Генная инженерия растений лабораторное руководство в

Обложка книги.

Предисловие редактора перевода [5]
Предисловие [6]
Список авторов [8]
Список сокращений [8]
Глава 1. Агробактериальные трансформирующие векторы растений. Ф. Армитидж, Р. Уолден, Дж. Дрейпер [11]
  1.1. Введение [11]
    1.1.1. Индукция опухолей агробактерий [11]
    1.1.2. Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens [13]
    1.1.3. Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes [14]
    1.1.4. Механизм переноса Т-ДНК [15]
    1.1.5. Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации [17]
    1.1.6. Основные компоненты неонкогенных Ti-плазмидных векторов [18]
    1.1.7. Неонкогенные векторы общего назначения на основе Ti-плазмид, используемые для трансформации растений [18]
    1.1.8. Векторы для трансформации растений с помощью A. rhizogenes [26]
    1.1.9. Использование специальных трансформирующих векторов на основе Ti-плазмид [27]
    1.1.10. Выбор Ti-плазмидной векторной системы агробактерий [29]
    1.1.11. Клонирование в векторах для трансформации растений [35]
  1.2. Общие молекулярно-биологические рекомендации [37]
  1.3. Культивирование и хранение бактериальных штаммов [39]
    1.3.1. Обеспечение [39]
    1.3.2. Наращивание ночных бактериальных культур [40]
    1.3.3. Рассев бактериальных культур для получения отдельных колоний [40]
    1.3.4. Длительное хранение бактериальных штаммов [41]
    1.3.5. Приготовление чашек для селекции бактерий [41]
  1.4. Препаративное выделение плазмид из Е. coli в больших объемах [42]
    1.4.1. Основные положения [42]
  1.5. Выделение и очистка рестрикциоиных фрагментов ДНК для лигирования [49]
    1.5.1. Основные положения [49]
    1.5.2. Очистка фрагментов ДНК после гидролиза рестриктазами [49]
    1.5.3. Удаление 5′-фосфатных групп фрагментов ДНК с помощью фосфатазы из кишечника теленка [50]
    1.5.4. Электроэлюция рестрикциоииых фрагментов из агарозных гелей [51]
    1.5.5. Очистка специфических рестрикционных фрагментов путем фильтрования центрифугированием [53]
  1.6. Лигирование фрагментов ДНК с векторами для трансформации растений [54]
    1.6.1. Основные положения [54]
    1.6.2. Обеспечение [58]
    1.6.3. Методика (модифицировано по [39]) [59]
  1.7. Введение рекомбииаитиых плазмид в клетки Е. coli с помощью трансформации [61]
    1.7.1. Основные положения [61]
    1.7.2. Обеспечение [63]
    1.7.3. Методика [64]
  1.8. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной ДНК Е. coli [67]
    1.8.1. Основные положения [67]
    1.8.2. Обеспечение [69]
    1.8.3. Методика (модифицировано по [10]) [70]
  1.9. Анализ мини-препаратов ДНК с помощью рестрикциовного гидролиза и электрофореза в агарозном геле [71]
    1.9.1. Основные положения [71]
  1.10. Конъюгационный перенос рекомбинантиых плазмид в агробактерий [72]
    1.10.1. Основные положения [72]
    1.10.2. Обеспечение [74]
    1.10.3. Методика [75]
  1.11. Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из A. tumefaciens [76]
    1.11.1. Основные положения [76]
    1.11.2. Обеспечение [76]
    1.11.3. Методика (модифицирована по [17]) [77]
  1.12. Рестрикционный гидролиз тотальной ДНК агробактерий [78]
    1.12.1. Основные положения [78]
      Приложение 1 [I] [80]
        Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований [80]
      Приложение 1 [II] [82]
        А. Используемые в примерах бактериальные штаммы [82]
        Б. Антибиотики, используемые для селекции бактерий [82]
Литература [83]
Глава 2. Трансформация клеток двудольных растений с помощью Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмид A. rhizogenes. Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Дж. Хэмил [87]
  2.1. Введение [87]
    2.1.1. Основные свойства агробактерий и векторов, которые используются для трансформации клеток растений [88]
    2.1.2. Поведение культивируемых растительных клеток, влияющее на их трансформацию агробактериями [92]
    2.1.3. Селекция трансформированных тканей и регенерация растений [95]
    2.1.4. Основные методы трансформации растительных клеток с помощью агробактериальных векторов [103]
  2.2. Трансформация с помощью онкогенных штаммов дикого типа A. tumfaciens и A. rhizogenes [105]
    2.2.1. Основные положения [105]
    2.2.2. Обеспечение [110]
    2.2.3. Методика [111]
  2.3. Трансформация больших гетерогенных эксплантатов с помощью неонкогенных Ti-плазмидных векторов [117]
  2.4. Прямая регенерация трансформированных растений: трансформация листовых дисков табака [119]
    2.4.1. Основные положения [119]
    2.4.2. Обеспечение [121]
    2.4.3. Методика [122]
  2.5. Регенерация трансформированных растений через стадию каллуса: трансформация эксплантатов проростков льна [130]
    2.5.1. Основные положения [130]
    2.5.2. Получение стерильных проростков льна и регенерация из эксплантатов проростков льна [132]
    2.5.3. Трансформация гипокотилей, регенерация из трансформированного каллуса, селекция, размножение и укоренение трансформированных побегов [135]
  2.6. Трансформация малых гомогенных эксплантатов [140]
    2.6.1. Основные положения [140]
    2.6.2. Разработка систем совместного культивирования [141]
  2.7. Выделение мезофильных протопластов табака [143]
    2.7.1. Основные положения [143]
    2.7.2. Обеспечение [145]
    2.7.3. Методика [146]
  2.8. Культивирование мезофильных протопластов табака [149]
    2.8.1. Основные положения [149]
    2.8.2. Обеспечение [150]
    2.8.3. Методика [150]
  2.9. Трансформация протопластов путем совместного культивирования с агробактериями [151]
    2.9.1. Основные положения [151]
    2.9.2. Обеспечение [152]
    2.9.3. Методика [153]
  2.10. Трансформация клеток суспензионной культуры моркови [160]
    2.10.1. Основные положения [160]
    2.10.2. Инициация проэмбриогеиных суспензионных клеточных культур моркови, приготовление фидерных чашек н высев на переносные диски [165]
    2.10.3. Инокуляция клеток моркови агробактериями, селекция трансформантов и регенерация путем соматического эмбриогенеза [167]
      Приложение 2 [I] [170]
        Обычные материалы для работы с культурой тканей [170]
      Приложение 2 [11] [171]
        Среда для культуры растительных клеток и тканей [171]
      Приложение 2 [111] [175]
        Антибиотики, добавляемые в среды для культур растительных клеток [175]
      Приложение 2 [IV] [176]
        Подготовка эксплантатов для инокуляции агробактериями [176]
      Приложение 2 [V] [178]
        Растворы для выделения протопластов табака [178]
      Приложение 2 [VI] [179]
        Выделение протопластов из измельченных кусочков листа [179]
      Приложение 2 [VII] [180]
        Методы флуоресцентного окрашивания для контроля развития растительных протопластов [180]
      Приложение 2 [VIII] [181]
        Примеры процедур генетической трансформации растений, основанных на системе переноса генов агробактерий [181]
Литература [181]
Глава 3. Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК. Дж. Дрейпер, Р, Скотт, А. Кумар, Г. Дьюри [194]
  3.1. Введение [194]
    3.1.1. Ограничения системы трансформации с помощью агробактерий [194]
    3.1.2. Трансформация растительных протопластов изолированной векторной ДНК [196]
    3.1.3. Разработка стратегий трансформации протопластов путем трансфекции ДНК [197]
    3.1.4. Векторы для переноса генов посредством ДНК. (DMGT-векторы) [199]
    3.1.5. Трансформация интактных растительных тканей DMGT-векторами [201]
  3.2. Трансфекция протопластов с помощью полиэтиленгликоля [203]
    3.2.1. Основные положения [203]
    3.2.2. Стимулируемое ПЭГ поглощение ДНК протопластами [205]
    3.2.3. Выделение ДНК из протопластов и дот-блоттинг-гибридизация [206]
  3.3. Трансформация протопластов с помощью электропорации [212]
    3.3.1. Основные положения [212]
    3.3.2. Оптимизация методик электропорации с помощью временной экспрессии [216]
  3.4. Трансформация растительных клеток путем микроинъекций [221]
    3.4.1. Основные положения [221]
    3.4.2. Трансформация растений путем микроинъекций [223]
      Приложение 3 [I] [232]
        Выделение протопластов из клеток суспензионной альбинотической культуры Petunia hybrlda (сорт Blue Lace) [232]
Литература [232]
Глава 4. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. Дж. Дрейпер, Р. Скотт [236]
  4.1. Введение [236]
    4.1.1. Выделение ДНК [236]
    4.1.2. Выделение РНК [238]
  4.2. Выделение тотальной ДНК из лиофилизироваиных тканей растений [239]
    4.2.1. Общие положения [239]
    4.2.2. Выделение небольших количеств ДНК с помощью СТАВ-буфера [241]
    4.2.3. Выделение ДНК с помощью протеиназы [245]
  4.3. Выделение ДНК из свежего растительного материала [248]
    4.3.1. Общие положения [248]
    4.3.2. Выделение больших количеств тотальной ДНК из свежего растительного материала с помощью СТАВ-буфера [249]
    4.3.3. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН [249]
    4.3.4. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН и протеиназы К [252]
  4.4. Выделение ядерной ДНК [254]
    4.4.1. Выделение ядерной ДНК из свежих каллусов илв листьев [254]
    4.4.2. Выделение ядерной ДНК из протопластов [257]
  4.5. Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий [258]
    4.5.1. Общие положения [258]
    4.5.2. Обеспечение [259]
    4.5.3. Методика [260]
  4.6. Определение концентрации ДНК. в неочищенных препаратах нуклеиновых кислот с помощью дифениламина [262]
    4.6.1. Общие положения [262]
    4.6.2. Обеспечение [263]
    4.6.3. Методика [264]
  4.7. Выделение тотальной РНК из растений [265]
    4.7.1. Общие положения [265]
    4.7.2. Фенольный метод выделения тотальной РНК из растений [265]
    4.7.3. Метод выделения тотальной РНК из растений при помощи хлористого лития [269]
  4.8. Выделение роlу(А)+-мРНК [270]
    4.8.1. Общие положения [270]
    4.8.2. Обеспечение [271]
    4.8.3. Методика [272]
      Приложение 4 [I] [273]
        Выделение больших количеств тотальной ДНК из клеток растений с помощью СТАВ [273]
      Приложение 4 [II] [274]
        Очистка ДНК из растений в градиентах CsCl/БЭ [274]
Литература [276]
Глава 5. Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузериу. Р. Скотт [277]
  5.1. Введение [277]
  5.2. Обработка ДНК ферментами рестрикции [278]
    5.2.1. Общие положения [278]
    5.2.2. Обеспечение [279]
    5.2.3. Методика [279]
  5.3. Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле [280]
    5.3.1. Общие положения [280]
    5.3.2. Обеспечение [281]
    5.3.3. Методика [282]
  5.4. Блоттинг по Саузериу обработанных рестриктазами и разделенных фрагментов ДНК [287]
    5.4.1. Общие положения [287]
    5.4.2. Обеспечение [288]
    5.4.3. Методика [289]
  5.5. Гибридизация ДНК, перенесенной на мембраны с помощью блоттинга по Саузериу [293]
    5.5.1. Общие положения [293]
    5.5.2. Обеспечение [293]
    5.5.3. Методика [295]
  5.6. Мечение препаратов для гибридизации с помощью олигонуклеотидной затравки [297]
    5.6.1. Общие положения [297]
    5.6.2. Обеспечение [298]
    5.6.3. Методика [299]
      Приложение 5 [I] [301]
        Буферы для рестриктаз [301]
      Приложение 5 [II] [302]
        Концевое мечение маркеров, полученных иа основе ДНК фага [302]
      Приложение 5 [III] [302]
        Определение включения метки в ДНК [302]
Литература [303]
Глава 6. Анализ организации и экспрессии генов растений. Р. Скотт, Дж. Дрейпер, Р. Джефферсон, Г. Дьюри, Л. Джэкоб [304]
  6.1. Введение [304]
    6.1.1. Принцип организации генов растений [304]
    6.1.2. Строение мРНК [306]
    6.1.3. Перенос продуктов генов в клетке [306]
    6.1.4. Использование генетической трансформации для изучения экспрессии генов растений [307]
    6.1.5. Использование траисгенных растений для изучения последовательностей, регулирующих транскрипцию [308]
    6.1.6. Изучение регуляторных последовательностей с помощью индикаторных генов [308]
  6.2. Изучение организации Т-ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузериу [311]
    6.2.1. Общие положения [311]
    6.2.2. Организация последовательностей чужеродной ДНК в тканях растений [313]
    6.2.3. Изучение организации Т-ДНК в трансгенных растениях моркови методом блоттинг-гибридизации [317]
  6.3. Анализ экспрессии генов методом точечного нозери-блоттинга [324]
    6.3.1. Регуляция транскрипции гена Cab в этиолированном растении гороха под действием фитохрома [326]
  6.4. Использование CAT в качестве индикаторного гена дли изучения контроля экспрессии генов в различных органах и при изменении условий среды [331]
    6.4.1. Общие положения [331]
    6.4.2. Определение активности хлорамфениколацетилтрансфе-разы (CAT) [333]
    6.4.3. Примеры использования cat в качестве индикаторного гена для изучения контроля экспрессии гена Cab-cat в различных органах и в зависимости от условий среды [336]
  6.5. Применение неомицинфосфотрансферазы-II (NPT-II) в качестве индикаторного белка для изучения роли последовательностей, участвующих в переносе белков (транзитных пептидов) [340]
    6.5.1. Общие положения [340]
  6.6. Выделение интактных хлоропластов табака [343]
    6.6.1. Общие положения [343]
    6.6.2. Обеспечение [344]
    6.6.3. Методика [345]
  6.7. Определение активности NPT-II in situ [346]
    6.7.1. Общие положения [346]
    6.7.2. Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле [347]
    6.7.3. Определение NPT-II in situ после электрофореза [352]
  6.8. Определение NPT-II методом вестери-блоттинга [357]
    6.8.1. Общие положения [357]
  6.9. Получение химерных генов с последовательностями, кодирующими индикаторный фермент: система слияния с геном GUS [362]
    6.9.1. Общие положения [363]
    6.9.2. Слияние с геном GUS [364]
    6.9.3. Определение активности GUS в экстрактах растений [366]
    6.9.4. Выделение GUS из тканей растений [366]
    6.9.5. Флуориметрическое определение активности GUS [368]
    6.9.6. Выявление GUS in situ с использованием денатурирующего полиакриламидного геля [371]
    6.9.7. Гистохимическое выявление GUS на срезах тканей растений [374]
  6.10. Определение нопалина в трансформированных растительных тканях [377]
    6.10.1. Общие положения [377]
    6.10.2. Обеспечение [378]
    6.10.3. Методика [379]
      Приложение 6 [I] [383]
        Нозерн-блоттинг [383]
      Приложение 6 [II] [385]
        Выделение NPT-II и CAT из бактерий [385]
      Приложение 6 [III] [386]
        Определение концентрации белка по Бредфорду [386]
      Приложение 6 [IV] [386]
        Определение агропина и маниопина [386]
Литература [387]
Список фирм, поставщиков реактивов и оборудования [391]
Предметный указатель [395]
Указатель латинских названий [398]
Указатель методик [400]

• Чтобы скачать этот файл зарегистрируйтесь и/или войдите на сайт используя форму сверху.
• Регистрация