мясопептонный бульон и помещают в термостат (37°) на 18 — 20 часов.

Четвертый день

Выросшие на чашках с агаром в виде штриха 48-часовые испытуемые культуры обрабатывают в парах хлороформа, для чего в крышку опрокинутой вверх дном чашки наливают около 0,5 мл хлороформа, закрывают чашки и оставляют при комнатной температуре на 50 — 60 минут. Если по истечении этого срока на крышке остаются следы хлороформа, чашки открывают и проветривают 20 — 30 минут.

Индикаторные бульонные культуры наносят перпендикулярно первичному штриху, не касаясь его, по 5 индикаторных культур с каждой стороны или все 10 с одной (рис. 2).

Рис. 2. Угнетение роста индикаторных культур

шигеллой Зонне 6 колициногенотипа

Индикаторные культуры засевают в строгой последовательности и нумеруют только первый индикаторный штамм. После посева чашки инкубируют при 37° еще в течение 18 — 20 часов.

Пятый день

Производят учет результатов.

Если исследуемая культура не колициногенна, рост всех индикаторных культур будет непрерывным по всей длине. Если испытуемые культуры обладают колициногенностью, то наблюдается торможение роста чувствительных к продуцируемому колицину индикаторных культур. Как правило, рост индикаторных штаммов прерывается в 3 — 6 мм до штриха испытуемой культуры. Величина зоны ингибации (торможения) зависит от следующих причин:

1) концентрации колицина в агаре.

Длительное хранение культур на простых средах временно угнетает продукцию колицина;

2) скорости диффузии в плотную питательную среду. Скорость диффузии зависит как от типа колицина, так и от плотности питательного агара (не хранить готовые среды во флаконах более 2-х недель и всегда пользоваться средой с одной и той же концентрацией);

3) времени роста первичной полоски испытуемой культуры. Наилучший срок инкубации 48 часов, но если в экстренных случаях он сокращается до 24 часов, зона угнетения роста может быть выражена в пределах 1,5 — 2 мм, что при отсутствии должного опыта затруднит учет результатов. Увеличение инкубации свыше 48 часов также нежелательно, т.к. может в связи с истощением среды и изменением влажности появиться неспецифическое угнетение роста большинства индикаторных культур. В тех случаях, когда по каким-либо техническим причинам через 48 часов инкубации испытуемой культуры опыт не может быть продолжен, нужно как обычно простерилизовать чашки парами хлороформа, а затем поставить их в холодильник. Хранить такие чашки до нанесения индикаторных штаммов без ущерба для типирования можно 2 — 3 суток;

4) снижение спектра чувствительности отдельных индикаторных культур. Необходимо проводить контроль стабильности индикаторных культур не реже одного раза в месяц или, по крайней мере, после каждого пересева со среды Дорсэ на среду Дорсэ. Использовать бульонные культуры только для типирования и однократно (т.е. нельзя оставлять на 1 — 2 дня для последующих опытов). Для типирования пересевать культуры только со среды Дорсэ.

Учет результатов проводить согласно прилагаемой схеме (табл. 10). В тех случаях, если установленный тип не совпадает с одним из известных типов, необходимо рассеять культуру на среде Эндо (проверить на чистоту) и протипировать несколько изолированных колоний, а также проверить на стабильность индикаторные штаммы. При получении после этого аналогичных результатов с субкультурами исследуемого штамма такие культуры обозначаются как «нетипируемые». В связи с тем, что не исключена возможность обнаружения новых колициногенотипов, такие культуры необходимо пересылать в Регионарные центры по шигеллам.

При достаточном опыте и хороших технических навыках можно производить посевы 2-х полосок испытуемых культур на одну чашку с расстоянием между ними около 3 см. Индикаторные культуры заносят параллельно штрихами между испытуемыми (рис. 3).

Рис. 3. Типирование 2 исследуемых культур на 1 чашке.

Угнетение индикаторных культур шигеллой Зонне 12

колициногенотипа (a) и шигеллой Зонне 8 колициногенотипа (b)

Учет проводят по обычной схеме.

Форма регистрации результатов в рабочем журнале приводится ниже (таблица 11).

Таблица 11

ФОРМА РАБОЧЕГО ЖУРНАЛА

ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ КОЛИЦИНОГЕНОТИПИРОВАНИЯ

ШИГЕЛЛ ЗОННЕ ПО МЕТОДУ АББОТТА И ШЕННОНА

┌───────────────┬─────────────────────────────────────────────────┬───────┐

│ N │ Индикаторные штаммы │ Тип │

│ испытуемых ├────┬────┬────┬───┬────┬────┬─────┬────┬────┬────┤ │

│ культур │ 31 │ 32 │ 33 │36 │ 38 │ 39 │8218 │ 40 │ 43 │ 44 │ │

├───────────────┼────┼────┼────┼───┼────┼────┼─────┼────┼────┼────┼───────┤

│18 │- │- │+ │- │- │- │- │- │- │- │7 │

│271 │- │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │1 │

│350 │+ │- │+ │- │+ │- │- │- │- │+ │8 │

│367 │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │0 │

└───────────────┴────┴────┴────┴───┴────┴────┴─────┴────┴────┴────┴───────┘

Определение типа продуцируемого колицина по методу Абботта и Шеннона позволяет протипировать до 90 — 95% штаммов шигелл Зонне. Среди прочих видов возбудителей дизентерии феномен колициногении встречается гораздо реже, например, шигеллы вида Флекснера колициногенны:

подвид Флекснера 0,5 — 1,0%;

подвид Ньюкасл 20,0 — 25,0%;

подвид Бойда 40,0 — 50,0%.

В связи с этим особое значение приобретает метод определения чувствительности исследуемых неколициногенных культур к определенным колицинам, продуцируемым эталонными культурами из коллекции Фредерика, т.е. колицинотипирования.

Чувствительность шигелл к колицинам специфична и зависит от наличия на поверхности бактериальной клетки рецепторов для фиксации колицинов. Отдельным колицинам или группе их (например, колицинам группы E) соответствуют определенные рецепторы. Кроме того, на чувствительность бактерий влияют устойчивость к колицинам и иммунитет к действию колицина, идентичного продуцируемому самой клеткой. Колициночувствительность определяется у 90 — 95% шигелл независимо от видовой принадлежности, но этот признак не является таким стабильным, как способность продуцировать колицины. Изменение спектра колициночувствительности чаще отмечается среди культур, склонных к диссоциации (шигеллы Зонне). В связи с этим необходимо типировать свежевыделенные культуры, не оставляя их на длительное хранение.

Культуры из очага или от одного больного исследуются одновременно.

Определение чувствительности проводится на 15 эталонных культурах, продуцирующих определенные колицины (таблица 12).

Таблица 12

ПАСПОРТНЫЕ ДАННЫЕ ЭТАЛОННЫХ КОЛИЦИНОГЕННЫХ

ШТАММОВ ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ФРЕДЕРИКА

┌───┬─────────────────────────────────────────┬───────────────────────────┐

│ N │ Наименование штамма │Тип продуцируемого колицина│

│п/п│ │ │

├───┼─────────────────────────────────────────┼───────────────────────────┤

│1. │E. coli Ca-7 │V + m │

│2. │E. coli Ca-18 │B │

│3. │E. coli Ca-23 │D │

│4. │E. freundi Ca-31 │A │

│5. │E. coli Ca-38 │E + l │

│6. │E. coli Ca-42 │F │

│7. │E. coli Ca-63 │I │

│8. │E. coli Ca-68 │H │

│9. │E. coli Ca-62 │j + l │

│10.│E. coli K-235 │K │

│11.│Sh. boydii P │S │

│ │ 1 │ 1 │

│12.│Sli. sonnei P │S + l │

│ │ 9 │ 3 │

│13.│Sh. dispar P │S │

│ │ 14 │ 5 │

│14.│Sh. dispar P <*> │S │

│ │ 15 │ 4 │

│15.│E. coli Ca-46 │G │

└───┴─────────────────────────────────────────┴───────────────────────────┘

———————————

<*> Культуры Sh. dispar P на питательных средах при хранении образуют

15

пигмент желтоватого цвета, интенсивность которого увеличивается до

ярко-апельсинового цвета.

При получении коллекции эталонных культур Фредерика необходимо раз 5 — 6 пропассировать их через обычный мясопептонный бульон, после чего определить биохимическую характеристику и биологическое (угнетающее) действие на универсальных колициночувствительных индикаторных культурах — E. coli K-12 ROW (ее субкультурой является индикатор 100044 набора Абботта и Шеннона), E. coli фи и E. coli B. Чувствительность этих индикаторных культур приведена в таблице 13. Очередную проверку эталонных E. coli проводят не реже 1 раза в 2 — 3 месяца.

Таблица 13

ПАСПОРТНЫЕ ДАННЫЕ ИНДИКАТОРНЫХ КУЛЬТУР

ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ФРЕДЕРИКА

┌───┬─────────────────────────┬───────────────────────────────────────────┐

│ N │ Наименование штамма │ Примечания │

│п/п│ │ │

├───┼─────────────────────────┼───────────────────────────────────────────┤

│1. │E. coli K-12, ROW │Чувствителен ко всем колицинам коллекции │

│ │ │Фредерика │

│2. │E. coli фи │Не чувствителен к S и S │

│ │ │ 1 4 │

│3. │E. coli B │Не чувствителен к колицинам F , S , S и S │

│ │ │ 3 1 4 5│

└───┴─────────────────────────┴───────────────────────────────────────────┘

Колицинотипирование, как и колициногенотипирование, основано на использовании феномена отсроченного антагонизма, выявляемого либо методом перекрестных посевов, описанным в разделе «колициногенотипирование» с той только разницей, что первоначально полоской наносят известную эталонную колициногенную культуру, а через 48 часов параллельными штрихами перпендикулярно эталонной подсевают 18-часовые бульонные испытуемые культуры, либо методом агаровых слоев, описание которого приводим.

Первый день

Эталонные культуры из коллекции Фредерика пересевают на мясопептонный бульон и помещают в термостат на 18 — 20 часов при 37 °C.

Агар Хоттингера с добавлением генцианвиолета, как указано выше в разделе «колициногенотипирование», разливают в чашки Петри, количество которых превышает число исследуемых культур в два раза.

Второй день

Маркируют чашки с агаром для посева эталонных культур. На первой чашке

для 8 культур, на 2-й — для 7 культур. Надписывают на каждой чашке только

одну культуру, от которой стрелкой указывают направление и порядок посева,

а по периметру чашки ставят точки, соответствующие количеству и месту

посева следующих культур (рис. 4). 1) Ca — 7, Ca 18, также Ca 23, Ca 31, Ca

38, Ca 42, Ca 46, Ca 53. 2) Ca 58, Ca 62, K — 2351, P , P , P , P .

1 2 14 15

Наносить все 15 культур на одну чашку не рекомендуется, т.к. шигеллы Зонне

обладают множественной чувствительностью к колицинам и учет результата

опыта будет затруднен. Эталонные 18-часовые бульонные культуры наносят

уколом в агар соответственно маркировке чашки, и посевы инкубируют при 37°

48 часов.

Рис. 4. Чашки подготовлены к посеву индикаторных культур

Третий день

Изучаемые культуры засевают в мясопептонный бульон и выдерживают при 37° в течение 18 — 20 часов.

Четвертый день

Чашки с посевами эталонных культур, выросших в виде макроколоний-бляшек, вынимают из термостата. Посевы обрабатывают по обычной методике 1 — 1,5 часа в парах хлороформа.

К расплавленному и остуженному до 45° 0,2% агару (по 5 — 6 мл в пробирке) добавляют 4 — 5 капель бульонной изучаемой культуры и выливают по 2,5 — 3 мл в каждую из 2-х чашек с макроколониями эталонных культур. Чашки инкубируют 18 — 20 часов при 37°.

Пятый день

Учет результатов типирования проводят по зонам угнетения роста изучаемых культур. Вокруг макроколоний (рис. 5) размер зоны определяют миллиметровкой от края колонии до начала роста изучаемой культуры. Зоны, размер которых менее 1,5 — 2 мм, не учитывают, т.к. при повторных типированиях изучаемой культуры чувствительность к данному колицину может полностью отсутствовать. Задержку роста отмечают плюсами: зона 2 — 4 мм ++, зона 5 — 10 мм +++, зона свыше 10 мм ++++.

Рис. 5. Спектр чувствительности испытуемой культуры

V , B , B + J, K , S , S + l

2 1 1 5 3

Результаты типирования заносят в регистрационный журнал в виде спектра чувствительности к эталонным колицинам (таблица 14).

Таблица 14

СХЕМА РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЦИНОТИПИРОВАНИЯ

КУЛЬТУР В РАБОЧЕМ ЖУРНАЛЕ

┌───────────┬────────────────────────────────────┬────────────────────────┐

│ N культур │ Наименование культур │ Чувствительность │

├───────────┼────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│112 │Sh. sonnei │B, D, F, S │

│ │ │ 5 │

│118 │Sh. sonnei │B, F, E + J, K │

└───────────┴────────────────────────────────────┴────────────────────────┘

Окончательный ответ только об этиологии заболеваний, который выдается на 4-й день анализа, но и об источнике инфекции, путях ее передачи, может быть дан только после сопоставления эпидемиологических и клинических данных с результатами подробного, всестороннего и тщательного изучения биологических свойств всех выделенных в очаге культур от больных, из продуктов питания, смывов с объектов внешней среды, трупного материала и т.д., их идентичности по биохимическому типу, колициногенности и спектру чувствительности к эталонным колицинам.

БАКТЕРИИ РОДА ЭШЕРЕХИЯ

Общие сведения

Возникновение пищевого отравления, вызванного эшерихиями, обычно связано с массивным инфицированием продуктов этими бактериями. В доброкачественных пищевых продуктах могут обнаруживаться эшерихии в небольших количествах (допустимый коли-титр регламентируется соответствующими ГОСТ и РТУ). Поэтому при исследовании на эшерихии подозреваемых продуктов приобретает особое значение количественное определение степени обсемененности их этими бактериями.

В случае выделения штаммов эшерихий, подозрительных как возбудители данного заболевания, с целью подтверждения диагноза исследуют в динамике кровь пострадавших на наличие агглютининов к гомокультуре. (Технику постановки реакции смотри выше.)

Возбудителями заболеваний могут быть как эшерихии известных энтеропатогенных разновидностей, так и эшерихии других серологических групп, антигенное строение которых не может быть расшифровано в условиях СЭС из-за отсутствия необходимых диагностических сывороток. В связи с этим необходимо установить идентичность культур по ферментативным свойствам, выделенных из разных материалов (пищевые продукты, рвотные массы, промывные воды и т.д.), и если расшифровка их антигенной структуры не представляется возможной, то такие штаммы следует направить для идентификации в опорные базы Всесоюзного центра по эшерихиям.

Род эшерихия объединяет грамотрицательные палочки, не образующие спор, подвижные и неподвижные, растущие на простых питательных средах, не образующие цитохромоксидазу, не утилизирующие цитрат, не образующие ацетилметилкарбинол, не разлагающие мочевину, не разжижающие желатин, восстанавливающие нитраты, не образующие сероводород, образующие индол, ферментирующие лактозу (некоторые разновидности ферментируют лактозу в поздние сроки или не ферментируют ее) и глюкозу. На среде с цианистым калием эшерихии не растут. По отношению к другим углеводам и многоатомным спиртам эшерихии ведут себя различно (табл. 1), образуя большое число биохимических типов.

Таблица 1

ФЕРМЕНТАЦИЯ УГЛЕВОДОВ И МНОГОАТОМНЫХ СПИРТОВ

В практике для установления принадлежности бактерий к роду эшерихий обычно бывает достаточно постановки ограниченного числа тестов (табл. 2).

Таблица 2

ОГРАНИЧЕННЫЙ НАБОР БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ,

ПОЗВОЛЯЮЩИХ ОПРЕДЕЛИТЬ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ

ВЫДЕЛЕННОГО ШТАММА К РОДУ ЭШЕРИХИЙ

Примечание. Неподвижные штаммы шестого биохимического варианта требуют дополнительной дифференциации с шигеллами.

Дифференциально-диагностическая схема эшерихий построена на основе антигенной структуры этих бактерий. Диагностическое значение имеют три комплекса антигенов: соматический O-антиген, соматический K-антиген (маскирующий проявление агглютинабильности живых бактерий в O-сыворотке) и жгутиковый H-антиген.

К настоящему времени у эшерихий известно 156 основных разновидностей O-антигена, 94 разновидностей K-антигена и 50 разновидностей H-антигена. O-антиген термостабилен, H-антиген — термолабилен. K-антиген по чувствительности к прогреванию подразделяется на 3 типа: A, B и L.

L- и B-антигены термолабильны. Прогревание при 100° в течение 1 часа приводит к полной инактивации L-антигена, и бактерии, содержащие такой антиген, хорошо агглютинируются O-сывороткой, не агглютинируются соответствующей L-сывороткой и не способны связывать L-антитела. Аналогичная обработка эшерихий, имеющих B-антиген, также делает бактерии агглютинабильными в O-сыворотке, но не лишает способности связывать соответствующие B-антитела и в отдельных случаях агглютинироваться В-сывороткой.

A-антиген термостабилен. Агглютинабильность бактерий, обладающих A-антигеном, в O-сыворотке достигается только лишь после прогревания их при 120° в течение 2,5 часа.

Этиологической причиной пищевых токсикоинфекций из числа эшерихий обычно бывают разновидности, являющиеся возбудителями кишечной коли-инфекции. Их антигенное строение представлено в таблице 3.

Таблица 3

АНТИГЕННОЕ СТРОЕНИЕ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ЭШЕРИХИЙ

┌─────────────────┬─────────────────┬─────────────────────────────────────────┐

│ O-антиген │ K-антиген │ H-атигены, встречающиеся у эшерихий │

│ │ │ данной OK-группы │

├─────────────────┼─────────────────┼─────────────────────────────────────────┤

│18a, 18c │77(B21) │1, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 16, 26, 32, НП │

│20a, 20v │84(B) │3, 26, 34, НП │

│25a, 25v │11(L) │6, 12, НП │

│26 │60(B6) │2, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 16, 18, 27, │

│ │ │30, 32, 33, 46, НП │

│44 │74(L) │12, 18, 34, НП │

│55 │59(B5) │1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 19, 21, 25,│

│ │ │27, 32, 33, 34, 39, НП │

│66a │61(B7) │2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 21, 26, │

│ │ │27, 34, 47, НП │

│66a │62(L) │2 │

│111a, 111v │58(B4) │2, 4, 6, 7, 11, 12, 16, 20, 21, 25, 27, │

│ │ │30, 32, 34, 40, «635», НП │

│111a, 111c │58(B4) │4, НП │

│119 │69(B14) │1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 18, 27, 32, │

│ │ │39, 40, НП │

│124 │72(B17) │16, 19, 30, 32, 36, НП │

│125a, 125v │70(B15) │19, 21, 40, НП │

│125a, 125c │70(B15) │2, 6, 11, 12, 15, 21, 25, 30 │

│126 │71(B16) │2, 5, 7, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 27, 29, │

│ │ │30, 33, 34, 45, НП │

│127a │63(B8) │1, 4, 5, 6, 9, 11, 19, 21, 26, 27, 33, │

│ │ │40, НП │

│128a, 128v │67(B12) │2, 6, 7, 8, 9, 12, 27, 35 │

│128a, 128c │67(B12) │7, 8, 10, 11, 12, 16, НП │

│128a, 128d │67(B12) │12 │

└─────────────────┴─────────────────┴─────────────────────────────────────────┘

Примечание: 1. НП — неподвижные.

2. Помимо перечисленных в таблице эшерихий, в Советском Союзе описаны эшерихии с условным обозначением «9» и «408», являющиеся возбудителями кишечной коли-инфекции.

Кроме перечисленных в таблице разновидностей, в разных странах отдельными исследователями описаны в качестве возбудителей острых кишечных заболеваний эшерихии других серологических групп. К их числу относятся эшерихии O-групп: 04, 06, 08, 022, 027, 028, 042, 073, 075, 086a, 086v:K64 (В9); 091, 0112, 0114, 0127a, 0127v:K65 (В10); 0136, 0142, 0143, «561» — 015 K62(L), «10244» — 0117:K62(L). «21706» — 077:K62(L), 197, 56 — Крым и др.

Серологическая идентификация эшерихий проводится при помощи OK-сывороток. В отдельных случаях обязательно, а в остальных желательно применение O-сывороток <*>.

———————————

<*> До последнего времени O-антиген эшерихий определяли в практических лабораториях при помощи OK-сывороток. Однако современные данные свидетельствуют о том, что некоторые B-антигены не утрачивают агглютинабельности после прогрева бактерий, что может симулировать O-агглютинацию в соответствующей OK-сыворотке.

В соответствии с приказом МЗ СССР от 7 августа 1967 г. Московский ВНИИВС им. Мечникова начал производить диагностические агглютинирующие O-сыворотки к энтеропатогенным разновидностям эшерихий.

Для определения H-антигена используют H-коли-сыворотки.

Бактериологические исследования

Первый день

Первичный посев исследуемого материала производят по 0,1 мл из 10-кратных разведений в 0,1% пептонной воде на чашки Петри со средой Эндо и хорошо втирают досуха в поверхность агара. Жидкие материалы засевают без разведения. При исследовании испражнений делают дополнительный высев на среду Плоскирева. Посевы инкубируют 18 — 24 часа при 37°. Производят посев исследуемого материала по методике, обычно принятой при санитарно-бактериологическом контроле, из соответствующих разведений продуктов в среду Кесслер для определения коли-титра (бродильная проба). Посевы инкубируют 24 часа при 37°.

Второй день

Учет результатов роста бактерий на засеянных накануне чашках со средой Эндо и средой Плоскирева.

При наличии роста бактерий на среде Эндо производят их учет следующим

образом: 1) подсчет выросших колоний с пересчетом их числа на 1 г/мл

исследуемого материала, общепринятым способом; 2) подсчет числа выросших

колоний для вычисления коли-титра. Для этого сосчитывают колонии на тех

чашках, где выросло их менее 100. Объем засеянного материала умножают на

разведение, из которого сделан высев на соответствующую чашку, и делят на

число выросших колоний эшерихий. Например, на чашке, на которую высеяно 0,1

-2

мл, из разведения 10 выросло 100 колоний эшерихий. Коли-титр будет равен:

-2

0,1 x 10

———- x 0,00001 мл.

100

На самом деле коли-титр может быть несколько ниже, т.к. при посеве на чашки часть клеток остается на шпателе, которым растирают засеваемый материал;

3) выбор колоний и их пересев петлей: а) на поверхность скошенного агара; б) на поверхность скошенного трехсахарного агара с солью Мора или агара Клиглера, а также уколом в столбик у дна пробирки. Посевы инкубируют 18 — 24 часа при 37°.

Выбор колоний для исследования со среды Эндо производят после тщательного просмотра морфологии и окраски колоний. При наличии только однотипных колоний для дальнейшего исследования намечают 10 колоний. При обнаружении 2-х, 3-х и более видов колоний намечают 3 — 5 колоний для каждого вида. Следует для дальнейшего изучения намечать не только лактозоположительные (розовые, красные с металлическим блеском или без металлического блеска), но и лактозоотрицательные колонии.

На чашках со средой Плоскирева намечают только слаборозовые и бесцветные колонии, похожие на колонии шигелл, т.к. некоторые эшерихии, вызывающие дизентериеподобные заболевания, замедленно сбраживают лактозу, а рост их на среде Плоскирева не подавляется;

4) если на второй день исследования на среде Эндо отсутствует рост подозрительных на эшерихии колоний или обнаруживаются единичные колонии при посеве неразведенного материала, производят пересев петлей на среду Эндо из пробирок с первичными посевами на среде Кесслер.

Третий день

1) Учет результата посева на среду Кесслер — бродильная проба — производят по общепринятой методике.

2) При наличии роста бактерий на среде Эндо из посевов со среды Кесслер дальнейшую работу проводят так, как описано в отношении колоний, выросших на среде Эндо с первичным посевом материала.

Культуры, отсеянные в предыдущий день на трехсахарный агар (или агар Клиглера) и простой питательный агар, изучают следующим образом:

а) на трехсарном агаре или агаре Клиглера учитывают газообразование при ферментации глюкозы и продукцию сероводорода. Появление черного окрашивания на дне пробирки свидетельствует о продукции сероводорода, разрывов в столбике агара о газообразовании при ферментации глюкозы.

Дальнейшему исследованию подвергают выросшие на простом питательном агаре культуры штаммов, не продуцирующие сероводорода;

б) готовят окрашенные по Граму мазки бактерий и микроскопируют;

в) пересевают культуры грамотрицательных палочек на полужидкий (0,3%) питательный агар для определения подвижности и на дифференциальные среды для определения способности бактерий ферментировать 10% лактозу, расщеплять мочевину (среда с мочевиной по Преусу), образовывать индол (среда Хоттингера), утилизировать цитраты (среда Симмонса);

г) культуры грамотрицательных палочек со скошенного агара испытывают в реакции агглютинации на стекле с поливалентными диагностическими OK-коли-сыворотками; в случае положительного результата с одной из сывороток исследование в реакции агглютинации на стекле продолжают с моновалентными (типовыми) OK-коли-сыворотками, соответствующими той поливалентной, которая вызывает агглютинацию бактерий;

д) штаммы, агглютинировавшиеся на стекле какой-либо из моновалентных OK-коли-сывороток, изучают в линейной пробирочной реакции агглютинации.

В этой реакции исследуют живые и прогретые на водяной бане 1 час при 100° культуры с моновалентной OK-сывороткой, агглютинировавшей бактерии на стекле, а также с соответствующей O-сывороткой (обязательно в случае подозрения на принадлежность бактерий к серогруппе 020:K84 или 026:B6);

е) первый предварительный ответ может быть выдан на третий день после получения результатов реакции агглютинации бактерий на стекле с моновалентными OK-сыворотками.

В случае положительной реакции агглютинации с одной из моновалентных сывороток ответ формулируют следующим образом: «В ________ (указать материал исследования) обнаружены бактерии, подозрительные как энтеропатогенные эшерихии ________ (указать OK-группу, например, 055:B5 или 026:B6 и т.д.), исследование продолжается».

При отрицательных результатах агглютинации на стекле ответ формулируют: «В ______ (указать материал исследования) энтеропатогенных разновидностей эшерихий не обнаружено, исследование продолжается».

Четвертый день

1) Учитывают результаты определения подвижности бактерий и их способности ферментировать 10% лактозу, расщеплять мочевину, продуцировать индол, утилизировать цитраты. Определение расщепления мочевины производят на среде с мочевиной по Преусу, цвет которой изменяется в синий при выращивании бактерий, расщепляющих мочевину, или в желтый — при выращивании бактерий, не расщепляющих мочевину. Определение индолообразования производят на бульоне Хоттингера с индикаторной бумажкой, желтый цвет которой меняется в розовый в присутствии индола или с помощью реактива Эрлиха.

Учет результатов утилизации цитрата натрия проводят на среде Симмонса. Утилизирующие цитрат натрия бактерии хорошо растут на среде и изменяют ее цвет из оливкового в синий. При отрицательном результате окраска среды не меняется и отсутствует заметный рост бактерий. На основании этих тестов устанавливают принадлежность выделенных бактерий к роду эшерихий (табл. 2).

2) Учитывают и оценивают результаты реакции агглютинации в пробирках следующим образом:

а) крупнохлопчатый агглютинат, наблюдавшийся в OK-сыворотке до 1/2 или титра K-антител, и мелкозернистый агглютинат в O-сыворотке до 1/2 или титра O-антител расценивают как положительный результат, свидетельствующий о принадлежности выделенного штамма к соответствующей OK-группе энтеропатогенных эшерихий;

б) крупнохлопчатый агглютинат до 1/2 или титра K-антител в OK-сыворотке и отсутствие агглютинации в O-сыворотке или наличие агглютината в этой сыворотке лишь в разведениях ниже 1/2 титра. O-антител свидетельствует о наличии антигенной связи выделенного штамма с эшерихиями соответствующей OK-группы, но не о принадлежности к ней;

в) мелкозернистый агглютинат живой культуры, наблюдающийся в разведениях OK-сыворотки, превышающих титр K-антител, и мелкозернистый агглютинат прогретой культуры в O-сыворотке в высоких разведениях или до титра свидетельствует об общности или идентичности O-антигена выделенного штамма с O-антигеном соответствующей серогруппы энтеропатогенных эшерихий и отсутствии K-антигена. Такой штамм необходимо направить во Всесоюзный центр по эшерихиям для окончательной идентификации.

3) Для определения H-антигена используют метод, основанный на принципе иммобилизации в полужидком агаре подвижных бактерий в присутствии H-сыворотки, соответствующей их H-антигену. Для этого пересевают уколом с полужидкого агара подвижные штаммы эшерихий, отнесенные по результатам линейной реакции агглютинации к энтеропатогенным разновидностям, на ряд пробирок с полужидким 0,3% агаром, каждая из которых содержит одну из H-коли-сывороток, и инкубируют 18 — 24 часа при 22 — 27°.

В пробирке, в которой сыворотка соответствует H-антигену засеянного штамма, бактерии растут вдоль линии укола. В других пробирках, содержащих сыворотки, не соответствующие H-антигену исследуемого штамма, бактерии при выращивании свободно распространяются и вызывают диффузное помутнение всей среды.

H-антиген в антигенной формуле штамма обозначают по наименованию H-сыворотки, в присутствии которой произошла иммобилизация бактерий. Например, подвижный штамм эшерихий 055:B5 иммобилизовался в присутствии сыворотки H6. Его полная антигенная формула обозначается 055:B5:H6.

Приготовление диагностической среды (полужидкого агара, содержащего H-сыворотку) осуществляют с соблюдением всех предосторожностей сохранения стерильности среды.

Ампулу с сухой сывороткой вскрывают и растворяют таблетку изотоническим раствором поваренной соли. Содержимое ампулы смешивают с предварительно растопленным и охлажденным до 45 — 50° полужидким 0,3% питательным агаром. Далее, не допуская застывания среды, разливают ее в стерильные бактериологические пробирки по 2,5 мл. Для контроля стерильности пробирки с застывшей диагностической средой помещают в термостат на 48 часов при 37°.

4) Пересев эшерихий на среды Гисса с сахарозой, дульцитом, салицином, сорбитом, рафинозой и рамнозой с целью получения дополнительных ферментативных «меток» штамма. Эти исследования не проводят с неэнтеропатогенными разновидностями эшерихий, выделенными со среды Кесслер.

Пятый день

1) учет результатов определения H-антигена;

2) учет результатов роста бактерий на средах Гисса.

В окончательном ответе следует дать количество обнаруженных энтеропатогенных разновидностей эшерихий в 1 г/мл инкриминируемого продукта с указанием их антигенной формулы, результаты исследования выделений пострадавших и реакции агглютинации с кровью пострадавших на наличие агглютининов к гомокультуре в динамике.

БАКТЕРИИ РОДА ПРОТЕУС

Общие сведения

Согласно определению Международного Подкомитета по Enterobacteriaceae, группа Proteus — Providencia (гриба Proteae) представлена грамотрицательными, бескапсульными, в основном, подвижными бактериями, свойства которых соответствуют общей характеристике семейства Enterobacteriaceae. Они хорошо растут на обычных питательных средах, являются факультативными анаэробами, не образуют цитохромоксидазы, разлагают глюкозу, редуцируют нитраты в нитриты, утилизируют углеводы по ферментативному типу. Бактерии группы Proteus — Providencia не ферментируют лактозы, дульцита, не расщепляют малоната натрия, не обладают аргининдигидролазой и лизиндокарбоксилазой, обладают дезаминазой фенилаланина, растут на среде с цианистым калием.

Прочие ферментативные свойства являются основанием для разделения этой группы на четыре самостоятельных рода: Proteus, Morganella, Rettgerella, Providencia.

Биохимическая характеристика группы Proteus — Providencia представлена в таблице N 1.

Таблица 1

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ PROTEUS — PROVIDENCIA

┌───────────┬──────────────────┬──────────┬───────────┬───────────────────┐

│<…> / │ Proteus │Morganetia│Raflgerella│ Providencia │

│ /тесты├────────┬─────────┤ │ ├──────────┬────────┤

│ / или │vulgaris│mirabilis│ │ │alcallfa- │stuartis│

│ / среды │ │ │ │ │clens │ │

├───────────┼────────┼─────────┼──────────┼───────────┼──────────┼────────┤

│ │┌─┐ │┌─┐ │ │ │ │ │

│<…> ││+│ ││-│ │+ │+ │+ │+ │

│ │└─┘ │└─┘ │ │ │ │ │

│<…> — рот│+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│<…> │- │- или + │- │- │- │- │

│<…> │альфа │+ или (+)│- │+ │+ │+ │

│<…> │+ │+ │- │- │- │- │

│<…> │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│<…> │+ │+ │- │- │- │- │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│ │┌─┐ │┌─┐ │ │ │ │ │

│<…> ││-│ ││+│ │+ │- │- │- │

│ │└─┘ │└─┘ │ │ │ │ │

│<…> │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│<…> (газ)│+ или — │+ │альфа │альфа │+ или — │- │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│ │┌─┐ │┌─┐ │ │ │ │ │

│<…> ││+│ ││-│ │- │- │- │- │

│ │└─┘ │└─┘ │ │ │ │ │

│<…> │+ │альфа │- │альфа │альфа │альфа │

│<…> │- │- │- │+ │- │альфа │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│<…> │альфа │альфа │- │альфа │- │- │

│<…> │- │- │- │+ │+ │- │

│<…> │- │- │- │+ │- │+ │

│<…> │- │- │- │альфа │- │альфа │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│<…> │- │- │- │- │- │- │

│<…> │- │- │- │альфа │- │- │

│<…> │+ │+ │+ │+ │- │- │

│<…> │+ │+ │+ │альфа │альфа │альфа │

└───────────┴────────┴─────────┴──────────┴───────────┴──────────┴────────┘

Обозначения: + реакция положительная, наступает в течение 1 — 2

дней;

— реакция отрицательная;

(+) реакция регулярно положительная, но замедленная;

альфа различные биохимические типы;

┌─┐ дифференциальные признаки, отличающие Proteus

└─┘ vulgaris от Proteus mirabilis.

В этиологии пищевых токсикоинфекций ведущую роль играют бактерии рода Proteus. Заболевания могут возникнуть при употреблении продуктов, обильно инфицированных этим возбудителем. Это могут быть мясные изделия, особенно из рубленого мяса, рыбные блюда, овощные салаты и др. Доказательством этиологической роли протея является массивное обнаружение этого микроба в пищевых продуктах, рвотных массах и испражнениях, а также реакция агглютинации выделенного микроба с сывороткой крови пострадавших, прослеженная в динамике.

К роду Proteus относятся бактерии, которые кроме перечисленных свойств, характерных для всей группы Proteae, разжижают желатин, гидролизуют мочевину, продуцируют сероводород, не ферментируют маннит, инозит, сорбит, арабинозу, рафинозу, обычно не образуют ацетилметилкарбинола и дают положительную реакцию с метиловым красным. В отношении ферментации сахарозы, салицина и утилизации цитрата ведут себя по-разному. На основании различий по некоторым ферментативным свойствам возможно дифференциация рода Proteus на две биогруппы: Proteus vulgaris, который образует индол, ферментирует мальтозу и не декарбоксилирует орнитин, и Proteus mirabilis, который не образует индола, не ферментирует мальтозу и декарбоксилирует орнитин (см. таблицу 1). Характерным для бактерий этого рода является разлитой рост (феномен роения) на твердых агаровых средах, как при 20 — 25°, так и при 37°. Редко встречаются и неподвижные варианты (0-формы).

В практических лабораториях для определения принадлежности выделенных бактерий к роду Proteus достаточно использовать ограниченное число тестов (таблица N 2).

Таблица 2

НАБОР БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ,

ПОЗВОЛЯЮЩИХ ОПРЕДЕЛИТЬ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ

ВЫДЕЛЕННОГО ШТАММА К РОДУ PROTEUS

┌────┬─────────────────────────────┬──────────────────────────────────────┐

│ N │ Тесты │ Proteus │

│п/п │ ├──────────────────┬───────────────────┤

│ │ │ vulgaris │ mirabilis │

├────┼─────────────────────────────┼──────────────────┼───────────────────┤

│1 │Ферментация 6 — 10% лактозы │- │- │

│2 │Дезаминирование фенилаланина │+ │+ │

│3 │Образование сероводорода и │+ │+ │

│ │ферментация глюкозы на агаре │ │ │

│ │Клиглера │ │ │

│4 │Расщепление мочевины │+ │+ │

│5 │Индолообразование │+ │- │

│6 │Ферментация 0,5% мальтозы │+ │- │

└────┴─────────────────────────────┴──────────────────┴───────────────────┘

Антигенная структура бактерий рода Proteus подобна структуре представителей других родовых групп семейства Enterobacteriaceae, O- и H-антигены которых имеют мозаичный характер. Антигенно-диагностическая схема Proteus включает 49 серологических O-групп, 19 H-антигенов и свыше 100 серотипов (табл. 3). Кроме того, было установлено, что 049 антиген состоит из двух факторов, один из которых идентичен 020 антигену (Романенко Э.Е., 1973). Диагностическое значение имеют оба комплекса антигенов: соматический O-антиген и жгутиковый H-антиген. O-антиген расположен в бактериальной клеточной стенке и представляет собой полисахаридно-липидно-белковый комплекс. Серологическую специфичность O-антигена определяет его полисахарид. O-антиген обладает термостабильностью. Термолабильный H-антиген является белковым соединением и содержится в жгутиках.

Таблица 3

УПРОЩЕННАЯ АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА БАКТЕРИЙ РОДА

PROTEUS (KAUFFMANN, PERCH, 1947; PERCH, 1948)

┌─────────┬───────────────┬─────────┬─────────┬─────────────────┬─────────┐

│O-антиген│ H-антиген │ Число │O-антиген│ H-антиген │ Число │

│ │ │известных│ │ │известных│

│ │ │серотипов│ │ │серотипов│

├─────────┼───────────────┼─────────┼─────────┼─────────────────┼─────────┤

│1 │1 │2 │26 │2; 3; 6 │3 │

│2 │1 │1 │27 │2; 3 │2 │

│3 │1; 2 │3 │28 │2; 3 │2 │

│4 │1; 8; 16 │3 │29 │13 │<…> │

│5 │1; 3 │2 │30 │1; 2; 4; 13; 15 │6 │

│6 │1; 2; 3 │3 │31 │1; 2 │2 │

│7 │1; 3; 4 │3 │32 │1; 3; 5 │6 │

│8 │1 │1 │33 │3 │1 │

│9 │1; 2 │2 │34 │6 │<…> │

│10 │1; 2; 3; 4; 5 │5 │35 │2 │<…> │

│11 │1; 2; 3; 6 │5 │36 │3; 7 │2 │

│12 │1; 2 │2 │37 │17 │1 │

│13 │1; 2; 3; 4 │4 │38 │1; 2 │2 │

│14 │1; 3 │2 │39 │18 │<…> │

│15 │1; 7 │2 │40 │4 │1 │

│16 │1; 9; 14 │3 │41 │1; 2 │2 │

│17 │1; 10 │2 │42 │1 │1 │

│18 │1 │1 │43 │2 │1 │

│19 │1; 3; 11 │4 │44 │14; 19 │2 │

│21 │1 │1 │45 │14 │1 │

│22 │1 │1 │46 │17 │1 │

│23 │1; 2; 3; 12 │5 │47 │1 │1 │

│24 │1; 3; 4; 13 │4 │48 │1 │1 │

│25 │1 │1 │49 │2 │1 │

└─────────┴───────────────┴─────────┴─────────┴─────────────────┴─────────┘

Примечание. Число серотипов в каждой O-группе определяется числом вариаций в рецепторном составе O- или H-антигена.

Серологический тип бактерий рода Proteus устанавливается по сочетанию O- и H-антигенов с учетом их факторного состава.

Бактериологические исследования

Первый день

1. Для количественного учета и получения чистой культуры первичный

посев исследуемого материала производят по 0,1 мл, из 10-кратных разведений

-6

в 0,1% стерильной пептонной воде, до разведения 10 в конденсационную

воду свежескошенного агара по методу Шукевича и на поверхность питательных

сред Плоскирева или Вильсона — Блер.

Посевы помещают в термостат при температуре 37° на 18 — 24 часа.

Второй день

1. Просматривают титрационные посевы на скошенном мясопептонном агаре. Если регистрируют вползающий нежный вуалеобразный рост, то определяют титр по наименьшему количеству засеянного материала, в котором обнаружен рост бактерий Proteus.

2. После инкубации в течение 18 — 24 часов в термостате при 37° чашки с посевами просматривают и отмечают колонии, подлежащие дальнейшему исследованию. На среде Плоскирева штаммы растут в виде прозрачных колоний, слегка щелочат среду, которая окрашивается около них в желтоватый цвет. При более длительном хранении чашек с посевами колонии мутнеют, а их центр приобретает бурую окраску. На висмут-сульфит-агаре (среда Вильсона — Блер) через 48 часов штаммы вырастают в виде изолированных колоний грязно-коричневого цвета, окраска среды под колониями не изменяется <*>.

———————————

<*> Наличие на среде Эндо или Левина, при выявлении других представителей семейства кишечных, ползучего роста дает основание определить в исследуемом материале бактерии Proteus. Однако для биохимического и серологического типирования необходимо изучение отдельных изолированных колоний. Для получения изолированных колоний со среды Эндо или Левина делается пересев в пробирки с бульоном и после 4 — 5-часовой инкубации при 37° — повторный пересев на слабощелочной агар с 0,4% карболовой кислотой или на среду Плоскирева. На следующий день изолированные колонии подвергаются дальнейшему изучению по обычной схеме.

Если рост 18 — 24-часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее трех колоний, при росте разных колоний для их изучения надо брать больше колоний, различных по внешнему виду.

3. Для определения родовой принадлежности изучаемого штамма изолированные колонии отвивают в пробирку с мясопептонным бульоном, из которого после 4 — 5-часовой инкубации при 37° производят пересевы на следующие среды:

1. Бульон или пептонную воду для определения индола;

2. Среду с мочевиной для определения фермента уреазы;

3. Агар Клиглера для определения ферментации глюкозы и образования сероводорода;

4. 6 или 10% лактозу;

5. 0,5% мальтозу;

6. 0,3% полужидкий агар для определения подвижности и скошенный слабощелочной агар для серологического типирования.

При отсутствии агара Клиглера можно использовать среду Олькеницкого, а вместо среды Преуса — столбик с мочевиной или среду Ресселя с мочевиной.

Третий и четвертый дни

1. Учитывают результаты ферментативной активности культур, выделенных накануне. Грамотрицательные культуры, ферментирующие глюкозу, гидролизующие мочевину, образующие сероводород и не ферментирующие лактозу, оценивают как бактерии, принадлежащие к роду Proteus. На основании способности к индолообразованию и ферментации мальтозы определяют принадлежность к одной из биохимических групп: штаммы, ферментирующие мальтозу и образующие индол, относят к Proteus vulgaris; штаммы, не ферментирующие мальтозу и не образующие индол, — к Proteus mirabilis. При необходимости более углубленного изучения ферментативных свойств выделенную культуру изучают по всем тестам, указанным в таблице 1.

Если изучаемый штамм продуцирует индол и сероводород, не ферментирует (или ферментирует) лактозу и не расщепляет мочевину, необходимо произвести дифференциацию между редко встречающимися биохимическими вариантами Proteus, не гидролизующими мочевину или ферментирующими лактозу, и индолположительными вариантами Salmonella и Citrobacter.

2. Такие штаммы следует в первую очередь проверить на наличие

фенилаланиндезаминазы. Для определения фенилаланиндезаминазы производят

обильный посев в пробирки со скошенным агаром, содержащим фенилаланин.

Через 18 — 24 часа инкубации при 37° на поверхность среды с ростом

наслаивают 10% хлорное железо (FeCl) ). Появление интенсивной зеленой

3

окраски свидетельствует о положительной реакции. Штаммы, дезаминирующие

фенилаланин, относятся к роду Proteus. Штаммы, не образующие

фенилаланиндезаминазу, подвергают дальнейшему изучению для определения их

принадлежности к другим родовым группам семейства Enterobacteriaceae.

Серологическое типирование

1. Штаммы, отнесенные на основании биохимических свойств к роду Proteus, подвергают серологическому типированию при помощи диагностических поливалентных, групповых и типовых O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле. Для типирования пользуются суточной агаровой культурой. Первоначально культуру испытывают поливалентными O-сыворотками. В случае, если культура агглютинируется одной из поливалентных сывороток, продолжают серологическую идентификацию с групповыми или типовыми сыворотками, входящими в состав поливалентной. При нечетких результатах, полученных в реакции агглютинации на стекле с живой культурой, проводят реакцию агглютинации в пробирках или на стекле с гретой (1 час — 100°) отцентрифугированной культурой.

После установления принадлежности к той или иной O-группе определяют H-антиген с поливалентными H-сыворотками, а затем с групповыми и типовыми. При помощи O-сывороток определяют O-группу, при помощи H-сывороток — H-антиген. На этом анализ заканчивается и выдается ответ.

2. При отсутствии диагностических H-сывороток и необходимости решить вопрос, однородны ли по H-антигену выделенные штаммы (например, при определении источника инфекции в очаге), может быть использован феномен, описанный Динесом. Сущность этого феномена заключается в том, что при посеве в разных местах чашки Петри с 2% агаром двух идентичных по H-антигену штаммов наблюдалось слияние посевов в результате ползучего роста; при посеве культур с различными H-антигенами между обеими засеянными поверхностями образовывалась разграничительная (демаркационная) зона шириной 0,5 — 2 мм.

3. Постановку реакции агглютинации выделенной культуры с сывороткой крови больного необходимо производить повторно, чтобы выявить динамику антител (технику постановки реакции смотри выше).

Д. ПАТОГЕННЫЕ ГАЛОФИЛЫ

Общие сведения

Vibrio parahaemolyticus вызывает острые гастроэнтериты, напоминающие по клиническому течению дизентерийные заболевания, стоящие на первом месте в этиологической структуре пищевых бактериальных отравлений в Японии. Начиная с 1969 года в США также регистрируются пищевые отравления за счет V. parahaemolyticus в связи с употреблением морепродуктов. В настоящее время этот микроорганизм обнаружен в образцах морских рыб почти всех континентов.

6

Заболевания наступают только при обильном обсеменении (более 10 клеток

в 1 грамме) пищи живыми клетками V. parahaemolyticus. Стерильные фильтраты

культур не вызывают заболеваний.

Было установлено, что энтеропатогенные штаммы V. parahaemolyticus, обнаруженные в выделениях больных, обладали гемолитическими свойствами, в то время как штаммы, выделенные из рыбы, послужившей причиной заболевания, и из морской воды, были негемолитичны. Этот феномен получил название по имени автора, его описавшего, «Kanagawa»-феномен. Однако пока остается неизвестным, что же определяет энтеропатогенность «Kanagawa»-положительных штаммов V. parahaemolyticus.

В СССР V. parahaemolyticus как возбудитель пищевых бактериальных отравлений неизвестен и собственного опыта в его выделении и изучении не имеется. Приведенные в инструкции данные как по биологии этого микроорганизма, так и методам его обнаружения, биохимической и серологической дифференциации взяты из опубликованных работ.

Vibrio parahaemolyticus грамотрицательный, полиморфный, подвижный, факультативный анаэроб. Он хорошо растет на обычных питательных средах, содержащих 2 — 3% NaCl. Оптимальная температура роста 30 — 37°, оптимальный pH 7,5 — 8,8.

V. parahaemolyticus имеет три антигена «O», «K» и «H». Однако серологическая классификация основана на учете «O» и «K» антигенов, т.к. «H» антигены идентичны. «O» антиген соматический, термостабильный, «K» антиген капсульный и при 100° разрушается. Установлено 11 «O» антигенов и 57 «K» антигенов, комбинации которых дают возможность различать отдельные серотипы этого микроорганизма. В настоящее время известны 54 серотипа V. parahaemolyticus. Однако описание метода серологической идентификации с помощью реакции агглютинации в данной методике не приводится, т.к. агглютинационных сывороток в настоящее время не имеется, принципиально же постановка реакции агглютинации не отличается от таковой при идентификации других микроорганизмов.

Известны два близких биотипа рода Vibrio: V. parahaemolyticus и V. alginolyticus, из которых только V. parahaemolyticus по эпидемиологическим и этиологическим данным обладает энтеропатогенными свойствами для человека. Основные биохимические различия этих микроорганизмов приведены в таблице пятого дня исследований.

Бактериологические исследования

Первый день

1. Из подготовленных к исследованию образцов (продукты и кал) производят десятикратные разведения в пептонно-солевом 3% бульоне, из которых высевают по 0,1 мл на подсушенную поверхность висмут-сульфитного агара с феноловым красным. Высеянный материал тщательно втирают шпателем. Посевы инкубируют при 37° 18 — 24 часа.

2. Производят также посев 1 мл неразведенного материала в 10 мл среды обогащения висмут-сульфитный солевой бульон и инкубируют при 37° 18 — 24 часа.

Второй день

1. Просматривают чашки с первичными посевами. Типичные колонии V. parahaemolyticus бесцветны, т.к. не ферментируют сахарозу. Производят их микроскопию в окрашенных по Граму препаратах и подсчет с последующим пересчетом на 1 г продукта по общепринятой методике. 10 типичных колоний высевают на скошенный 2 — 3% солевой агар для дальнейшей идентификации. Микроорганизмы, ферментирующие сахарозу, имеют темно-коричневый цвет, а бактерии группы кишечной палочки на висмут-сульфитном агаре с феноловым красным не растут.

2. Производят пересев петлей со сред обогащения на висмут-сульфитный агар с феноловым красным, так чтобы получить рост изолированных колоний.

Третий день

1. Проверяют чистоту выделенных культур при микроскопии окрашенных по Граму препаратов.

2. Пересевают чистые культуры со скошенного агара на а) пептонный бульон без соли, б) пептонные солевые бульоны, содержание 6%, 8% и 10% NaCl и на в) полужидкий агар для определения подвижности.

Все посевы инкубируют при 37° в течение 18 — 24 часов.

Четвертый день

1. Сравнивают рост культур на средах: пептонный бульон без соли и пептонно-солевые бульоны. V. parahaemolyticus хорошо растет в солевом бульоне с 6 — 8% NaCl и не растет или растет очень слабо в бульонах без соли и с 10% NaCl.

2. Определяют подвижность культур по характеру роста на полужидком агаре.

3. Пересевают 24-часовые агаровые культуры на среды Гисса, содержащие сахарозу и арабинозу. Инкубация посевов при 37° 24 часа.

4. Пересевают 24-часовые агаровые культуры в бульон с глюкозой для определения образования ацетилметилкарбинола. Инкубация посевов при 25 — 27° в течение 48 часов.

<…> галофилов по их гемолитическим свойствам производят пересев культур петлей из солевого бульона по секторам на хорошо подсушенную чашку с кровяным солевым агаром (среда Wagatsuma). Инкубируют при 35° 18 — 20 часов.

Пятый и шестой дни

1. Учет результатов ферментации углеводов. V. parahaemolyticus, как правило, не ферментирует сахарозу и ферментирует арабинозу.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ V. PARAHAEMOLYTICUS

И ДРУГИХ ГАЛОФИЛОВ

┌────────────────────────────────┬─────────────┬─────────────┬────────────┐

│ Наименование тестов │V. parahaemo-│V. alginoly- │V. angilla- │

│ │lyticus │ticus │rum │

├────────────────────────────────┼─────────────┼─────────────┼────────────┤

│Подвижность │+ │+ │+ │

│Рост в пептонном бульоне │ │ │ │

│без NaCl │- │- │- │

│с 6% NaCl │+ │+ │+ │

│с 8% NaCl │+ │+ │- │

│с 10% NaCl │- │+ │- │

│Образование ацетилметилкарбинола│- │+ │+ │

│Ферментация: сахарозы │- (+) │+ (-) │+ (-) │

│ арабинозы │+ (-) │- (+) │ │

└────────────────────────────────┴─────────────┴─────────────┴────────────┘

Обозначения: + положительная реакция

— отрицательная реакция

+ (-) чаще положительная реакция

— (+) чаще отрицательная реакция

2. Постановка реакции на ацетилметилкарбинол. К 1 мл бульонной культуры добавляют 0,6 мл 5% альфа-нафтола и после смешивания 0,2 мл 40% водного раствора щелочи (KOH). Розовое окрашивание, наступившее через 2 — 24 часа, указывает на наличие ацетилметилкарбинола.

3. Учет результатов наличия гемолиза определяют по зонам просветления среды вокруг колоний. V. parahaemolyticus, обладающий энтеропатогенными свойствами, вызывает гемолиз эритроцитов.

Критериями диагностики заболеваний, вызванных V. parahaemolyticus,

6

является обнаружение их в подозреваемом продукте в количестве 10 и более

живых клеток в 1 г/мл, с одновременным обнаружением того же типа

возбудителя в кале пострадавших.

СПОРОНОСНЫЕ АЭРОБЫ BAC. CEREUS

Общие сведения

Bac. cereus почвенный микроорганизм чрезвычайно широко распространенный

во внешней среде — воде, воздухе и пыли помещений, на оборудовании и

аппаратуре предприятий пищевой промышленности и общественного питания.

Благодаря широкому распространению во внешней среде Bac. cereus часто

обнаруживается и на продуктах питания, где при благоприятных условиях

6 7

размножается до количеств 10 — 10 в 1 г и может вызывать пищевые

отравления.

Низкая требовательность к условиям, необходимым для роста, приводит к тому, что Bac. cereus может размножаться на любом продукте питания и вследствие этого практически любой продукт при его массивном обсеменении данным микроорганизмом может привести к возникновению заболевания. В связи с Bac. cereus описаны отравления, вызванные мясными и рыбными продуктами, кондитерскими изделиями, растительными и молочными продуктами.

По современной классификации Bac. cereus отнесен к роду Bacillus, к группе апатогенных аэробных спорообразователей, объединяющих 25 видов, из которых два Bac. thuringiensis и Bac. mycoides часто рассматривают как вариетэты Bac. cereus, ибо первый почти от него неотличим, а второй отличается лишь ризоидным характером роста на твердых питательных средах, однако и это свойство, как показали исследования последних лет, может стойко утрачиваться.

В мазках с поверхности скошенного агара, окрашенных по Граму, Bac. cereus имеет вид крупных, грамположительных палочек с слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже — отдельно друг от друга. В висячей капле подвижен, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной подвижностью (около 15%) и даже вовсе лишенные подвижности (менее 0,5%). На поверхности МПА образует крупные распластанные колонии белого цвета со слегка изрезанными краями. На средах с желтком колонии эти окружены широкой зоной глубокого равномерного бело-матового коагулята (положительная реакция на лецитиназу). На полимиксиновых средах с ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолий хлорид) колонии Bac. cereus зернистые, матовые, ярко-рубинового цвета на фоне зоны белого коагулята. На кровяном агаре колонии Bac. cereus сероватой окраски, зернистые в отраженном свете, с перламутровым отливом в проходящем свете, окружены зоной гемолиза разной интенсивности. На столбике скошенного агара Bac. cereus дает сплошной белый рост, иногда мучнистого вида. Рост этого микроорганизма на жидких питательных средах сопровождается помутнением бульона, образованием хлопьевидного осадка белого цвета (25 — 30% штаммов) и нежной белой пленки на поверхности среды. Все штаммы Bac. cereus створаживают молоко, частично пептонизируя его на 6 — 10 сутки. Около 85% штаммов разжижают желатин в течение 1 — 4 суток. Все без исключения штаммы Bac. cereus дают положительную реакцию на лецитиназу и ацетилметилкарбинол (р-ция Фогес-Проскауэра), расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов также сахарозу, глицерин, декстрин, лактозу, галактозу, инулин и дульцит.

Оптимум роста для Bac. cereus 30°, однако споры его могут прорастать при широком интервале температур — от 3° — 5° до 70° и давать рост при 6° — 55° (около 4%), а при температуре 12° — 39° достаточно интенсивный рост дают все штаммы данного микроорганизма. Bac. cereus способен давать рост в широком интервале pH от 4 до 12,5 и наиболее интенсивно от 7 до 9,5. Достаточно устойчив он к действию поваренной соли, сахара, коптильных препаратов. Поваренная соль задерживает размножение этого микроорганизма лишь при 10 — 15% содержании.

Bac. cereus легко и быстро образует споры. Содержание спор уже в 2-суточной культуре составляет до 50% от общего числа клеток данного микроорганизма. При этом споры Bac. cereus обладают достаточно высокой температурной устойчивостью и могут выживать не только при обычных методах технологической обработки пищи (варка, обжаривание, кипячение), но и при стерилизации молока и консервов.

Критериями диагностики заболеваний, вызываемых Bac. cereus, являются:

обнаружение Bac. cereus в подозреваемом продукте питания в количестве более

5

10 в 1 г; обнаружение Bac. cereus в кале и рвотных массах или промывных

2 3

водах желудка в количестве 10 — 10 в 1 г/мл; обнаружение Bac. cereus в

кале большинства пострадавших при расследуемой вспышке отравления;

обнаружение Bac. cereus при спорадических заболеваниях в кале пострадавшего

только в острый период заболевания с последующим исчезновением этого

микроорганизма из кишечного содержимого к моменту выздоровления.

Бактериологические исследования

Первый день

Производят посев подготовленных к исследованию разведений материала на поверхность одной или нескольких питательных сред, в зависимости от характера исследуемых объектов. Посев производят по схеме N 1. Для выделения Bac. cereus из молочных продуктов целесообразно использовать среду Донована, а для посевов испражнений — солевой полимиксиновый агар с 2,3,5-ТТХ или среду Никодемуса. Солевой полимиксиновый агар может использоваться при исследовании любых объектов. Внесенный в чашки Петри посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды при помощи шпателя, после чего инкубируют при температуре 30 — 37° от 24 до 96 часов (см. схему N 1).

Схема N 1

СХЕМА ПОСЕВА МАТЕРИАЛА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА BAC. CEREUS

———————————

<*> При посеве 1,0 мл материал засевается по 0,3 мл на поверхность трех чашек Петри.

Второй день

Производят изучение морфологии выросших колоний, микроскопию мазков, окрашенных по Граму, и подсчет типичных колоний. Штаммы Bac. cereus на средах Никодемуса и Донована образуют крупные белые распластанные колонии со слегка изрезанными краями, окруженные широкой зоной глубокого белого равномерного матового коагулята или двойной зоной — коагулят и просветление. На солевом полимиксиновом агаре с 2,3,5-ТТХ они образуют ярко-рубиновые колонии на фоне широкой зоны глубокого равномерного белого коагулята; колонии в первые часы роста — округлые, выпуклые, в дальнейшем (24 — 48 часов) распластанные на поверхности агара с изрезанными краями.

Для определения количества Bac. cereus в исследуемом объекте количество выросших типичных колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и выражают в пересчете на 1 г/мл исследуемого объекта.

Пересевают 3 — 5 колоний на скошенный агар с последующей инкубацией 18 — 24 часа при температуре 30 — 37°.

Третий день

Изучение характера роста на скошенном агаре, морфологии выросших культур в окрашенных по Граму препаратах и проверка чистоты культуры. Микроскопия висячей или раздавленной капли для установления подвижности выделенной чистой культуры. B. cereus в отличие от B. anthracis обладает подвижностью. Посев на «пестрый ряд», включающий глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, галактозу, маннит и дульцит, и на кровяной агар. Инкубация в течение 18 — 24 часов при температуре 30 — 37°. Пересев на глюкозо-пептонный бульон (инкубация 48 часов при температуре 30 — 37°) для последующей постановки реакции на ацетилметилкарбинол.

Четвертый день

Идентификация выделенных культур по «пестрому ряду» и кровяному агару.

Пятый день

Постановка реакции на ацетилметилкарбинол. Для постановки этой реакции к 1 мл 48-часовой культуры на глюкозо-пептонном бульоне прибавляется 0,2 мл 40% водного раствора KOH и 0,6 мл раствора альфа-нафтола (альфа-нафтола 5 г, абсолютного этилового спирта 100 мл, раствор должен быть свежеприготовленным). Положительная реакция отмечается в виде розового окрашивания через 2 — 24 часа инкубации при 37°. Окончательный учет реакции через 24 часа.

Характерным для Bac. cereus является гемолитическая активность, положительная реакция на лецитиназу и ацетилметилкарбинол, подвижность и отсутствие способности сбраживать маннит (см. таблицу N 1).

Таблица 1

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ BAC. CEREUS С BAC. ANTHRACIS

С АЭРОБНЫМИ СПОРОВЫМИ САПРОФИТАМИ

┌──────────────────────────────┬──────────────────────────────────────────┐

│ │ Дифференциальные тесты │

│ ├──────────┬────────┬────────────┬─────────┤

│ │гемолити- │децити- │ацетилметил-│ маннит │

│ │ческая │назная │карбинол │ │

│ │активность│ак-сть │ │ │

├──────────────────────────────┼──────────┼────────┼────────────┼─────────┤

│Bac. cereus │+ │+ │+ │- │

│Bac. anthracis │- │- │+ │- │

│Bac. cereus var. mycoides │+ │+ │+ │- │

│Bac. cereus var. thuringiensis│ │ │ │ │

│Bac. megaterium │+ │- │- │- │

│Bac. subtilis │+ │+ │- │+ │

│Bac. pumilis │ │ │ │ │

│Bac. coagulans │+ │+ │- │- │

│Bac. alvei │ │ │ │ │

│Bac. licheniformus │ │+ │- │+ │

│Bac. lentus │ │- │+/- │- │

│Bac. circulans │+ │- │- │- │

│Bac. macerans │ │ │ │ │

│Bac. laterosporus │+ │- │- │+ │

│Bac. pulvefaciens │ │ │ │ │

│Bac. sphericus │+ │- │- │- │

│Bac. badius │+ │ │ │ │

│Bac. firmus │ │- │- │+ │

│Bac. polymyxa │+ │+ │+/- │+ │

│Bac. brevis │+ │- │- │- │

│Bac. stearothermophieus │+ │- │- │- │

│Bac. panthotenicus │ │- │+ │- │

│Bac. pasteurii │ │- │- │- │

└──────────────────────────────┴──────────┴────────┴────────────┴─────────┘

КОАГУЛАЗОПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СТАФИЛОКОККИ

Общие сведения

Стафилококки принадлежат к широко распространенным в природе микроорганизмам. По классификации Берджи они относятся к семейству Micrococcaceae, род Staphylococcus, включающий несколько видов: St. aureus, St. albus, St. pyogenes citreus, St. epidermidis.

Способность отдельных стафилококков коагулировать нитратную плазму крови кроликов под воздействием фермента коагулазы определяет их патогенность.

В связи с чем реакция коагулирования плазмы крови, являясь показателем патогенности стафилококков, одновременно является показателем потенциальной их энтеротоксичности. Роль патогенных энтеротоксичных стафилококков в этиологии пищевых стафилококковых токсикозов общепризнана и в настоящее время не вызывает сомнений.

Являясь факультативными аэробами, стафилококки хорошо растут на различных субстратах. Размножаются они одинаково хорошо как в продуктах, богатых углеводами, так и в продуктах, богатых белками, не изменяя при этом внешнего вида, цвета и вкуса пищевого продукта. Связывать стафилококковые интоксикации с определенным видом пищевых продуктов в настоящее время не представляется возможным. Практически следует считать, что любой вид пищевого продукта может быть причиной этих заболеваний, будь то молочные, мясные продукты, кондитерские изделия, продукты растительного происхождения или различные консервированные продукты.

Пищевые продукты, вызвавшие стафилококковые интоксикации, обычно бывают значительно обсеменены патогенными стафилококками. В грамме такой пищи обнаруживаются сотни тысяч, миллионы стафилококков.

Стафилококки устойчивы к действию физических и химических факторов: хорошо выдерживают высушивание и действие прямого солнечного света. В жидкой среде стафилококки переносят нагревание при температуре 70° в течение часа, а при температуре 80° в течение 10 минут.

Температурный оптимум 37°, температурные границы размножения отмечаются в широкой зоне от 6,6° до 45°.

Стафилококки очень устойчивы по отношению к находящемуся в продуктах хлористому натрию, при концентрации NaCl, равной 7 — 10%, еще наблюдается их размножение.

Сахар не препятствует размножению стафилококков, и лишь концентрация его более 60% является задерживающим фактором их роста.

Продуктом жизнедеятельности патогенных стафилококков является энтеротоксин, особенностью которого, в отличие от ботулотоксинов, является его высокая терморезистентность. Энтеротоксин выдерживает автоклавирование при 120° в течение 20 минут. Снижение терморезистентности энтеротоксина связано с pH среды. Так, при pH 4,5 нагревание на кипящей бане в течение 40 минут снижает активность энтеротоксина в 10 раз, а при pH 3,0 энтеротоксин полностью разрушается.

Работами последнего десятилетия были установлено, что фильтраты патогенных сталофилококковых культур, вызвавшие пищевые интоксикации, представляют собой комплекс различных белковых веществ, специфических полипептидов, содержащих антигенно различные типы энтеротоксинов.

В настоящее время известно уже 6 типов стафилококковых энтеротоксинов, которые обозначены буквами латинского алфавита A, B, C, D, E, F.

Однако техника получения очищенных энтеротоксинов, необходимых для изготовления антиэнтеротоксических сывороток, связана с большими методическими трудностями и до настоящего времени эти сыворотки имеются только в немногих высокоспециализированных лабораториях.

Бактериологические исследования

Первый день

1) Пищевые продукты после предварительной обработки и разведения в 0,1% пептонной воде засевают по 0,1 мл из соответствующих разведений, в зависимости от предполагаемого обсеменения их стафилококками, на подсушенные чашки Петри с молочно-солевым агаром.

2) Посев материала от пострадавших (рвотные массы, промывные воды, кал) высевают в количестве 2 капель на поверхность молочно-солевого агара. Посевной материал равномерно распределяют по поверхности агара стерильным шпателем и втирают досуха.

Посевы инкубируют при 37° в течение 24 — 48 часов.

3) Одновременно производят посев материала в среды обогащения в солевые бульоны с 6,5% и 10% хлористого натрия и сахарный бульон с 1% глюкозы. Засеваемый материал должен составлять не более 1/10 объема питательной <…> часа.

При исследовании продуктов, содержащих большие количества соли (сельдь, кильки и др.), посевы в солевые среды не производят. Также не производят посевы в сахарный бульон продуктов с большим содержанием сахара (крем, мороженое и др.).

Второй день

1) Просматривают посевы на чашках с молочно-солевым агаром и из отдельных типичных колоний готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Колонии стафилококков на молочно-солевом агаре имеют форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре, с ровными краями и умеренно выпуклой поверхностью. Колонии непрозрачны и окрашены в цвет пигмента, образуемого микробами (от белого до оранжево-желтого).

При обнаружении грамположительных кокков для дальнейшего изучения производят отсев чистых культур на скошенный агар, которые инкубируют при 37° 18 — 24 часа.

2) При отсутствии роста на молочно-солевом агаре, подозрительных на стафилококки колоний, производят высев со сред обогащения на сектора плотных сред. Из солевых бульонов высев производят на мясопептонный агар, содержащий соль (молочно-солевой, желточно-солевой).

Третий день

1) Производят подсчет выросших при первичном посеве продукта, на молочно-солевом агаре, колоний стафилоккоков и производят пересчет их числа на 1 г/мл. Количественный учет стафилококков, выросших при посеве материала от больных, не производят.

2) Проверяют в мазках, окрашенных по Граму, чистоту выделенных на скошенный агар культур и определяют их патогенность в реакции коагуляции плазмы.

Реакция плазмокоагуляции

Для приготовления плазмы свежеполученную кровь кролика тщательно смешивают в соотношении 5:1 со стерильным 5% раствором лимоннокислого натрия. После центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 15 мин. или <…> в стерильные пробирки с пробками и вносят по одной петле суточной агаровой культуры, которую тщательно растирают в плазме. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной в качестве контроля.

Пробирки помещают в термостат при 37°. Учет результатов производят через 1 — 3 — 24 часа.

Степень коагулирования плазмы отмечают знаками «+».

Реакцию плазмокоагуляции считают положительной, начиная с 2 + до 4 +. При реакции на 2 + образуется небольшой компактный сгусток, в то время как в реакции на 1 + сгусток диффузный. С целью ускорения исследования стафилококков на патогенность для реакции плазмокоагуляции вместо суточных агаровых культур можно применять 2 — 3-часовые бульонные культуры, добавляя их по 2 капли к 0,5 мл разведенной плазмы. Учет результатов коагуляции плазмы в данном случае производят в сроки от 30 минут до 2 — 4 часов. Значительно упрощает проведение реакции плазмокоагуляции применение для этих целей сухой плазмы кролика, которую выпускает Белорусский Институт эпидемиологии и микробиологии <*>.

———————————

<*> Адрес: БССР, Минск, ул. Ногина, 3. Предприятие по производству бактерийных препаратов Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии.

3) При отсутствии коагулазоположительных стафилококков при первичном посеве на плотные среды изучают колонии, выделенные со сред обогащения, как описано в разделе «Третий день».

Для оценки результатов исследования на стафилококки при пищевых отравлениях указывается количественное обсеменение ими пищевых продуктов, которое в этих случаях выражается в сотнях тысяч и более на 1 г продукта.

Количественный учет коагулазоположительных стафилококков в пищевых продуктах служит косвенным показателем наличия в них энтеротоксинов. Этот показатель следует использовать, учитывая в каждом конкретном случае характер пищевого продукта, технологию его приготовления, способ и время хранения.

В настоящее время при стафилококковых интоксикациях серологические реакции с кровью пострадавших не ставят.

Фаготипирование патогенных стафилококков

При эпидемиологическом изучении стафилококковых интоксикаций применяют метод фаготипирования стафилококков. Типированию подлежат все коагулазоположительные стафилококки, выделенные из инкриминированного продукта, от пострадавших, из смывов с инвентаря, оборудования и др. Для этих целей используют международный набор типовых бактериофагов. Стафилококковые бактериофаги распределены на 4 литические группы.

I группа — фаги 29, 52, 52A, 79, 80

II группа — фаги 3A, 3C, 55, 71

III группа — фаги 6, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85

IV группа — фаг 42D

Вне групп — фаги 81, 187.

Фаготипированию подвергают только коагулазоположительные штаммы стафилококков, используя одновременно для этого все 22 типовых фага.

Перед началом работы к каждой ампуле лиофильно высушенного фага

асептически добавляют по 0,9 мл любого питательного щелочного бульона

(Хоттингера, мясопептонного, Мартена pH 7,4) и получают фаги в разведении

-1

1:10 (10 ), т.к. выпускаемые фаги высушены в объеме 0,1 мл. Для

типирования используют фаги в тест-разведении, которое указано на

этикетках.

За тест-разведение принимают то разведение фага, которое образует

полусливной лизис (наблюдается лишь незначительный рост культур в зоне

лизиса) на эталонной культуре.

Для получения тест-разведения делают ряд десятикратных разведений, для

чего стерильно разливают в пробирки по 0,9 мл бульона и из первого

-1

разведения фага 10 переносят 0,1 мл в следующую пробирку, после

-2

смешивания 0,1 мл полученного в этой пробирке разведения 10 переносят в

следующую пробирку и т.д. до получения соответствующего тест-разведения.

Для каждого разведения берут новую пипетку.

Необходимо силу полученных тест-разведений проверить на применяемой в

лаборатории питательной среде, используя эталонные штаммы стафилококков,

которые имеются в ИЭМГ и республиканских СЭС. Фаги в жидком состоянии

хранят при температуре комнатного холодильника в пробирках, закрытых

-1

резиновыми пробками. Основное разведение фагов 10 при таком хранении

можно использовать в течение 2 месяцев.

Тест-раведение можно использовать без проверки в течение не более чем 7 дней.

Проверку тест-разведения производят нанесением капли фага в тест-разведении на сектор чашки, орошенной соответствующей эталонной культурой.

Для фаготипирования суточную агаровую культуру испытуемого штамма

стафилококка засевают в 5 мл любого питательного бульона (pH 7,2 — 7,4) и

выращивают 3 — 4 часа при температуре 37° до появления заметной мути.

Готовят чашки с 1,2% агаром, содержащим 0,5% глюкозы и 40 мг/мл CaCl .

2

Хлористый кальций добавляют в расплавленный агар перед розливом его в чашки

из расчета 1 мл 4% CaCl на 100 мл питательного агара.

2

Агар разливают в чашки слоем толщиной 30 — 40 мм. Желательно для этих целей использовать прозрачный агар, что облегчает учет результатов в проходящем свете.

Чашки с открытыми крышками подсушивают в термостате при 37° в течение 1 часа. После чего на дно чашки наносят карандашом по стеклу сетку из 22 квадратов, по количеству используемых фагов.

Подсушенную чашку орошают 4-часовой бульонной культурой испытуемого штамма стафилококка, избыток культуры удаляют. Чашку вновь подсушивают 30 мин. при 37°. Фаги наносят на засеянную чашку платиновой петлей диаметром 2 мм, слегка касаясь петлей поверхности агара или тонко оттянутыми пастеровскими пипетками (откалиброванными приблизительно 100 капель на мл).

Петлю после нанесения каждого фага следует прожигать, в случае использования пипеток — для каждого фага используют отдельную пипетку. Фаги наносят в определенном порядке и каждый фаг в соответствующий квадрат.

┌───┬───┬───┬───┬───┐

│29 │52 │52A│79 │80 │

├───┼───┼───┼───┼───┤

│3A │3C │55 │74 │84 │

├───┼───┼───┼───┼───┤

│6 │85 │42E│47 │53 │

├───┼───┼───┼───┼───┤

│54 │75 │77 │83A│42D│

└───┼───┼───┼───┴───┘

│81 │187│

└───┴───┘

После подсыхания капель фагов при комнатной температуре чашки, перевернутые крышками вниз, инкубируют 18 — 20 часов при 30° или 5 — 6 часов при 37° и до следующего утра при комнатной температуре.

<…> разведении, то на следующий день проводят повторное типирование, используя более концентрированные фаги (10 TP или 100 TP), что соответствует разведениям фага, предшествующим тест-разведению.

Нежелательно использование фагов в разведении 1:10, т.е. основного разведения, т.к. отдельные концентрированные фаги обладают способностью, не лизируя культуры стафилококков, вызывать задержку роста ее, имитируя сильную реакцию лизиса. Это явление называется ингибиция и обозначается «O».

Учет и регистрация результатов типирования

При учете результатов фаготипирования для регистрации степеней лизиса пользуются следующей схемой:

++ 50 или более негативных колоний фага,

+ 20 — 49 колоний фага,

+/- 1 — 19 колоний фага,

— отсутствие лизиса.

Штамм считают типируемым в том случае, когда хотя бы один фаг вызвал сильную на ++ реакцию испытуемого штамма.

Если при типировании с использованием фагов более концентрированных, чем Т.Р., получены только слабые реакции на +; +/- или лизис полностью отсутствовал, то такой штамм считают нетипируемым.

Результаты типирования регистрируют, записывая отдельно лизис фагами, используемыми в тест-разведении или в более концентрированных разведениях, если таковые применяли.

Запись ведется таким образом, что против каждого исследуемого штамма отмечают названия фагов, которые дали лизис, независимо от его силы, с данным штаммом. После чего выводят фагоформулу типируемых штаммов.

В фагоформулы записывают те фаги, которые обусловили сильные литические реакции с испытуемым штаммом. При наличии дополнительных слабых реакций последние в фагоформуле отмечают знаком +.

Например, штамм стафилококка «X» лизировали фаги: 6++, 47++, 53++, 75+, 77+. Фагоформула этого штамма — 6/47/53/+.

Идентичные штаммы имеют одну и ту же фагоформулу. Если фагоформулы штаммов различаются на 1 — 2 и более сильных реакций, то в качестве ориентировочной установки следует принять правило: если эпидемиологически связанные культуры стафилококка, при типировании в один и тот <…> реакцию, то эти культуры следует считать идентичными. Штаммы считаются разными, если различие в фагоформуле составляет 2 и более сильных реакций.

Если культуры стафилококков лизируются фагами 42D или 42E, то для того чтобы судить об их идентичности, необходимо дальнейшее изучение их с помощью специальных фагов. Стафилококки данных фаготипов чаще выделяются из молока и молочных продуктов, куда они попадают от крупного рогатого скота, т.е. имеют животное происхождение.

Фаги международного набора не пригодны для изучения стафилококков животного происхождения. Лизис животных стафилококков фагом 42D определяет лишь групповую принадлежность штаммов, что мешает возможности изучить эпидемиологические связи и выявить источник инфекции, т.к. стафилококки данного фаготипа могут быть неидентичны между собой.

Для типирования стафилококков, выделенных от коров, рабочая группа при Международном Подкомитете по фаготипированию стафилококков, предложила особый набор фагов, который состоит из части фагов международного набора и фагов, выделенных из стафилококков животного происхождения.

Набор этих фагов следующий:

I группа — фаги 29, 52A,

II группа — фаги 3A, 116,

III группа — фаги 6, 42E, 53, 75, 84,

IV группа — фаги 42D, 102, 107, 117,

Смешанная группа — 78, 118, 119.

В материалах расследования пищевого отравления стафилококковой этиологии в результатах типирования выделенных штаммов следует приводить перечень всех фагов, лизирующих культуры, независимо от того, какой силы лизис дал тот или иной фаг, а не ограничиваться названием лишь фагогруппы I, III и т.д.

При наличии большого количества стафилококков, которые необходимо изучить с помощью метода фаготипирования, может быть использован аппарат для фаготипирования.

С помощью аппарата производится одновременное нанесение 22 фагов на агаровую пластинку, в результате чего время типирования сокращается примерно в 10 раз.

При данном методе применяют питательные среды, описанные в разделе «Фаготипирование патогенных стафилококков», за исключением питательного агара для чашек. Агар используют в концентрации 0,9 — 1% вместо 1,2%, т.к. чашки с агаром в открытом перевернутом виде подсушивают при 30° в течение 18 — 20 часов (ночь). При розливе агара на чашки следует обращать внимание на равномерную толщину агара по всей поверхности чашки.

В резервуары стерильной фторопластовой пластинки, помещенной в стерильную чашку Петри, наливают по 3 — 5 капель фагов в тест-разведении. Желательно иметь 2 пластинки для фагов. В одну наливают фаги в тест-разведении, а в другую более концентрированные 10 TP или 100 TP, на случай типирования нетипируемых тест-разведением стафилококков.

Фаги в резервуарах пластинки сохраняются в течение 7 дней при температуре комнатного холодильника. Через 7 дней пластинку следует хорошо промыть, прокипятить в дистиллированной воде в течение 20 минут и только после этого вновь наполнять резервуары фагами.

Квадратную пластинку с металлическими стержнями отвинчивают от рычага и стерилизуют погружением в кипящую воду с последующим прокаливанием над пламенем горелки.

Подсушенную чашку с агаром и пластинку с фагами помещают на подвижную площадку. Поочередным передвижением площадки устанавливают под металлическими стержнями сначала пластинку с фагами, а затем чашку с агаром. Опуская и поднимая стержни с помощью поршня, переносят капли фагов на чашку с агаром, едва касаясь ее поверхности. На дне чашки очерчивают карандашом площадь в виде квадрата, куда нанесены фаги, что помогает при чтении результатов.

Чашки с фагами оставляют на столе на 40 — 60 минут, после чего их орошают 4-часовой бульонной культурой испытуемых стафилококков. Избыток культуры удаляют. Инкубацию и оценку результатов производят по общепринятой методике.

По окончании работы с аппаратом пластинку с фагами помещают в чашку Петри, закрывают крышкой и хранят в холодильнике. Металлическую пластинку с стержнями промывают водой и подсушивают над пламенем горелки.

Биологические исследования

Биологические исследования производят: 1) для изучения способности выделенных стафилококков образовывать энтеротоксин на питательных средах; 2) для выявления наличия стафилококкового энтеротоксина в инкриминируемом продукте. В качестве экспериментальных животных могут быть использованы котята (1,5 — 2-месячные) и взрослые кошки.

Биопроба на котятах. Исследуемый продукт или пятисуточную молочную культуру выделенного стафилококка (15 — 20 мл) скармливают котятам натощак. Если котята не едят данный продукт, следует приготовить взвесь продукта в дистиллированной воде (1:1), хорошо гомогенизировать и споить его по 15 — 20 мл каждому котенку при помощи пипетки или ложки. В опыте должно быть 2 — 3 котенка. Положительной реакцией считают рвоту, наступившую через 30 — 60 минут, иногда наблюдается понос и общая прострация. Рвота, появляющаяся через 5 — 10 минут, неспецифична. Наблюдение за котятами ведут в течение 4 — 5 часов. Если за этот период котята не реагируют, биологическая проба считается отрицательной.

Биопроба на кошках. Энтеротоксичность определяют путем внутривенного введения материала кошкам. Этот метод внутривенного введения материала взрослым кошкам достаточно чувствителен. Недостатком метода является ограниченность его применения для обнаружения энтеротоксина непосредственно в продуктах. Для обнаружения энтеротоксичности культур пользуются 0,75% агаром на телячьем бульоне или бульоне Хоттингера с 0,25% глюкозы pH 7,4. Чашки, засеянные культурами стафилококков, помещают в эксикатор с 20% углекислотой и инкубируют 48 часов при 37°.

Чтобы получить в эксикаторе 20% углекислоты, насыпают на дно последнего двууглекислую соду из расчета 1 г соды на каждый литр объема эксикатора, загружают его чашками и, немного приоткрыв крышку, наливают пипеткой Мора <…> — 8 — 9 мл кислоты). После добавления кислоты пробку эксикатора быстро закрывают и притирают.

После инкубации чашки вынимают и на поверхность агара наливают 10 мл физиологического раствора, агар измельчают до равномерной кашицеобразной консистенции и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Экстракт центрифугируют до получения прозрачного слоя, который отсасывают, прогревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут и вводят кошкам в количестве 0,5 мл на 1 кг веса тела в вену уха или бедренную вену.

Наличие рвоты и поноса или только рвоты, наступившей в сроки от 30 минут до 3 часов, указывает на присутствие энтеротоксина. Каждую кошку можно использовать для этих целей 3 — 4 раза. При получении отрицательных результатов у кошки, которая ранее была использована для аналогичных определений, необходима проверка на кошке, не бывшей в опыте.

При помощи метода внутривенного введения кошкам решать вопрос о наличии энтеротоксина в пищевом продукте нужно с большой осторожностью. Из продукта, исследуемого на наличие энтеротоксина, готовят взвесь в стерильном физиологическом растворе таким образом, чтобы при последующем центрифугировании получить достаточное количество надосадочной жидкости для постановки биологической пробы. В качестве контроля необходимо получить отрицательный результат у кошки, предназначенной для опыта, при введении надосадочной жидкости, полученной из доброкачественного тождественного продукта, подготовленного тем же способом, что и опытный образец.

ЭНТЕРОКОККИ

Общие сведения

Энтерококки или стрептококки серологической группы «Д» по Ленсфильд были заподозрены как этиологическая причина пищевых отравлений еще в 20-х годах нашего столетия. Но, фактически, до последнего времени не было получено определенного ответа на этот вопрос, хотя был проведен целый ряд наблюдений на добровольцах и лабораторных животных. В 1969 году в лаборатории санитарно-пищевой микробиологии Института питания АМН СССР в длительных наблюдениях на большом количестве добровольцев было показано, что протеолитические варианты Str. faecalis, <…> животе при нормальной температуре тела.

Энтерококки относятся к роду Sfreptococcus семейства Lactobacilaceae. В группу энтерококков по современной классификации входят:

1. Str. faecalis и его варианты: Str. liqucfaciens и Str. zymogenes.

2. Str. faecium и его вариант Sir. durans.

Для энтерококков характерны следующие основные свойства.

Энтерококки довольно медленно растут на обычных питательных средах, поэтому для более интенсивного роста в среды добавляют углеводы (глюкозу, лактозу), многоатомный спирт — маннит, дрожжевые препараты (автолизаты, диализаты, экстракты), аминокислоты (агринин, аланин и др.), витамины (рибофлавин, никотиновая кислота и др.)

Рост энтерококков достигает максимума через 36 — 48 часов при 37°. Температурные границы роста колеблются от 10° до 50° в зависимости от вида энтерококков.

На плотных питательных средах энтерококки образую мелкие округлые колонии. При росте в жидких средах они вызывают их диффузное помутнение и образование аморфного осадка.

Энтерококки устойчивы к многим красителям (кристалл-виолету, фуксину и др.) и антибиотикам (пеницеллину, стрептомицину, полимиксину и др.).

В мазках из жидких сред энтероккоки располагаются в виде коротких и длинных цепочек, в плотных — в виде диплококков или скоплении кокков. Красятся по Граму положительно. Спор и капсул не образуют. Как правило, неподвижны, но описаны и подвижные варианты с 1 — 4 жгутиками. Резко полиморфны. Полиморфизм особенно выражен у культур, выделенных из пищевых продуктов.

В серологическом отношении энтерококки представляют собой довольно однородную группу микроорганизмов, обладающих полисахаридным антигеном «Д» по Ленсфильд. У штаммов Str. faecalis и его вариантов отмечено наличие видового антигена, который по своей химической природе является термоустойчивым полисахаридом.

Для всей группы энтерококков характерны устойчивость к 40% желчи, 6,5%

хлористого натрия и высокому pH (9,6 — 10,2). Все они не ферментируют

рафинозу и не разлагают перекись водорода (H O ), т.к. не вырабатывают

2 2

фермент-каталазу.

Шермен (1937) предложил для групповой дифференциации энтерококков набор тестов, известных в литературе как тесты «Шермена», температурные границы роста от 10° до 45°; рост при pH 9,6; рост в желчи или в 40% желчном бульоне; рост в молоке с 0,1% метиленового синего; терморезистентность (выдерживают 60° в течение 30 минут).

Внутри группы основные виды энтерококков и их разновидности также отличаются по биохимическим признакам. Так, Str. faecalis и его варианты в отличие от Str. faecium и его варианта разлагают теллурит калия и 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (2,3,5-ТТХ), причем штаммы Str. faecalis var. liquefaciens вызывают разжижение желатина и пептонизацию молока, а Str. faecalis var. zymogenes — гемолиз эритроцитов и некоторые штаммы разжижение желатина.

Свежевыделенные из любого источника штаммы энтерококков, обладающие

протеолитическими свойствами, проявляют свои энтеропатогенные свойства,

6

если попадают в организм людей в количествах, составляющих 10 и более

живых клеток в 1 г/мл продукта.

Энтерококки являются облигатными представителями нормальной микрофлоры

кишечника человека и теплокровных животных, в связи с чем очень широко

распространены во внешней среде, в том числе и в различных пищевых

продуктах, но особенно часто их обнаруживают в молочных продуктах.

Органолептика продуктов зависит от вида энтерококка, обсеменяющего

продукт. Так, штаммы Str. faecium и его варианта не изменяют органолептику

мясных продуктов, а молоко свертывают и придают ему приятный вкус

кисломолочного продукта. Штаммы же энтерококков, которые могут вызывать

пищевые отравления, придают продуктам неприятный горький вкус и

ослизнение, но органолептические изменения в продуктах наступают, когда в

6

них содержится более чем 10 клеток энтерококков в 1 грамме.

При лабораторной диагностике энтерококковых пищевых отравлений исследованию следует подвергать продукты, заподозренные как причина заболевания, и испражнения пострадавших. Отбор и подготовку материалов для бактериологического исследования проводят, как описано выше в настоящей Инструкции.

Бактериологические исследования

Первый день

Из подготовленных к исследованию материалов (продукты, кал) готовят

-7 -4

десятикратные разведения (продукты до 10 , кал до 10 ) на 0,1% пептонной

воде. Из каждого разведения берут по 0,1 мл и высевают на подсушенную

поверхность питательной среды Пейкера (кристалл-виолетазид — кровяной агар)

или Г.П. Калины (молочно-ингибиторная среда). Высеянный материал тщательно

втирают шпателем в поверхность сред. Посевы инкубируют в термостате при

температуре 37° в течение 48 часов.

Третий день

Через 48 часов посевы просматривают. Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5 — 2 мм и фиолетовую окраску на коричнево-красном фоне среды Пейкера или красную с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды Калины. Подсчитывают все типичные колонии и число их пересчитывают на 1 г/мл продукта. 3 — 5 колоний отсевают на скошенный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы культивируют при 37° в течение 24 часов.

Четвертый день

Из роста на скошенном агаре готовят мазки и красят их по Граму.

Одновременно определяют каталазную активность штаммов. Для чего на

очищенное обезжиренное стекло наносят каплю 1% водного раствора перекиси

водорода (H O ) и в ней растирают петлю культуры, если пузырьки

2 2

газа не выделяются, значит реакция отрицательная. Грамположительные,

каталазоотрицательные диплококки изучают по шести тестам Шермена. Для

ускорения дифференциации набор тестов можно сократить и культуры высеять

только на бульоны, содержащие 40% желчи и имеющие pH 9,6. Одновременно для

видовой дифференциации культуры высевают на среды, содержащие теллурит

калия, 2,3,5-ТТХ, кровь, молоко, сорбит, маннит и рафинозу; если штаммы

были сняты с молочно-полимиксинового агара, то для видовой дифференциации

их высевают на все те же среды, за исключением сред, содержащих молоко и

2,3,5-ТТХ, т.к. эти ингредиенты входят в пропись среды выделения. Все

посевы помещают в термостат на 37° на 24 часа.

Пятый день

Через 24 часа посевы просматривают и результаты записывают в виде таблицы:

┌─────────────────────────┬───────────────────────────────────────────────┐

│Дифференциальные признаки│ Виды энтерококков │

│ ├─────────┬────────────┬─────────┬───────┬──────┤

│ │ Str. │ Str. │ Str. │ Str. │ Str. │

│ │faecalis │liquefaciens│zymogenes│faecium│durans│

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│рост при 40,0% желчи │+ │+ │+ │+ │+ │

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│рост при pH 9,6 │+ │+ │+ │+ │+ │

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│редукция теллурита калия │+ │+ │+ │- │- │

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│редукция 2,3,5-ТТХ │+ │+ │+ │- │- │

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│пептонизация молока │- │+ │+/- │- │- │

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│гемолиз эритроцитов │- │- │+ │- │+/- │

├─────────────────────────┼─────────┼────────────┼─────────┼───────┼──────┤

│ферментация │ │ │ │ │ │

│сорбита │+ │+ │+ │- │- │

│маннита │+ │+ │+ │+ │- │

│рафинозы │- │- │- │- │- │

└─────────────────────────┴─────────┴────────────┴─────────┴───────┴──────┘

Примечание. С выделенными штаммами энтерококков можно ставить реакцию преципитации в пробирках с группой «Д» антисывороткой, если таковая имеется в распоряжении.

Диагноз энтерококкового пищевого отравления подтверждается, если в

инкриминируемом продукте и кале больных были обнаружены протеолитические

6

штаммы энтерококков в количествах более чем 10 в 1 г/мл продукта и более

4

чем 10 в грамме кала при типичной клинической картине заболевания.

СПОРОНОСНЫЕ АНАЭРОБЫ — CL. BOTULINUM

Общие сведения

Ботулизм — тяжелое пищевое бактериальное отравление с высокой летальностью — представляет собой относительно редкое заболевание.

Во всех странах ботулизм связан, главным образом, с продуктами домашнего приготовления, заготовленными впрок. Общепринятые в домашних условиях способы обработки пищевых продуктов, такие как консервирование в банках, копчение, маринование, соление и др., не приводят к уничтожению возбудителей ботулизма и их спор и при длительном хранении в этих продуктах может образоваться токсин.

Возбудители ботулизма широко распространены в природе. Этот микроб был обнаружен в почве, в навозе, на фруктах и овощах, в рыбе, в фураже, в экскрементах теплокровных животных. Широкое распространение возбудителей ботулизма в почве неизбежно ведет к попаданию этих микробов на овощи и фрукты, а также к обсеменению различного сырья, идущего для приготовления консервов, колбас и других продуктов. Интенсивность заражения зависит от санитарных и технологических условий обработки и хранения продуктов.

Ботулизм у людей могут вызвать все шесть известных типов возбудителей ботулизма, однако три типа — A, B, E — встречаются чаще при случаях пищевых отравлений у людей, типы C, D, F обнаружены только в единичных вспышках.

Cl. botulinum типов A, B, C, D, E, F очень близки по морфологии, культуральным свойствам и по действию их токсинов на организм человека и животных. Все они дают одинаковую клиническую картину болезни. Указанные типы ботулинического микроба отличаются по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов. Это значит, что токсин каждого типа нейтрализуется сывороткой того же типа.

По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки длиной от 4 до 9 мю и шириной от 0, 6 до 0,9 мю с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры: палочки со спорой имеют вид теннисной ракетки. Эти микробы легко окрашиваются различными анилиновыми красками. Молодые клетки окрашиваются по Граму положительно. При старении культуры (через 4 — 5 суток роста) палочки окрашиваются грамотрицательно. Микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков. Капсулы они не образуют.

Возбудители ботулизма — строгие анаэробы, они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы либо в герметически закрытых банках консервов. В настоящее время установлено, что возбудители ботулизма типа E, а также непротеолитические штаммы типа B и некоторые штаммы типа F образуют на питательных средах и в пищевых продуктах кроме токсина и нетоксичный <…> токсина — протоксин, который, не убивая <…> при парентеральном введении, проявляет свою биологическую активность при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных в результате воздействия на него протеолитических ферментов.

При добавлении протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) in vitro также происходит активация протоксина, который переходит в токсин. Этот феномен следует учитывать при проведении лабораторной диагностики ботулизма.

Нередко консервные банки, куда вместе с продуктами попадает и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако часто при наличии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят совершенно доброкачественными и консервные банки не дают «бомбажа». Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла. Наиболее подходящей температурой для роста бактерий типов A, B, C, D является температура 35°, для типов E и F — 28, 30°.

Ботулинические токсины довольно устойчивы к температурным воздействиям. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10 — 15 минут и не разрушается в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Лабораторная диагностика ботулизма преследует цель обнаружения ботулинического токсина или возбудителя ботулизма в пищевых продуктах, которые вызвали отравление, а также в материалах, взятых от больного или в органах из трупов. При этом важно установить не только присутствие токсина или микроба, но и определить их тип, для того чтобы подтвердить клинический диагноз и назначить правильное лечение.

Бактериологические исследования

Первый день

Пробы, поступившие в лабораторию, исследуют одновременно по двум направлениям: производят обнаружение ботулинических токсинов и ботулинических микробов. Две трети предварительно подготовленной, как указано выше, пробы предназначают для обнаружения ботулинических токсинов, одна треть — для посевов с целью обнаружения ботулинических микробов.

Часть пробы, которую исследуют на наличие токсинов, выдерживают в течение 1 — 1,5 часа при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 2500 — 3000 об./мин. в течение 15 — 20 минут. Фильтрование через тальковый фильтр недопустимо, т.к. тальк адсорбирует на себе ботулинические токсины.

Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или надосадочной жидкостью ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксической сывороткой.

Обнаружение ботулинических токсинов в реакции нейтрализации

Для обнаружения токсинов следует взять для каждой пробы 4-х мышей весом 16 — 18 грамм. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один или несколько типов ботулинических токсинов, предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типа A, B, C, E, F <*>. С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах:

для типа A — 200 — 400 МЕ;

для типа B — 100 — 200 МЕ;

для типа C — 200 — 300 МЕ;

для типа E — 200 — 400 МЕ;

для типа F — 50 — 100 МЕ.

———————————

<*> Диагностическая сыворотка типа F в ближайшее время будет выпущена наравне с сыворотками типов A, B, C, E.

Доза сыворотки, которую рекомендуют для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также в экстрактах из пищевых продуктов очень сильные токсины почти не встречаются.

Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.

Для постановки реакции нейтрализации готовят смесь из равных объемов моновалентных сывороток типов A, B, C, E, F. Сыворотки каждого типа необходимо набирать разными пипетками.

Из каждой исследуемой пробы наливают в две пробирки равное количество (1,5 — 2,4 мл) фильтрата или надосадочной жидкости. Остаток сохраняют в холодильнике для дальнейших исследований. В одну пробирку (контроль) добавляют 0,6 мл физиологического раствора, в другую (опыт) — 0,6 мл смеси моновалентных сывороток.

Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут, после чего содержимое каждой пробирки вводят в объеме 0,7 — 1,0 мл двум белым мышам. Исследуемый материал из каждой пробирки следует вводить разными шприцами или сначала контроль, а затем опыт.

Наблюдение за животными проводят в течение 4-х дней, однако если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставят реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками. Ботулинический токсин не дает молниеносной гибели животных (в течение нескольких минут или секунд), мыши погибают не ранее чем через 4 — 5 часов.

При наличии ботулинического токсина погибают две мыши контрольные, которым вводили несмешанный с сыворотками фильтрат, опытные мыши остаются живы.

Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.

В случае гибели всех 4-х мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).

Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250 — 300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток A, B, C, E, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или надосадочной жидкости), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.

В 6 пробирок разливают по 2,4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа A, во вторую — типа B, в третью — типа C, в четвертую — типа E, в пятую — типа F, в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Все сыворотки наливают разными пипетками. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки отдельными шприцами (см. типовой протокол).

Учет результатов проводится через 4 — 6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4-х дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки N 1, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа A.

Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как ее обычно бывает мало. Следует тщательно отделить сыворотку от сгустка крови, который необходимо посеять, так как при ботулизме можно обнаружить в крови палочку ботулизма, а с сывороткой поставить реакцию нейтрализации. В этом случае следует сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками только типов A, B, E, т.к. остальные типы ботулинических палочек встречаются очень редко. Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа A — 0,4 мл, во вторую — типа B, в третью — типа E. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного, контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.

ТИПОВОЙ ПРОТОКОЛ ПОСТАНОВКИ РАЗВЕРНУТОЙ

РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

┌───────────────┬────────────────┬────────────────────────┬───────────────┐

│ │ Исследуемый │ Антиботулинические │Физиологический│

│ │ материал в мл │ сыворотки в мл │ раствор в мл │

│ │ ├────┬────┬────┬────┬────┤ │

│ │ │тип │тип │тип │тип │тип │ │

│ │ │ A │ B │ C │ E │ F │ │

├───────────────┼────────────────┼────┼────┼────┼────┼────┼───────────────┤

│1 пробирка │2,4 │0,6 │- │- │- │- │- │

│2 пробирка │2,4 │- │0,6 │- │- │- │- │

│3 пробирка │2,4 │- │- │0,6 │- │- │- │

│4 пробирка │2,4 │- │- │- │0,6 │- │- │

│5 пробирка │2,4 │- │- │- │- │0,6 │- │

│6 пробирка │2,4 │- │- │- │- │- │0,6 мл │

└───────────────┴────────────────┴────┴────┴────┴────┴────┴───────────────┘

При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дают заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывают его тип.

Нередко постановку реакции нейтрализации как с поливалентной, так и с моновалентной сыворотками приходится повторять из-за неспецифической токсичности посторонней микрофлоры, которая обычно имеется в рвотных массах, кале, органах трупов, поэтому в лучшем случае ответ о наличии токсина в пробе может быть дан на 2 — 3 день, а о его типовой принадлежности на 3 — 5 день от начала исследования.

В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа E нейтрализует также ботулинический токсин типа F, и наоборот. Поэтому при получении положительной реакции нейтрализации одновременно с противоботулиническими сыворотками типа E и F следует провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу E или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа E и типа F, разведенными до концентрации 1 МЕ/мл. Удобнее всего для этих целей использовать стандартные противоботулинические сыворотки, выпускаемые ГКИ им. Тарасевича. Для этого в три пробирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа E, во вторую — 0,6 мл типа F, разведенных до концентрации 1 ME/мл, в третью — контрольную — 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа E, то в экстракте имеется токсин типа F. Если наряду с контролем погибают мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой типа E, то в экстракте токсин типа E.

Обнаружение возбудителей ботулизма

Первый день

Для обнаружения возбудителей ботулизма производят посев 3 — 5 мл из 1/3 предварительно подготовленного материала на жидкие питательные среды. Для первичных посевов лучше использовать казеиново-грибную или казеиново-кислотную среду, бульон Хоттингера или среду типа Тароцци. Необходимо, чтобы pH был в пределах 7,2 — 7,4. Обязательным является также наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиновых — отварного пшена и ваты. Пробирка или флакон должны быть заполнены питательной средой не менее чем наполовину. Перед посевом среды нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут, после чего быстро охлаждают, добавляют 0,5% глюкозы и производят посев.

Посевы должны производить в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100 — 200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной в 0,5 см. Лучше засевать исходный посевной материал в большой объем среды (70,0 — 150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватило на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нейтрализации, нередко с двух- или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, по-видимому, из-за бурного роста посторонней микрофлоры.

Посев следует производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60° 15 минут. В этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры Cl. botulinum типа E, которые погибают при 80°; другой флакон прогревают при 80° 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60°, инкубируют при 28°, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35°. Первые два флакона исследуют на Cl. botulinum типов E и F, вторые два флакона на Cl. botulinum типов A, B, C.

Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образом, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. Рост Cl. botulinum характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша.

После посева все исходные образцы проб следует сохранять на леднике до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.

В настоящее время есть сообщение зарубежных ученых о том, что для выявления Cl. botulinum типа E в среду перед посевом следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления Cl. botulinum типа E из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положительный результат лишь в 17% проб.

Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15 — 20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через асбестовые стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавить из расчета 1 мл 1-процентного раствора трипсина на 10 мл среды во флаконы, которые будут инкубироваться при 28°. В тот флакон, который предварительно прогревается, трипсин добавить после прогревания.

Третий день

Через 48 часов от начала роста из всех флаконов с соблюдением стерильности берут пробы культуральной жидкости (по 10 — 15 мл) и подвергают их исследованию. Предварительно готовят мазки, красят их по Граму или краской для анаэробов и микроскопируют.

С культуральной жидкостью ставят реакцию нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов A, B, C, E, F, как это описано для определения токсинов. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно.

При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum, а также ботулинического токсина дают заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма и наличии в нем ботулотоксина. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

Если в посевах обнаруживают микробы, по морфологии сходные с Cl. botulinum, а токсин отсутствует, то следует перед постановкой реакции нейтрализации провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином для обнаружения ботулинических токсинов типа E, непротеолитичных штаммов типа B и некоторых штаммов типа F, а также провести выделение и изучение чистых культур. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулиническими сыворотками проводят только в том случае, если в среду перед посевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.

Если через двое (48 час.) суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжить инкубацию посевов в термостате, а исследование провести вновь на 4 — 6 — 10 сутки. Если исследования, проведенные на 10 сутки, не дали положительных результатов по обнаружению возбудителей ботулизма и их токсинов, то выдают ответ об отсутствии ботулинических палочек и их токсинов в исследуемых материалах.

Для выделения чистых культур ботулинических палочек применяют прозрачный одно- или полуторапроцентный агар с глюкозой, приготовленный на мартеновском бульоне или бульоне Хоттингера, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15 — 18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45 — 50°. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал (чаще это первичный посев материала исследуемого) и переносят последовательно из пробирки в пробирку, тщательно перемешивая, после чего агар перемешивается еще раз путем перекатывания пробирок между двумя ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35 — 37°. На каждый посев следует брать 5 — 8 пробирок столбика агара. Если в первичной культуре рост не очень обильный, при пересеве на высокий столбик пастеровскую пипетку следует обломать и набрать немного культуры в капилляр, а затем проводить посев, как указано выше.

Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5 — 10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80° 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.

Через 1 — 2 суток в последних пробирках появляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии перевивают на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшуюся часть колонии микроскопируют.

Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами:

1. Столбик агара прокалывают сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекают нужную колонию.

2. Дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревают на пламени горелки; под действием паров закипевшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительную колонию извлекают отломанным капилляром пастеровской пипетки.

Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.

Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного или печеночного агара, разлитого толстым слоем (приблизительно 3 — 5 мм) в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2 — 3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат (различных марок) крышкой кверху и выращивают при температуре 35 — 37°.

С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1 — 0,2 см, окруженные зоной гемолиза.

Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении Cl. botulinum особенно типа E из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на устойчивости спор палочки ботулизма к 50% спирту.

К 2 мл культуральной жидкости 2 — 3-дневной инкубации при 28°, содержащей ботулинический токсин типа E, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2 — 3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50° агара). Через 48 часов инкубации при 35° в анаэростате, среди колоний посторонней микрофлоры, Cl. botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Следует отметить, что некоторые спорогенные анаэробы (Cl. sporogenes и др.) также имеют вокруг колоний «жемчужный пояс». Эти колонии высевают в пробирки со средой типа Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры Cl. botulinum типа E.

При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов.

Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп МБС-1. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.

С поверхности чашки колоний снимают петлей или пастеровской пипеткой и засевают на пробирки со средой типа Тароцци с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяют на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем постановки реакции нейтрализации на мышах.

Метод активации прототоксина Cl. botulinum

Активацию прототоксинов производят в экстрактах из пищевых продуктов, промывных вод желудка и рвотных масс, а также культуральной жидкости посевов, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.

Чистый сухой трипсин растворяют перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1:100 (1-процентный раствор); этот раствор принимают за исходный. Для активации берут данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.

Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовят следующим образом: 4 г панкреатина растворяют в 100 мл физиологического раствора и оставляют в холодильнике при 4° в течение ночи. Перед употреблением полученную жидкость фильтруют через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластинку фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Готовый раствор панкреатина может сохраняться при 4° в течение двух недель.

Исследуемую 4 — 5-суточную культуру, полученную на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергают центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.

Готовый раствор трипсина добавляют из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1%, для чего на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1% раствора трипсина.

Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральную жидкость смешивают в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.

Полученные смеси помещают в термостат при 37° на один час. По истечении указанного срока в активированной жидкости определяют наличие ботулотоксина на белых мышах путем постановки реакции нейтрализации.

Для обнаружения <…> ряд других методов, каждый из которых может быть только ориентировочным и должен всегда подтверждаться реакцией нейтрализации на мышах. Это — реакция непрямой гемагглютинации или бентонитовой флокуляции, реакция подавления фагоцитоза, реакция двойной диффузии в теле и, наконец, люминесцентно-серологический метод для обнаружения возбудителей ботулизма.

Однако, как правило, все перечисленные методы дают положительный результат в руках авторов и только с чистыми штаммами и их токсинами. Эти методы недостаточно специфичны ввиду наличия общих самотических и нетоксичных растворимых антигенов у возбудителей ботулизма и микроорганизмов группы Cl. sporogenes и Cl. putrificum. Кроме того, эти реакции не выявляют степени токсичности фильтрата. В силу вышесказанного ни один из указанных методов не применяется как общепринятый ни в одной стране. Только биологическая проба на белых мышах в реакции нейтрализации с типоспецифическими противоботулиническими сыворотками является общепринятым методом в СССР, США, Канаде, Японии, Франции и других странах. Этот метод принят и международной ассоциацией микробиологов.

СПОРОНОСНЫЕ АНАЭРОБЫ — CL. PERFRINGENS

Общие сведения

В настоящее время известно, что Cl. perfringens типов A, B, C, D, E вызывают ряд заболеваний человека и животных. Установлено, что причиной пищевых токсикоинфекций у людей могут быть Cl. perfringens типов A и C, из которых лучше изучены пищевые отравления, обусловленные штаммами типа A. Роль Cl. perfringens типов B, D, E в патологии людей мало изучена. Однако в связи с тем, что они вызывают тяжелые энтеротоксемии у мелкого и крупного скота, а также у птиц, можно предполагать их этиологическое значение при пищевых отравлениях у людей, в случае употребления в пищу мяса животных, обсемененных штаммами типов B, C, D, E, вырабатывающими летальные, некротические и гемолитические токсины (, r, i).

В настоящее время установлено, что при пищевых токсикоинфекциях,

вызываемых Cl. perfringens типа A основную роль в патогенезе заболевания

играет энтеротоксин, вырабатываемый in vivo спорулирующими клетками этих

микроорганизмов, которые попадают в желудочно-кишечный тракт при

6

интенсивном обсеменении пищевых продуктов (10 и более в мл/г) указанными

бактериями.

<…> (не менее 0,4 атм), представляют собой крупные, грамположительные палочки, обладающие способностью к полиморфизму, неподвижные. Образуют центральные или субтерминальные споры, которые у некоторых штаммов типов A и C могут выдерживать кипячение от 1 до 6 часов. Оптимальная температура для культивирования Cl. perfringens находится в пределах 37 — 45°, однако активный синтез токсинов ( i) происходит при температуре 37°. Рост культуры на жидких питательных средах сопровождается бурным газообразованием. На плотных питательных средах Cl. perfringens образует различные формы (S, M, R) бесцветных колоний, которые на агаре с кровью обычно окружены зоной гемолиза, на агаре с желтком — зоной перламутрового проципитата разной интенсивности. На среде Вильсона — Блер выросшие колонии имеют интенсивный черный цвет.

Клетки Cl. perfringens вызывают сбраживание лакмусового молока, сопровождающееся просветлением сыворотки и образованием сгустка кирпично-красного цвета. Ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, галактозу. Не сбраживают маннит и дульцит. В тканях человека и животных, а также на искусственных питательных средах Cl. pefringens типов A, B, C, D, E могут вырабатывать летальные, некротические и гемолитические токсины, которые нейтрализуются типовыми, специфическими, антитоксическими сыворотками.

Cl. perfringens типов D и E вырабатывают прототоксины (подобно Cl. botulinum типов B, E и F), способные переходить в активные токсины под влиянием протеолитических ферментов. Бактерии вида Cl. perfringens (особенно типа A) широко распространены в окружающей среде (почва, вода, пищевые продукты и т.д.), присутствуют в содержимом кишечника людей и животных.

Пищевые отравления чаще имеют место после употребления готовых мясных блюд, а также продуктов растительного происхождения, которые оказываются значительно обсемененными клетками Cl. perfringens типа A в результате нарушения правил приготовления и хранения пищи.

Бактериологические исследования

В пищевых продуктах и материале от больного (исключая кровь) определяют: 1) наличие бактерий Cl. perfringens и массивность обсеменения этими микроорганизмами; 2) наличие токсигенных штаммов Cl. perfringens типов A, B, C, D, E.

В крови больного с явлениями анаэробного сепсиса и материалах от трупа определяют: 1) наличие Cl. perfringens типов A, B, C, D, E и их специфических токсинов.

Первый день

Из подготовленных к исследованию материалов (пищевые продукты, рвотные

-10

массы, испражнения и др.) готовят разведения 0,1% пептонной водой до 10 .

По 1 мл материала из соответствующих разведений переносят в расплавленную и охлажденную до 45° среду Вильсона — Блер, разлитую по 8 — 9 мл в пробирки. Можно также использовать кровяной или желточный агары в чашках. Для этого 1 мл каждого разведения добавляют в 15 мл охлажденного до 45° агара, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания смеси заливают дополнительно стерильным, охлажденным до 45° 2% мясопептонным агаром, слоем не менее 2 мм. Инкубируют 6 — 8 часов в термостате при 45 — 46° или 20 часов при 37°.

Кроме того, гомогенаты исследуемых материалов засевают в объеме 10 — 15 мл на любую из жидких сред, разлитых по 70 мл во флаконы <*>.

———————————

<*> В качестве жидких сред можно применять среду Китт-Тароцци, казеиново-грибную среду ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, АКЖ (автолизат кильки с желатиной), КПД (китовопеченочно-дрожжевой гидролизат).

Каждый образец материала (исключая кровь) вносят в 2 флакона одинаковой среды, один флакон с посевом прогревают при 80° 20 минут, а другой — не прогревают, затем оба флакона инкубируют при 37°. В условиях прогревания обычно погибает посторонняя микрофлора и часть анаэробов, находящихся в вегетативной форме. Сохраняются споры Cl. perfringens, которые в этих условиях активно прорастают. В выросших культурах из прогретых посевов в ряде случаев может находится только Cl. perfringens, т.е. чистая культура этих бактерий. Кровь в случае бактериемии, взятая стерильно, будет содержать только вегетативные клетки Cl. perfringens. Поэтому посев крови производится без прогревания.

Интенсивное газообразование, которое свидетельствует об активном росте культуры, может наблюдаться через 3 — 6 часов после посева материала, доставленного не позже суток. В этом случае следует проводить бактериологические и токсикологические анализы в первый день исследования. При отсутствии активного роста через 6 — 8 часов посевы инкубируют при 37° в течение 18 — 20 часов.

Второй день

В посевах на среде Вильсона — Блер производят подсчет черных колоний,

где имеется от 10 до 30 колоний, или на чашках, где содержится от 20 до 100

колоний с зоной гемолиза, или с зоной опалесценции. Умножают количество

колоний на разведение материала в этой пробирке или чашке Петри. Так, если

в 6 пробирке или чашке содержится 30 характерных колоний, обсемененность

6

одного грамма или одного мл исходного материала будет составлять 30 x 10 .

Делают мазки из 3 — 5 характерных колоний, окрашивают краской для

анаэробов или по Граму. Кроме того, 2 — 4 колонии пересевают на лакмусовое

молоко и 3 — 5 колоний — на любые из мясных сред в пробирках для

получения чистой культуры.

Определение токсинов следует проводить через 3 — 6 часов после посева материала на жидкие среды при появлении признаков начала роста культуры (см. первый день исследования) или на вторые сутки, если посевной материал вырастает только через 18 — 20 часов инкубирования. Из культур на жидких средах, где отмечен рост с газообразованием, готовят мазки, окрашивают по Граму или краской для анаэробов. Те посевы, в которых обнаруживают грамположительные палочки, похожие по морфологии на Cl. perfringens, проверяют на присутствие специфических токсинов Cl. perfringens типов A, B, C, D, E методом реакции нейтрализации с диагностическими сыворотками Cl. perfringens типов A, B, D, E на белых мышах весом 16 — 18 г <*>.

———————————

<*> Сыворотка типа B нейтрализует токсины типа B и типа C.

Сухие противоперфрингенс сыворотки перед употреблением разводят дистиллированной водой. В каждую ампулу с сухой сывороткой добавляют по 1 мл воды, при легком встряхивании сыворотка полностью растворяется. Затем сыворотки A, B, D, E разводят в 10 раз физиологическим раствором и в разведенном виде применяют для постановки реакции нейтрализации.

Постановка реакции нейтрализации

Из флаконов в стерильных условиях отбирают по 8 — 10 мл культуральной жидкости. Оставшуюся культуру во флаконах хранят при температуре 4 — 10° до окончания исследования. После центрифугирования при 3000 — 5000 об./мин. в течение 30 мин. в надосадочной жидкости должны находиться токсины Cl. perfringens.

Первоначально ставят реакцию нейтрализации токсина в исследуемой жидкости с сывороткой Cl. perfringens типа A. Для этого в 2 пробирки вносят по 1,5 мл надосадочной жидкости. Затем в 1 пробирку добавляют 0,75 мл антитоксической сыворотки типа A, во 2-ю контрольную — 0,75 мл физиологического раствора. Смесь выдерживают 30 минут при 37°, затем вводят по 0,75 мл в хвостовую вену 2-м белым мышам весом 16 — 18 г. Сначала вводят смесь из контрольной пробирки, затем тем же шприцом — смесь из опытной пробирки. Реакцию учитывают через сутки.

Третий день

1. Просматривают пробирки с посевами на лакмусовом молоке. Появление характерного сбраживания с просветлением сыворотки и образованием сгустка кирпичного цвета является дополнительным подтверждением того, что колонии черного цвета, а также колонии с зонами гемолиза и преципитата на плотных средах, определяющие обсемененность исследуемого материала, относятся к Cl. perfringens. Учитывают реакцию нейтрализации. Если контрольные мыши пали, а получившие смесь токсина с сывороткой типа A — живы, следует дать заключение, что в исследуемом материале обнаружен Cl. perfringens типа A, активностью не менее 3 Дlm/мл (для белой мыши) и закончить исследование.

В том случае, если контрольные мыши и получившие смесь токсина с сывороткой типа A пали, следует ставить развернутую реакцию нейтрализации с сыворотками Cl. perfringens типов B, D, E. Для выявления штаммов типов D и E следует проводить активацию протеолитическими ферментами неактивных прототоксинов, вырабатываемых штаммами типов D и E. Способ приготовления рабочих растворов протеолитических ферментов изложен в разделе «Лабораторная диагностика ботулизма».

Приготовленный 4% рабочий раствор панкреатина добавляют к надосадочной жидкости в соотношении 1 мл панкреатина к 3 мл надосадочной жидкости.

Для активации также можно пользоваться трипсином: для этого 1% рабочий раствор трипсина добавляют к надосадочной жидкости до концентрации 0,1% (на 1 мл надосадочной жидкости берут 0,1 мл рабочего раствора трипсина).

Смесь токсина с ферментом помещают в термостат при 37° на 1 час, после чего разводят в 3 раза и ставят развернутую реакцию нейтрализации с культуральной жидкостью после активации ферментами для обнаружения токсинов типов D и E.

Кроме того, ставят реакцию нейтрализации с неактивированной культуральной жидкостью, разведенной в 2 раза для выявления токсинов типов B и C.

Метод постановки развернутой реакции нейтрализации

В пять пробирок разливают исследуемую надосадочную жидкость: в первую и вторую пробирки — по 1,5 мл без активации, в третью, четвертую и пятую — по 1,5 мл жидкости после активации. Добавляют по 0,75 мл антитоксические диагностические сыворотки: в первую пробирку — типа B, в третью — типа D и четвертую — типа E (все сыворотки разливают разными пипетками).

Вторая и пятая пробирки являются контрольными на присутствие токсинов, в них добавляют по 0,75 мл физиологического раствора.

Смеси выдерживают 30 минут при 37° и вводят внутривенно по 0,75 мл двум белым мышам из каждой пробирки. Для каждой пробы берется отдельный шприц.

СХЕМА РАЗВЕРНУТОЙ РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

┌──────┬───────────────────────────┬─────────────────┬────────────────────┐

│N про-│ Надосадочная жидкость │ Сыворотка │ Физиологический │

│бирок │ │ антиперфрингенс │ раствор контроль │

│ │ ├─────┬─────┬─────┤ │

│ │ │типа │типа │типа │ │

│ │ │ B │ D │ E │ │

├──────┼───────────────────────────┼─────┼─────┼─────┼────────────────────┤

│1 │1,5 мл без активации │0,75 │ │ │ │

│2 │1,5 мл без активации │ │ │ │0,75 │

│3 │1,5 мл после активации │ │0,75 │ │ │

│4 │1,5 мл после активации │ │ │0,75 │ │

│5 │1,5 мл после активации │ │ │ │0,75 │

└──────┴───────────────────────────┴─────┴─────┴─────┴────────────────────┘

Результаты учитывают через сутки. При наличии токсинов Cl. perfringens гибнут мыши, получившие раствор из контрольной пробирки. Выживают мыши, получившие смесь токсина с гомологичной сывороткой. Так, если в исследуемом материале находится токсин типа B или типа C, выживут мыши, получившие смесь исследуемой культуры с сывороткой типа B, контрольные мыши падут. При обнаружении токсина, нейтрализующегося сывороткой типа B, следует считать, что в исследуемом материале содержится Cl. perfringens типа B либо типа C. Для дальнейшей идентификации необходимо культуру пересеять в агаровый высокий столбик и направить в ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР по адресу: Москва Д-98, ул. Гамалеи, д. 18, ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, лаб. раневых инфекций.

Присутствие одного из токсинов типов B, C, D, E в исследуемом материале в сочетании с характерной клинической картиной дает основание считать, что пищевая токсикоинфекция вызвана штаммами одного из указанных типов Cl. perfringens.

Выделение чистой культуры

Чистую культуру Cl. perfringens необходимо выделять и исследовать в случае нечеткого результата реакции нейтрализации, при наличии в первичных посевах исследуемого материала (т.е. во флаконах) смешанной культуры, где, наряду с Cl. perfringens, присутствует посторонняя микрофлора.

Чистую культуру Cl. perfringens можно получить путем пересева на мясные среды в пробирках отдельных характерных колоний (черные на среде Вильсона — Блер, а также окруженные зоной гемолиза, или перламутрового преципитата — на кровяном или желточном агарах). Колонии на плотных средах вырастают на 2-й день исследования при изучении обсемененности материала. Колонии, характерные для Cl. perfringens, высевают (по 3 — 5 колоний из посева каждого образца исследуемого материала) на мясные среды в пробирках (см. 2-й день исследований).

Через 18 — 20 часов в выросших посевах определяют методом микроскопирования наличие однородной культуры с морфологией, характерной для Cl. perfringens. Пробирки с культурами хранят при 4 — 10° и используют в дальнейшем для изучения чистой культуры.

Для выделения чистой культуры из трупного материала, который не изучается на обсемененносгь Cl. perfringens, следует использовать культуры первичных посевов во флаконах (см. 2-й день исследования, определение токсинов). Для выделения отдельных колоний используют среду Вильсона — Блер, а также кровяной или желточный агары в чашках Петри, куда стерильно вносят 1 — 2 капли культуры, затем производят рассев на 2 — 3 чашки шпателем.

Посевы в чашках Петри выращивают в анаэростатах в течение 1-х суток при 37°. Выросшие отдельные колонии пересевают на мясную среду в пробирках.

Для определения типовой принадлежности выделенных штаммов Cl. perfringens посевной материал из пробирок с мясной средой пересевают в объеме 2 — 3 мл на одну из жидких питательных сред во флаконах.

В выросшей культуре устанавливают присутствие специфических токсинов Cl. perfringens методом реакции нейтрализации с типовыми антитоксическими диагностическими противоперфрингенс сыворотками типов A, B, D, E (см. 2-й день исследований).

Критерии диагностики

При наличии клинических симптомов заболевания результаты бактериологического исследования подтверждают диагноз пищевой токсикоинфекции, вызванной Cl. perfringens, если получены следующие данные анализа:

6

1. Высокая обсемененность Cl. perfringens (более 10 в 1 г) пищевых

продуктов, вызвавших отравление.

2. Наличие Cl. perfringens типов A или C в посевах исследованных материалов, которое подтверждается реакцией нейтрализации токсинов этих типов на животных.

Эти показатели дают основание считать, что причиной пищевого отравления является Cl. perfringens типа A или типа C.

3. Не исключена этиологическая роль Cl. perfringens типов B, D, E в пищевых токсикоинфекциях человека, поэтому обнаружение в посевах исследуемого материала токсинов Cl. perfringens любого из типов B, D, E свидетельствует о заболевании этой этиологии.

4. Выделение из крови больного штаммов Cl. perfringens любого из типов A, B, C, D или E.

Приложение

РЕЦЕПТУРА

НЕКОТОРЫХ СПЕЦИАЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

И СПОСОБ ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯ <*>

———————————

<*> Сухие среды — Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитный агар (среда Вильсона — Блер), китово-печеночно-дрожжевой гидролизат (КПД), автолизат кильки с желатином (АКЖ) и др., выпускаемые Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред, следует готовить по прописям, указанным на этикетке.

Сухая среда Плоскирева. Среду готовят по прописи, указанной на этикетке.

Каждую новую серию сухой питательной среды следует проверять следующим образом.

Производят посев на чашку 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 100 клеток дизентерийных бактерий (Флекснера или Зонне) и 10000 клеток кишечной палочки. Если среда работает правильно, то через 24 часа инкубации при температуре 37° вырастают единичные брусничного цвета колонии кишечной палочки и единичные прозрачные, бесцветные колонии шигелл.

При полном отсутствии роста кишечной палочки и значительном угнетении роста дизентерийных бактерий уменьшают количество порошка на 0,5 — 2 г на 100 мл среды и заменяют его таким же количеством сухого питательного агара.

При слишком обильном росте кишечной палочки увеличивают навеску порошка на 0,5 — 1 г на 100 мл среды.

Среда Ресселя из сухих питательных сред. На 950 мл дистиллированной воды берут 40 г сухого питательного агара с лактозой и индикатором ВР и 5 г питательного агара. Смесь растворяют при нагревании до кипения. Затем в 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г химически чистой глюкозы и добавляют к приготовленной смеси.

Разливают в стерильные пробирки по 5 — 6 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут. Среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см высотой).

Точно так же приготавливают среду с маннитом, беря за основу сухую среду Ресселя с сахарозой.

Среда «скошенный столбик» с мочевиной из сухих питательных сред. В 100 мл горячей стерильной дистиллированной воды растворяют 4 г сухой среды с лактозой и индикатором ВР, 0,1 г глюкозы и 1 г мочевины.

Полученную среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 15 минут.

Среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик.

Селенитовая среда

Дистиллированная вода 1000 мл

Натрий кислый селенистокислый (NaHSeO ) 4 г

3

Пептон венгерского или чехословацкого производства 5 г

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, безводный (Na HPO ) 7 г

2 4

Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NaH PO ) 3 г

2 4

Лактоза (химически чистая) 4 г

Приготовление:

Раствор N 1

Для приготовления селенитовой среды необходима предварительная подтитровка ее составных частей так, чтобы pH не был выше 7,0 (6,9 — 7,1), что достигается путем изменения соотношения фосфатных солей. Причем подтитровка проводится всякий раз, когда меняется серия любого из входящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).

К приготовленному раствору фосфатных солей в воде (1000 мл) добавляют пептон и лактозу.

Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в течение 2-х дней по 30 минут или при температуре 112° в течение 30 минут.

Раствор N 2

Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10% раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл раствора N 1 добавляют 2 мл 10% раствора кислого селенистокислого натрия.

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 — 7 мл и закрывают плотно пригнанными пробками.

Стерилизация готовой среды не допускается, так как при этом происходит редукция селенита натрия, выпадает красный осадок и среда становится непригодной.

Раствор N 1 может храниться в холодильнике в течение 1 — 2 месяцев.

Примечание:

Если для приготовления среды употребляют фосфаты с кристаллизационной водой, то соотношение их соответственно должно быть изменено.

Среда магниевая

I раствор:

Пептон отечественный 8,4 г

Хлористый натрий (NaCl) 14,3 г

Дрожжевой диализат 40,0 мл

Калий фосфорнокислый (KH PO ) 2,85 г

2 4

Вода дистиллированная 890,0 мл

II раствор:

Хлористый магний крист. (MgCl x 6H O) 71,4 г

2 2

Вода дистиллированная 90,0 мл

III раствор:

0,5% водный раствор бриллиантового зеленого 1,8 мл

После растворения всех ингредиентов растворы соединяют, разливают определенные объемы в колбы, флаконы или пробирки и стерилизуют при 112° 30 минут.

Пропись предусматривает посевы равных объемов исследуемой жидкости и среды обогащения. При исследовании плотного материала в состав среды вводится двойное количество дистиллированной воды.

Среда Мюллера

К 90 мл стерильного бульона добавляют:

а) 4,5 г мела, предварительно взвешенного и простерилизованного сухим жаром.

б) 10 мл раствора гипосульфита (50 г чистого кристаллического гипосульфита в 100 мл дистиллированной воды стерилизуют текучим паром).

в) 2 мл раствора Люголя (металлического йода 25 г, йодистого калия 20 г, дистиллированной воды 100 мл).

При добавлении указанных ингредиентов смесь взбалтывают, разливают по 10 — 15 мл, после чего производят посев.

Среда Кауфмана

Среда Мюллера 1000 мл

Стерильная бычья желчь 50 мл

0,1% водный раствор бриллиантового зеленого 10 мл

Перемешать, разлить в стерильные пробирки.

Среда Раппопорт

Мясопептонный бульон 1000 м

Стерильная бычья желчь 100 м

Глюкоза 20 г

Раствор индикатора

Андредэ 10 мл

Разлить во флаконы с поплавками по 50 мл. Стерилизовать текучим паром три дня по 30 минут.

Трехсахарный агар с мочевиной

Дистиллированная вода 100 мл

Сухой питательный агар 2,5 г

Лактоза 1,0 г

Сахароза 1,0 г

Глюкоза 0,1 г

Мочевина 1,0 г

Железо сернокислое (FeSO x 7H O) 0,02 г

4 2

Гипосульфит натрия (Na S O x 5Н О) 0,03 г

2 2 3 2

0,04% водный раствор фенол-рот 0,04 мл

Все тщательно смешивают и устанавливают pH 7,2 — 7,4. Среду затем разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром 20 минут три дня подряд. После стерилизации среду скашивают. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

Среда Кристенсена

Дистиллированная вода 1000 мл

Лимоннокислый натрий (Na C H O x 5H O) 3 г

3 5 5 7 2

Глюкоза 0,2 г

Дрожжевой экстракт 22 мл

Цистин солянокислый 0,1 г

Фосфорнокислый калий однозамещенный (KH PO ) 1 г

2 4

Хлористый натрий (NaCl) 5 г

Феноловый красный 0,4% водный раствор 3 мл

Агар-агар <*> 15 г

———————————

<*> Для приготовления агаризованных сред используют агар корсаковского завода, японский или Дифко.

Для приготовления среды все соли предварительно растворяют в малых количествах воды. Затем соединяют с агаром и после его набухания кипятят до полного растворения агара, фильтруют и добавляют раствор фенолового красного, pH среды не устанавливают. Среду стерилизуют в течение 15 минут при 120°.

Дрожжевой экстракт для среды Кристенсена

В 1 л воды растворяют 500 г хлебных дрожжей, кипятят в течение 1 часа, после чего фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют в течение 30 минут при 110°. Добавляют 22 мл экстракта на 1 л среды Кристенсена.

Глюкозно-пептонный бульон для определения

ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра

Дистиллированная вода 1000 мл

Пептон 10 г

Хлористый натрий (NaCl) 10 г

Глюкоза

pH — 7,0 — 7,2 10 г

Разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 110° 30 минут.

Среда Дорсе

Готовится из диетических яиц. Скорлупу яиц тщательно обрабатывают спиртом. Содержимое яиц сливают в стерильную колбу с бусами, встряхивают до образования гомогенной массы, добавляют стерильный физиологический раствор из расчета 25 мл на 1 яйцо.

Смесь разливают в стерильные пробирки по 4 — 5 мл и скашивая прогревают в аппарате Коха при 80° в течение 1 часа 2 дня подряд. Среда не подлежит стерилизации.

Трехсахарный агар (для определения сероводорода)

Мясная вода 1000 мл

Дрожжевой экстракт 3 г

Пептон (семипалатинский) 20 г

Хлористый натрий (NaCl) 3,5 г

Лактоза 10 г

Сахароза 10 г

Агар-агар 15 г

Устанавливают pH 7,1 при помощи 20% раствора гидрата окиси натрия, фильтруют и стерилизуют 30 мин. при 120°. Затем добавляют:

Железо сернокислое (FeSO 7H O) 0,2 г

4 2

Гипосульфит натрия (Na S O ) 0,3 г

2 2 3

Глюкоза 1 г

0,2% водный раствор

Феноловый красный 12 мл

Среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 7 мл и стерилизуют текучим паром 20 мин. При скашивании оставляют в нижней части пробирки нескошенный столбик высотой около 2 — 2,5 см.

Агар Клиглера

Мясная вода 1000 мл

Протеозопептон 20 г

Хлористый натрий (NaCl) 5 г

Натрий сернистокислый (Na SO ) 0,4 г

2 3

Гипосульфит (Na S O 5Н O) 0,08

2 2 3 2

Агар-агар 20 г

Кипятят, устанавливают pH 7,8, снова кипятят, фильтруют и затем добавляют следующие реактивы:

Лактоза 10 г

Глюкоза 1 г

Железо сернокислое (Fe SO 7H O) 0,5 г

2 4 2

(растворить предварительно в небольшом количестве воды)

Феноловый красный (0,2% раствор в 50% этиловом спирте) 12 мл

Разливают в бактериологические пробирки и стерилизуют текучим паром 20 мин. При скашивании оставляют в нижней части пробирки нескошенный столбик высотой около 2 — 2,5 см.

Среда с мочевиной (по Преусу)

Стерильный 1,7% питательный агар 1000 мл

на мартеновском бульоне pH 7,0

Глюкоза 5 г

50% раствор мочевины 20 мл

0,2% раствор бромтимолблау 12 мл

Среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 5 — 7 мл и стерилизуют текучим паром 15 мин.

Среда Симмонса

Вода дистиллированная 1000 мл

Аммоний фосфорнокислый двузамещенный (NH ) HPO) 1,5 г

4 2 4

Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH PO) 1 г

2 4

Магний сернокислый (MgSO 7H O) 0,2 г

4 2

Натрий лимоннокислый (Na C H O x 5H O) 3 г

3 6 5 7 2

Агар-агар 20 г

Устанавливают pH 7,2 при помощи 10% раствора гидрата окиси натрия, добавляют 10 мл 0,2% раствора бромтимолблау, разливают в стерильные бактериологические пробирки по 7 мл, стерилизуют 15 мин. при 112°.

Среда с фенилаланином

Дистиллированная вода 1000 мл

Дрожжевой экстракт 3 г

dl — фенилаланин 2 г

(или 1 — фенилаланин) 1 г

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na HPO ) 1 г

2 4

Хлористый натрий (NaCl) 5 г

Агар-агар 12 г

Среду разливают в пробирки по 2 — 3 мл, стерилизуют при 121° в течение

10 минут и сразу после стерилизации скашивают. Тест-реактив — 10% раствор

хлорного железа (FeCl ).

3

Агар с карболовой кислотой

К 100 мл расплавленного слабощелочного агара (1,5 — 1,7%) добавляют 0,1 мл растопленной кристаллической карболовой кислоты (фенола). Агар перемешивают с карболовой кислотой и разливают тонким слоем в чашки Петри.

Приготовление индикаторных бумажек

На индол

Смешивают:

Парадиметил-амидобензальдегид 3 — 5 г

Этиловый спирт 96° 50 мл

Фосфорная кислота (очищенная, концентрированная) (H PO ) 10 мл

3 4

Растирают в фарфоровой ступке. Полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками.

Цвет бумажки желтый. При наличии индола цвет бумажки меняется от сиренево-розового до интенсивного малинового. Появление других цветов на индикаторной бумажке не учитывается.

На сероводород

Лист фильтровальной бумаги смачивают в следующем растворе:

Дистиллированная вода 100 мл

Уксуснокислый свинец (СH COO) Pb x 3H O) 20 мл

3 2 2

Двууглекислый натрий (NaHCO ) 1 г

3

Бумагу высушивают, нарезают полосками. После обработки бумага остается белой, при наличии сероводорода чернеет.

Консервант (глицериновая смесь)

Физиологический раствор 1000 мл

Химически чистый нейтральный глицерин 500 мл

pH 8 устанавливают, добавляя 20% фосфорнокислого натрия (Na HPO ).

2 4

Стерилизуют при 121° 15 минут. После стерилизации pH должен быть 7,6 — 7,8.

Висмут-сульфитный агар с феноловым красным

Мясопептонный бульон 1000 мл

Натрий хлористый (NaCl) 20 г

Феноловый красный 0,02 г

Агар 15 г

Смешивают все ингредиенты и нагревают до кипения и полного растворения всех ингредиентов. Затем охлаждают до 50°, устанавливают pH 8,6 и стерилизуют при 121° 15 минут.

Охлаждают до 50° и добавляют 100 мл раствора висмут-сульфита и 1 мл 95% этилового спирта.

Приготовление раствора висмут-сульфита

Растворяют 100 г сернистокислого натрия (Na SO ) в 500 мл кипящей воды

2 3

(«1»); 30 г аммоний-висмут лиимоннокислого в 250 мл кипящей воды («2»); 50

г сахарозы, 5 г маннита и 15 г бикарбоната натрия (Na HCO ) в 300 мл

2 3

кипящей воды («3»). Растворы «1» и «2» смешивают вместе и кипятят 1 минуту.

Затем прибавляют раствор «3» и смешивают.

Готовая смесь содержит белый осадок, перед использованием смесь встряхивают. Раствор можно хранить месяц в холодильнике.

Висмут-сульфит — солевой бульон

Дистиллированная вода 950 мл

Пептон 10 г

Хлористый натрий (NaCl) 25 г

Хлористый калий (KCl) 0,7 г

Хлористый магний (MgCl x 6H O) 5 г

2 2

Устанавливают pH 9,1 добавлением 10% водного раствора углекислой соды. Стерилизуют при 121° 15 минут, охлаждают до комнатной температуры и добавляют асептично 100 мл раствора сернистокислого висмута и 1 мл этилового спирта 96°.

Хорошо смешивают и разливают асептично в стерильные пробирки по 10 мл.

Приготовление раствора сернистокислого висмута

Растворяют «1» — 20 г сернокислого натрия (Na SO ) в 100 мл кипящей

2 3

воды, «2» — 0,1 г аммоний-висмут лимоннокислого в 100 мл кипящей воды и

«3» — 20 г маннита в 100 мл кипящей воды. Смешивают растворы «1» и «2»,

кипятят смесь в течение 1 минуты и добавляют раствор «3».

Готовая смесь имеет белый цвет, мутная; перед использованием перемешать.

Раствор можно хранить месяц в холодильнике.

Кровяной — солевой агар (среда Wagatsuma)

Дрожжевой экстракт 5 г

Пептон 10 г

Натрий хлористый (NaCl) 70 г

Маннит 5 г

Агар 15 г

0,1% кристалл-виолет 0,01 мл

Растворяют все ингредиенты в 1 литре дистиллированной воды и доводят pH до 7,5. Нагревают кипячением в течение нескольких минут до полного растворения всех ингредиентов. Не стерилизуют. Охлаждают до 50° и добавляют 10% отмытых человеческих эритроцитов. Все смешивают и разливают в чашки Петри.

Среда Никодемуса

Любой стерильный 2% питательный агар 1000 мл

Этиловый спирт 80 мл

Эмульсия двух желтков

К расплавленному и охлажденному до 45° — 50° агару добавляют этиловый спирт и после перемешивания эмульсию яичных желтков. Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 3 суток.

Эмульсию яичных желтков готовят путем эмульгирования отделенных от белка 2 желтков в 10 мл стерильного физиологического раствора.

Среда Донована (модификация)

Любой стерильный питательный агар 1000 мл

Трехзамещенный нитрат натрия 2,5 г

Хлористый литий (LiCe x H O) 2,5 г

2

Стерилизуют при 110° 30 минут.

Охлаждают до 46 — 50° и добавляют

Полимиксин «М» 200000 ед.

Эмульсию двух желтков

Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7 — 10 дней.

Солевой-полимиксиновый агар с 2,3,5-трифенилтетразолий

хлоридом (ТТХ)

Любой стерильный 2% питательный агар 1000 мл

Хлористый натрий (NaCl) 60 г

Полимиксин «М» 200000 — 400000 ед.

2,3,5-трифенилтетразолий хлорид 0,1 — 0,2 г

Эмульсия двух желтков

В агар после расплавления и охлаждения до 45 — 50° добавляют полимиксин, 2,3,5-ТТХ и эмульсию желтков, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7 — 10 дней.

Молочно-солевой агар

Мясопептонный бульон 1000 мл

Хлористый натрий (NaCl) 65 г

Агар/агар 20 г

Установить pH 7,4, разлить во флаконы, стерилизовать при 121° в течение 20 минут. Перед посевом к расплавленному и остуженному до 45 — 50 агару добавить 10% стерильного обезжиренного молока, хорошо смешать и разлить среду в чашки Петри. Последние можно хранить в холодильнике не более 2 — 3 дней.

Кристалл-виолет-азид-кровяной агар (среда Пейкера)

а) основной агар:

мясопептонный бульон 1000 мл

хлористый натрий (NaCl) 6 г

агар-агар 16 г

б) 0,05% водный раствор кристалл-виолета

в) 5,0% водный раствор азида натрия (NaN )

3

г) цитратная или дефибринированная кровь кролика или человека

Части «а» и «б» стерилизуют при 121° в течение 20 минут, часть «в» стерилизуют через бактериальный фильтр или текучим паром 30 минут.

Для приготовления среды берут стерильно:

основного агара расплавленного и охлажденного до 46° 1000 мл

0,05% водного раствора кристалл-виолета 0,4 мл

5,0% водного раствора азида натрия 4 мл

нитратной или дефибринированной крови 5 мл

Все тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике не более 7 дней.

Молочная среда с полимиксином (среда Калины)

Расплавленный и охлажденный до 46° 85 мл

основной агар (как в среде Пейкера)

0,01% водный раствор кристалл-виолета 1,25 мл

10% водный раствор 2,3,5-ТТХ 0,5 мл

Стерильное обезжиренное молоко 15 мл

Полимиксин «М» 20000 — 40000

Все ингредиенты смешивают асептично и среду тонким слоем разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике 7 — 10 дней.

Среда с теллуритом калия (K TeO )

2 3

Мясопептонный бульон 100 мл

Дрожжевой экстракт 2 мл

Агар-агар 1,5 г

Теллурит калия (K TeO ) 0,4 г

2 3

Все ингредиенты, кроме теллурита калия, автоклавируют при 121° в течение 20 мин. Теллурит калия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Теллурит калия добавляют в среду перед разливкой ее в чашки Петри. Среда хранится в холодильнике не более 7 — 10 дней.

Мясопептонный бульон 100 мл

Дрожжевой экстракт 2 мл

Хлористый натрий (NaCl) 0,5 г

Агар-агар 1,5 г

Глюкоза 1 г

2,3,5-ТТХ 0,01 г

Все ингредиенты, кроме ТТХ, автоклавируют при 121° 10 — 12 мин. 2,3,5-ТТХ растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.

Среда с молоком

Мясопептонный бульон 80 мл

Молоко (стерильное) 20 мл

Глюкоза 0,2 г

Агар-агар 1,5 г

Стерилизуют при 121° в течение 10 — 12 мин. Среда в чашках Петри хранится в холодильнике не более 7 — 10 дней. Стерильное молоко добавляют в среду перед разливкой в чашки Петри.

Казеиново-кислотная и казеиново-грибная среды

Казеиново-кислотный или казеиново-грибной 5 литров

гидролизат

10% дрожжевой экстракт 3,5 литра

20% кукурузный экстракт 1,5 литра

pH 7,9

Разливают во флаконы или пробирки с ватой и пшеном, стерилизуют при 110° в течение 30 минут. pH готовой среды — 7,6, содержание аминного азота 150 — 170 мг%, пептона — 2 — 2,5%.

Приготовление казеиново-кислотного гидролизата

Для приготовления казеиново-кислотного и казеиново-грибного гидролизатов применяют: 1) уксусно-кислотный очищенный казеин (жир 0,3 — 0,4%, кислотность 15 — 40° Т, влажность 8 — 10%, растворимость 0,01 — 0,05); 2) технический кислотный казеин (ГОСТ 1211-41); 3) пищевой молочно-кислотный казеин с содержанием жира не выше 0,5 — 1,5%, по остальным показателям отвечающий требованиям ТУ 153-54; 4) солянокислый казеин.

Каждую партию казеина перед изготовлением производственных серий гидролизата обязательно проверяют путем посева культуры ботулинической палочки.

В бутыль емкостью 20 л вносят 800 г казеина, 10 л воды и 360 мл химически чистой концентрированной соляной кислоты (уд. вес 1,19). Ведут гидролиз белка в автоклаве при температуре 127° в течение 2 часов. После автоклавирования гидролизат имеет темно-коричневую окраску. Для удаления белка, который остался нерасщепленным в процессе гидролиза, его осаждают в изоэлектрической точке казеина. Для этого гидролизат при температуре 38 — 40° подщелачивают по универсальному индикатору до pH 4,7, выпавший белок отфильтровывают через полотно и получают прозрачный темно-коричневый гидролизат, который предварительно разводят водой, прибавляя на 10 л гидролизата, примерно, 5 л воды с таким расчетом, чтобы концентрация пептона в разведенном гидролизате не превышала 3%. Для осветления гидролизата к нему прибавляют активированный уголь из расчета около 0,2 кг угля на 10 л гидролизата (точное количество угля определяют каждый раз опытным путем). <…> фильтр.

Приготовление казеиново-грибного гидролизата

Смешивают 800 г казеина и 10 л водопроводной воды. Смесь постепенно подогревают почти до кипения при постоянном подщелачивании NaOH до pH 8,3 — 8,4 (это соответствует бледно-розовой окраске по фенолфталеину). При этом казеин переходит в коллоидный раствор. Полученный раствор подкисляют соляной кислотой до pH 7,0 (нейтральной реакции соответствует слабо зеленая окраска по бромтимоловому синему), охлаждают до температуры 46° и вносят грибную протеазу (неочищенную, производства ИЭМ им. Гамалеи АМН СССР) в количестве 0,2 кг. Проводят процесс гидролиза при температуре 46 — 48°. pH 7,0 при перемешивании. Через 3,4 часа, когда концентрация аминного азота достигает 210 — 280 мг%, а концентрация пептона — 2,5 — 3%, гидролиз заканчивают. Полученный гидролизат подкисляют уксусной кислотой, которую вносят в количестве 0,1 л, кипятят 10 минут и фильтруют через полотно. Гидролизат употребляют в тот же день для приготовления бульона или добавляют 1% хлороформа и сохраняют при температуре до 10°.

Экстракт прессованных дрожжей. 250 г прессованных хлебных дрожжей размалывают на мелкие кусочки, суспендируют в 4 л дистиллированной воды, кипятят при постоянном перемешивании, пока не сойдет пена (около 5 минут) и фильтруют через полотно или пульпу на бюхнеровской воронке. К экстракту добавляют 1% хлороформа, тщательно взбалтывают и сохраняют в темноте.

Кукурузный экстракт. Кукурузный экстракт, доставляемый с завода непосредственно после его изготовления, для приготовления сред обычно пригоден. Экстракт оставляют на 2 — 3 месяца, при ежедневном перемешивании. Обычно за это время он загустевает и превращается в пасту. Затем экстракт проверяют на пригодность. Для этого отбирают пробу, готовят казеиново-растительную среду, засевают культурой, для выращивания которой предназначается бульон, и на основании результатов биологической пробы делают заключение о пригодности данной партии экстракта для изготовления сред. Для приготовления 20% раствора кукурузного экстракта смешивают 2 кг кукурузного экстракта с 10 л водопроводной воды. Смесь подщелачивают NaOH до pH 9,5 (до синей окраски по тимолфталеину). При этом выпадает обильный осадок, который отфильтровывают через полотно. Фильтрат нейтрализуют, нагревают до кипячения, кипятят 15 минут, охлаждают и вновь фильтруют через полотно.

Обработка пшена. Взвешивают 2,4 кг пшена, опускают в 3 л кипящей воды и кипятят 10 минут. Затем промывают пшено холодной водой до тех пор, пока промывные воды не станут прозрачными. Промытое пшено подсушивают на воздухе или в термостате при температуре 45° в течение часа. Пшено распределяют по флаконам и пробиркам так, чтобы оно покрыло дно тонким слоем.