Аникеев лукомская руководство к практическим занятиям по микробиологии

ОТ АВТОРОВ

Предлагаемое учебное пособие построено в соответствии с действующей программой и позволяет осуществить все основные работы, рекомендуемые ею. Авторы предлагают и некоторые работы, выходящие за пределы программы, которые могут быть использованы на практикуме или при проведении исследований по курсовым и выпускным работам студентов. Перед каждой работой помещен перечень необходимого оборудования и материалов для проведения данной работы.

Почти все предлагаемые работы проверены нами неоднократно практически при проведении занятий со студентами Ленинградского педагогического института им. А. И. Герцена. В описание многих работ внесены некоторые изменения по сравнению с методиками, изложенными в других практических руководствах. В пособии даны рецепты приготовления тех питательных сред, бактериологических красок и других реактивов, которые используются при проведении рекомендуемых работ. Способы приготовления и стерилизации наиболее употребляемых сред приведены в общей части. Способы приготовления сред, имеющих элективный характер, используемых для выращивания только определенных групп микроорганизмов, даны в конкретных работах.

Некоторые работы по почвенным микроорганизмам, описание которых дано в практикуме, могут быть использованы при проведении летних занятий по курсу физиологии растений. Логическая связь между этими работами по микробиологии и вопросами физиологии растений легко устанавливается.

Авторы будут признательны за замечания, которые возникнут в процессе использования данного практикума.

1. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Правила работы при выполнении микробиологического практикума

В педагогических институтах не разрешается работать с патогенными микроорганизмами в живом состоянии. Знакомство студентов с этой группой микробов осуществляется путем де-монстрации готовых фиксированных препаратов, полученных из специальных медицинских лабораторий. Тем не менее следует иметь в виду, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть высеяна и патогенная форма. Сама работа с сапрофитными формами в ряде случаев требует абсолютной стерильности для получения надежных результатов опыта. В связи с этим многие правила работы в микробиологическом практикуме пединститутов являются общими с любой бактериологической лабораторией.

Для микробиологического практикума отводят специальные помещения:

1) лабораторную комнату для занятий только по микробиологии;

2) стерилизационную, где установлен автоклав и другие стерилизационные аппараты;

3) моечную;

4) препараторскую, приспособленную для хранения сред, культур и подготовки к занятиям. В ней ставят холодильник для хранения сред и культур.

Для проведения работ, требующих абсолютной стерильности (например, для пересева чистых коллекционных культур), в одном из помещений устраивают застекленный бокс, в котором устанавливают бактерицидную лампу (БУФ-15, БУФ-30) на высоте около 2 м от пола.

Лабораторная комната должна выходить окнами на север, а естественное освещение ее должно быть не менее 110 лк. Стены комнаты окрашивают в светлые тона на всю высоту масляной краской, чтобы их можно было мыть. Полы покрывают линолеумом. Лабораторные столы имеют подводку электроэнергии к каждому рабочему месту, и если в институте имеется газ, то на каждом рабочем месте устанавливают газовую горелку, заменяющую спиртовку. Поверхность столов покрывают пластиком или линолеумом, что облегчает их дезинфекцию.

За студентом в лаборатории закрепляют постоянное место и оборудование.

На рабочем месте не должно быть ничего лишнего. Оборудование, которое требуется почти на каждом занятии, устанавливают на длительное время, что значительно облегчает работу лаборанта при подготовке к занятиям. Таким оборудованием являются микроскоп, покрытый полиэтиленовым чехлом, осветитель, набор наиболее ходовых красителей, бактериологические петли и иглы, шпатели, градуированные и неградуированные (пастеровские) пипетки, предметные стекла обычные и с углублениями, покровные стекла, стеклянный мостик в ванночке для окраски препаратов, промывала с водой, дезинфицирующая жидкость, вата, фланелевая тряпочка, карандаш по стеклу, иммерсионное масло, песочные часы, фильтровальная бумага, спиртовка, спички.

Наличие и исправность оборудования проверяются лаборантом перед каждым занятием, и к нему добавляется то, что требуется для проведения данной темы.

Работать в лаборатории следует в халате и шапочке или косынке. В лаборатории не разрешается есть, курить, много ходить и делать порывистые движения.

Использованные в работе предметы помещают в сосуды с дезинфицирующей жидкостью (1%-ный раствор хлорамина, 3%-ный раствор фенола). Металлические предметы (иглы, петли, пинцеты) после каждого соприкосновения с культурами прожигают в пламени спиртовки или газовой горелки.

Предметы и одежду, на которые случайно попала капля ис-следуемого материала, немедленно обрабатывают дезинфицирующим раствором. После окончания работы руки протирают дезинфицирующим раствором и моют с мылом.

Периодически все помещения лаборатории убирают с применением дезинфицирующих средств, а бокс подвергают такой обработке ежедневно перед занятиями и после уборки в нем включают бактерицидную лампу на 30 мин.

Обработка лабораторной посуды

Посуда, используемая в микробиологическом практикуме, должна быть абсолютно чистой, а в ряде случаев и стерильной. Загрязненную посуду обрабатывают хромовой смесью (на 150 мл концентрированной серной кислоты добавляют 25 г измельченного бихромата калия и оставляют на сутки для растворения), которая является сильным окислителем и хорошо очищает стекло от органических остатков. После 30-40 мин пребывания в хромовой смеси посуду промывают проточной водой.

Новую лабораторную посуду кипятят в мыльной воде 15 мин, затем ополаскивают холодной водой. Если посуда после этого оказывается недостаточно чистой, ее кипятят еще 10-15 мин в 1%-ном растворе соляной кислоты, а затем снова ополаскивают, водой.

Градуированные пипетки, используемые в практикуме, как и в количественном химическом анализе, должны быть абсолютно обезжиренными. На стенках (плохо обезжиренных пипеток остаются капли воды, и это служит источникам погрешностей при отмеривании (жидкостей.

(При обработке пипеток не следует втягивать в них ртом хромовую смесь и другие моющие средства. Это делают при помощи резинового баллончика, надеваемого на пипетку.

Предметные стекла, сохранившие жир на поверхности, совершенно непригодны для работы, так как капля воды, нанесенная на такое стекло, не растекается равномерно, а распадается на ряд мелких капель.

При приготовлении мазков недостаточно вымытые стекла очень (мешают работе. Стекла погружают на 2 ч в хромовую смесь, после чего хорошо промывают проточной водой. Затем их кипятят 30 мин в 5%-<ном растворе соды, снова промывают водой и пинцетом переносят в смесь Никифорова (смесь равных объемов спирта-ректификата и эфира), в которой их хранят. Стекла из смеси Никифорова вынимают при помощи пинцета. Моют стекла в резиновых перчатках, чтобы избежать занесения жира с рук.

Любую вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или, если ее используют в ближайшее время, в сушильном шкафу при температуре 100-105°С. Чистую посуду следует хранить закрытой ватными пробками в местах, защищенных от попадания пыли.

Рецепты приготовления питательных сред

Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ)

На жидкой среде МПБ может развиваться большинство гете-ротрофных микроорганизмов. Для приготовления бульона используют говяжье мясо, полностью очищенное от костей, сухожилий и жира. К 1 л водопроводной воды добавляют 500 г мяса, пропущенного через мясорубку, и оставляют настаиваться на холоду <в течение суток. Настой процеживают сквозь марлю, отжимают мясо и ставят в холодную водяную баню. Доводят воду в бане до кипения и выдерживают настой в кипящей воде ‘/г *o Затем настой фильтруют через тряпочку из хлопчатобумажной ткани.

К бульону добавляют 5 г поваренной соли и 10 г лептона. Затем осаждают растворимые белки, для этого бульон выдерживают в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин.

Для более полного осаждения белков и полной прозрачности бульона перед помещением его в автоклав вливают в бульон взбитый белок одного куриного яйца с равным количеством воды. После осаждения белков бульон фильтруют через бумажный (лучше складчатый) фильтр и проверяют его pH индикаторной бумажкой.

Обычно бульон имеет слабокислую реакцию и поэтому непригоден для выращивания бактерий. Поэтому его нейтрализуют до слабощелочной реакции, добавляя 10%-ный -раствор бикарбоната натрия. После этого бульон помещают в колбу, закрывают ее ватной пробкой с бумажным колпачком и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

В ряде случаев и после осаждения бульон не бывает абсолютно (прозрачным. Тогда оса1ж|дение коллоидных частиц проводят повторно после нейтрализации, проводя описанные выше процедуры.

Готовый бульон должен быть абсолютно прозрачным, янтарно-желтого цвета.

Приготовление бульона описанным способом — процесс дли-тельный и трудоемкий, который можно значительно упростить, имея в распоряжении бульонные кубики. В этом случае достаточно растворить 2 бульонных кубика в 1 л воды при кипячении. Затем бульон фильтруют через ватный фильтр и стерилизуют указанным способом. В бульон не добавляют поваренной соли, но проверяют pH среды. Опыт показывает, что более концентрированный будьон делать не следует, так как рост культур на нем происходит хуже.

Приготовление мясо-пептонного агара (МПА)

МПА представляет собой универсальную твердую среду, которая плавится только при температуре около 100°С и позволяет работать практически в любых температурных условиях. Исходной средой для приготовления МПА является М1ПБ, приготовленный описанным выше способам.

К готовому бульону добавляют 2% агара и нагревают в автоклаве с открытым вентилем и незавинченной крышкой до полного растворения агара. Горячую среду нейтрализуют 10%-ным раствором соды до слабощелочной реакции.

Осаждение коллоидных частиц проводят способом, указанным при приготовлении МПБ, фильтруют через складчатый фильтр в’горячем виде прямо в открытом автоклаве (агар затвердевает при температуре около 40°Q. Профильтрованный МПА стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин в колбе с ватной пробкой и бумажным колпачком.

Примечание. Фильтрование МПА — длительная процедура, требующая поддержания высокой температуры фильтруемой среды.

Приготовление мясо-пептонной желатины (МПЖ)

МПЖ-твердая питательная среда-плавится при температуре около 25°С и поэтому непригодна для выращивания ряда микроорганизмов, развивающихся при более высокой температуре. Однако использование этой среды необходимо при работе с определением вида бактерий (работа 21), так как разжижение или неразжижение желатины микробами является одним из ди-агностических признаков при определении.

Исходной средой для приготовления МПЖ также является мясо-пептонный бульон, в который добавляют от 12 до 25% мелко нарезанной желатины. Количество желатины устанавливается эмпирически в зависимости от температуры, при которой приходится работать. Среда должна застывать при комнатной температуре. Чем выше температура, тем больше требуется желатины.

Желатину растворяют в бульоне при температуре не выше 100°С, среду нейтрализуют до слабощелочной реакции и проводят осаждение с применением белка куриного яйца в автоклаве с открытым вентилем при температуре 100°С. После этого среду, фильтруют в колбу, в которой ее хранят, или разливают по пробиркам и стерилизуют методом тиндализации (с. 12).

Нагревание сред с желатиной выше 100°С не допускается, так как в этом случае желатина меняет свойства и не застывает при охлаждении.

Приготовление молока как питательной среды

Молоко содержит все питательные вещества, необходимые гетеротрофным организмам. В данном практикуме молоко используют как среду при определении вида бактерий (работа 21). Свертывание или несвертывание -молока микроорганизмом (образование или отсутствие образования кислоты) является одним из диагностических признаков при определении его вида.

Для приготовления среды используют снятое молоко, которое разливают в пробирки примерно по 10 мл, затем закрывают их ватными пробками и стерилизуют методом тиндализации.

Стерилизация молока при более высокой температуре приводит к карамелизации молочного сахара. Внешне это выражается в изменении цвета молока (топленое молоко). Для определения образования микроорганизмами кислоты в молоко перед стерилизацией можно добавить небольшое ^количество 5%-ной настойки лакмуса. Тогда образование кислоты будет определяться не только свертыванием молока, но и покраснением среды.

Приготовление картофельной среды

Картофельные среды, содержащие необходимые питательные вещества, широко используют для выращивания гетеротрофных микроорганизмов.

В данном практикуме ломтики картофеля используют при работе с определением вида (работа 21). Характер роста некоторых бактерий является одним из диагностических признаков при определении вида.

Для приготовления среды выбирают хорошие, неповрежденные клубни картофеля, из которых вырезают плоские ломтики в том случае, если выращивание будет проводиться в чашках Петри. Если выращивание предполагается в пробирках, то из клубня пробочным сверлом вырезают цилиндрические куски, которые рассекают потом на 2 клина. Клин помещают в пробирку так, чтобы косая поверхность была обращена кверху.

Для нейтрализации кислой среды клеточного сока поверхность кусков картофеля натирают мелом, затем помещают в чашки Петри (или /пробирки). Дно чашки Петри выстилают фильтровальной бумагой, а на дно пробирки кладут кусочек ваты для впитывания -воды, образующейся при варке.

Если среда рассчитана на длительное хранение в пробирках, то под вату наливают немного воды, так как при хранении картофель подсыхает. Стерилизацию проводят при 1 атм в течение 30 мин.

Примечания. 1. Со стерилизацией нельзя медлить, так как картофель быстро темнеет и будет непригоден для работы. Нагревание разрушает ферменты, и потемнения не происходит.

2. Режим стерилизации следует строго выдерживать. При не-достаточной стерилизации стойкие споры, находящиеся постоянно на картофеле, сохранятся и дадут рост.

Приготовление пивного сусла

Неохмеленное пивное сусло, полученное с пивоваренного завода, используют для культивирования многих микроорганизмов. Оно является прекрасной средой для молочнокислых бактерий и дрожжей. При отсутствии готового сусла пользуются солодовой средой, которую готовят нижеследующим способом.

Зерновки ячменя проращивают до наклевывания, затем высушивают их при температуре 60-70°С и мелют на’ кофейной мельнице.

Нагревают 1 л «воды до 50°С и при перемешивании всыпают в нее 250 г молотого солода. Оставляют в воде без нагревания на 30 мин, затем воду нагревают и поддерживают ее температуру 55-58°С. Время от времени из жидкости берут пробы на крахмал (иодная проба). Когда иодная проба покажет полное осахаривание крахмала, сусло фильтруют и затем стерилизуют при % атм в течение 30 мин (также стерилизуют готовое сусло).

Следует иметь в виду, что для культивирования дрожжей ис-пользуют сусло с содержанием сахара 6-8%, а для молочнокислых бактерий -8-12%. Поэтому в сусле нужно определить содержание сахара.

Приготовление голодного агара

В автоклаве с открытым вентилем растворяют агар в водопроводной воде. Агара берут 2% по отношению к объему веды. После полного растворения агар осветляют и фильтруют в горячем воде. Среду стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

ОТ АВТОРОВ

Предлагаемое учебное пособие построено в соответствии с действующей программой и позволяет осуществить все основные работы, рекомендуемые ею. Авторы предлагают и некоторые работы, выходящие за пределы программы, которые могут быть использованы на практикуме или при проведении исследований по курсовым и выпускным работам студентов. Перед каждой работой помещен перечень необходимого оборудования и материалов для проведения данной работы.

Почти все предлагаемые работы проверены нами неоднократно практически при проведении занятий со студентами Ленинградского педагогического института им. А. И. Герцена. В описание многих работ внесены некоторые изменения по сравнению с методиками, изложенными в других практических руководствах. В пособии даны рецепты приготовления тех питательных сред, бактериологических красок и других реактивов, которые используются при проведении рекомендуемых работ. Способы приготовления и стерилизации наиболее употребляемых сред приведены в общей части. Способы приготовления сред, имеющих элективный характер, используемых для выращивания только определенных групп микроорганизмов, даны в конкретных работах.

Некоторые работы по почвенным микроорганизмам, описание которых дано в практикуме, могут быть использованы при проведении летних занятий по курсу физиологии растений. Логическая связь между этими работами по микробиологии и вопросами физиологии растений легко устанавливается.

Авторы будут признательны за замечания, которые возникнут в процессе использования данного практикума.

1. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Правила работы при выполнении микробиологического практикума

В педагогических институтах не разрешается работать с па-тогенными микроорганизмами в живом состоянии. Знакомство студентов с этой группой микробов осуществляется путем де-монстрации готовых фиксированных препаратов, полученных из специальных медицинских лабораторий. Тем не менее следует иметь в виду, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть высеяна и патогенная форма. Сама работа с сапрофитными формами в ряде случаев требует абсолютной стерильности для получения надежных результатов опыта. В связи с этим многие правила работы в микробиологическом практикуме пединститутов являются общими с любой бактериологической лабораторией.

Для микробиологического практикума отводят специальные помещения:

1) лабораторную комнату для занятий только по микробиологии;

2) стерилизационную, где установлен автоклав и другие сте-рилизационные аппараты;

3) моечную;

4) препараторскую, приспособленную для хранения сред, культур и подготовки к занятиям. В ней ставят холодильник для хранения сред и культур.

Для проведения работ, требующих абсолютной стерильности (например, для пересева чистых коллекционных культур), в одном из помещений устраивают застекленный бокс, в котором устанавливают бактерицидную лампу (БУФ-15, БУФ-30) на высоте около 2 м от пола.

Лабораторная комната должна выходить окнами на север, а естественное освещение ее должно быть не менее 110 лк. Стены комнаты окрашивают в светлые тона на всю высоту масляной краской, чтобы их можно было мыть. Полы покрывают линолеумом. Лабораторные столы имеют подводку электроэнергии к каждому рабочему месту, и если в институте имеется газ, то на каждом рабочем месте устанавливают газовую горелку, заменяющую спиртовку. Поверхность столов покрывают пластиком или линолеумом, что облегчает их дезинфекцию.

За студентом в лаборатории закрепляют постоянное место и оборудование.

На рабочем месте не должно быть ничего лишнего. Оборудование, которое требуется почти на каждом занятии, устанавливают на длительное время, что значительно облегчает работу лаборанта при подготовке к занятиям. Таким оборудованием являются микроскоп, покрытый полиэтиленовым чехлом, осветитель, набор наиболее ходовых красителей, бактериологические петли и иглы, шпатели, градуированные и неградуированные (пастеровские) пипетки, предметные стекла обычные и с углублениями, покровные стекла, стеклянный мостик в ванночке для окраски препаратов, промывала с водой, дезинфицирующая жидкость, вата, фланелевая тряпочка, карандаш по стеклу, иммерсионное масло, песочные часы, фильтровальная бумага, спиртовка, спички.

Наличие и исправность оборудования проверяются лаборантом перед каждым занятием, и к нему добавляется то, что требуется для проведения данной темы.

Работать в лаборатории следует в халате и шапочке или косынке. В лаборатории не разрешается есть, курить, много ходить и делать порывистые движения.

Использованные в работе предметы помещают в сосуды с де-зинфицирующей жидкостью (1%-ный раствор хлорамина, 3%-ный раствор фенола). Металлические предметы (иглы, петли, пинцеты) после каждого соприкосновения с культурами прожигают в пламени спиртовки или газовой горелки.

Предметы и одежду, на которые случайно попала капля ис-следуемого материала, немедленно обрабатывают дезинфицирующим раствором. После окончания работы руки протирают де-зинфицирующим раствором и моют с мылом.

Периодически все помещения лаборатории убирают с применением дезинфицирующих средств, а бокс подвергают такой обработке ежедневно перед занятиями и после уборки в нем включают бактерицидную лампу на 30 мин.

Обработка лабораторной посуды

Посуда, используемая в микробиологическом практикуме, должна быть абсолютно чистой, а в ряде случаев и стерильной. Загрязненную посуду обрабатывают хромовой смесью (на 150 мл концентрированной серной кислоты добавляют 25 г измельченного бихромата калия и оставляют на сутки для растворения), которая является сильным окислителем и хорошо очищает стекло от органических остатков. После 30-40 мин пребывания в хромовой смеси посуду промывают проточной водой.

Новую лабораторную посуду кипятят в мыльной воде 15 мин, затем ополаскивают холодной водой. Если посуда после этого оказывается недостаточно чистой, ее кипятят еще 10-15 мин в 1%-ном растворе соляной кислоты, а затем снова ополаскивают, водой.

Градуированные пипетки, используемые в практикуме, как и в количественном химическом анализе, должны быть абсолютно обезжиренными. На стенках (плохо обезжиренных пипеток остаются капли воды, и это служит источникам погрешностей при отмеривании (жидкостей.

(При обработке пипеток не следует втягивать в них ртом хромовую смесь и другие моющие средства. Это делают при помощи резинового баллончика, надеваемого на пипетку.

Предметные стекла, сохранившие жир на поверхности, совершенно непригодны для работы, так как капля воды, нанесенная на такое стекло, не растекается равномерно, а распадается на ряд мелких капель.

При приготовлении мазков недостаточно вымытые стекла очень (мешают работе. Стекла погружают на 2 ч в хромовую смесь, после чего хорошо промывают проточной водой. Затем их кипятят 30 мин в 5%-<ном растворе соды, снова промывают водой и пинцетом переносят в смесь Никифорова (смесь равных объемов спирта-ректификата и эфира), в которой их хранят. Стекла из смеси Никифорова вынимают при помощи пинцета. Моют стекла в резиновых перчатках, чтобы избежать занесения жира с рук.

Любую вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или, если ее используют в ближайшее время, в сушильном шкафу при температуре 100-105°С. Чистую посуду следует хранить закрытой ватными пробками в местах, защищенных от попадания пыли.

Рецепты приготовления питательных сред

Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ)

На жидкой среде МПБ может развиваться большинство гете-ротрофных микроорганизмов. Для приготовления бульона используют говяжье мясо, полностью очищенное от костей, сухожилий и жира. К 1 л водопроводной воды добавляют 500 г мяса, пропущенного через мясорубку, и оставляют настаиваться на холоду <в течение суток. Настой процеживают сквозь марлю, отжимают мясо и ставят в холодную водяную баню. Доводят воду в бане до кипения и выдерживают настой в кипящей воде ‘/г *o Затем настой фильтруют через тряпочку из хлопчатобумажной ткани.

К бульону добавляют 5 г поваренной соли и 10 г лептона. Затем осаждают растворимые белки, для этого бульон выдерживают в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин.

Для более полного осаждения белков и полной прозрачности бульона перед помещением его в автоклав вливают в бульон взбитый белок одного куриного яйца с равным количеством воды. После осаждения белков бульон фильтруют через бумажный (лучше складчатый) фильтр и проверяют его pH индикаторной бумажкой.

Обычно бульон имеет слабокислую реакцию и поэтому непригоден для выращивания бактерий. Поэтому его нейтрализуют до слабощелочной реакции, добавляя 10%-ный -раствор бикарбоната натрия. После этого бульон помещают в колбу, закрывают ее ватной пробкой с бумажным колпачком и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

В ряде случаев и после осаждения бульон не бывает абсолютно (прозрачным. Тогда оса1ж|дение коллоидных частиц проводят повторно после нейтрализации, проводя описанные выше процедуры.

Готовый бульон должен быть абсолютно прозрачным, янтарно-желтого цвета.

Приготовление бульона описанным способом — процесс дли-тельный и трудоемкий, который можно значительно упростить, имея в распоряжении бульонные кубики. В этом случае достаточно растворить 2 бульонных кубика в 1 л воды при кипячении. Затем бульон фильтруют через ватный фильтр и стерилизуют указанным способом. В бульон не добавляют поваренной соли, но проверяют pH среды. Опыт показывает, что более концентрированный будьон делать не следует, так как рост культур на нем происходит хуже.

Приготовление мясо-пептонного агара (МПА)

МПА представляет собой универсальную твердую среду, которая плавится только при температуре около 100°С и позволяет работать практически в любых температурных условиях. Исходной средой для приготовления МПА является М1ПБ, приготовленный описанным выше способам.

К готовому бульону добавляют 2% агара и нагревают в автоклаве с открытым вентилем и незавинченной крышкой до полного растворения агара. Горячую среду нейтрализуют 10%-ным раствором соды до слабощелочной реакции.

Осаждение коллоидных частиц проводят способом, указанным при приготовлении МПБ, фильтруют через складчатый фильтр в’горячем виде прямо в открытом автоклаве (агар затвердевает при температуре около 40°Q. Профильтрованный МПА стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин в колбе с ватной пробкой и бумажным колпачком.

Примечание. Фильтрование МПА — длительная процедура, требующая поддержания высокой температуры фильтруемой среды.

Приготовление мясо-пептонной желатины (МПЖ)

МПЖ-твердая питательная среда-плавится при температуре около 25°С и поэтому непригодна для выращивания ряда микроорганизмов, развивающихся при более высокой температуре. Однако использование этой среды необходимо при работе с определением вида бактерий (работа 21), так как разжижение или неразжижение желатины микробами является одним из ди-агностических признаков при определении.

Исходной средой для приготовления МПЖ также является мясо-пептонный бульон, в который добавляют от 12 до 25% мелко нарезанной желатины. Количество желатины устанавливается эмпирически в зависимости от температуры, при которой приходится работать. Среда должна застывать при комнатной температуре. Чем выше температура, тем больше требуется желатины.

Желатину растворяют в бульоне при температуре не выше 100°С, среду нейтрализуют до слабощелочной реакции и проводят осаждение с применением белка куриного яйца в автоклаве с открытым вентилем при температуре 100°С. После этого среду, фильтруют в колбу, в которой ее хранят, или разливают по пробиркам и стерилизуют методом тиндализации (с. 12).

Нагревание сред с желатиной выше 100°С не допускается, так как в этом случае желатина меняет свойства и не застывает при охлаждении.

Приготовление молока как питательной среды

Молоко содержит все питательные вещества, необходимые гетеротрофным организмам. В данном практикуме молоко используют <как среду при определении вида бактерий (работа 21). Свертывание или несвертывание -молока микроорганизмом (образование или отсутствие образования кислоты) является одним из диагностических признаков при определении его вида.

Для приготовления среды используют снятое молоко, которое разливают в пробирки примерно по 10 мл, затем закрывают их ватными пробками и стерилизуют методом тиндализации.

Стерилизация молока при более высокой температуре приводит к карамелизации молочного сахара. Внешне это выражается в изменении цвета молока (топленое молоко). Для определения образования микроорганизмами кислоты в молоко перед стерилизацией можно добавить небольшое ^количество 5%-ной настойки лакмуса. Тогда образование кислоты будет определяться не только свертыванием молока, но и покраснением среды.

Приготовление картофельной среды

Картофельные среды, содержащие необходимые питательные вещества, широко используют для выращивания гетеротрофных микроорганизмов.

В данном практикуме ломтики картофеля используют при работе с определением вида (работа 21). Характер роста некоторых бактерий является одним из диагностических признаков при определении вида.

Для приготовления среды выбирают хорошие, неповрежденные клубни картофеля, из которых вырезают плоские ломтики в том случае, если выращивание будет проводиться в чашках Петри. Если выращивание предполагается в пробирках, то из клубня пробочным сверлом вырезают цилиндрические куски, которые рассекают потом на 2 клина. Клин помещают в пробирку так, чтобы косая поверхность была обращена кверху.

Для нейтрализации кислой среды клеточного сока поверхность кусков картофеля натирают мелом, затем помещают в чашки Петри (или /пробирки). Дно чашки Петри выстилают фильтровальной бумагой, а на дно пробирки кладут кусочек ваты для впитывания -воды, образующейся при варке.

Если среда рассчитана на длительное хранение в пробирках, то под вату наливают немного воды, так как при хранении картофель подсыхает. Стерилизацию проводят при 1 атм в течение 30 мин.

Примечания. 1. Со стерилизацией нельзя медлить, так как картофель быстро темнеет и будет непригоден для работы. Нагревание разрушает ферменты, и потемнения не происходит.

2. Режим стерилизации следует строго выдерживать. При не-достаточной стерилизации стойкие споры, находящиеся постоянно на картофеле, сохранятся и дадут рост.

Приготовление пивного сусла

Неохмеленное пивное сусло, полученное с пивоваренного завода, используют для культивирования многих микроорганизмов. Оно является прекрасной средой для молочнокислых бактерий и дрожжей. При отсутствии готового сусла пользуются солодовой средой, которую готовят нижеследующим способом.

Зерновки ячменя проращивают до наклевывания, затем высушивают их при температуре 60-70°С и мелют на’ кофейной мельнице.

Нагревают 1 л «воды до 50°С и при перемешивании всыпают в нее 250 г молотого солода. Оставляют в воде без нагревания на 30 мин, затем воду нагревают и поддерживают ее температуру 55-58°С. Время от времени из жидкости берут пробы на крахмал (иодная проба). Когда иодная проба покажет полное осахаривание крахмала, сусло фильтруют и затем стерилизуют при % атм в течение 30 мин (также стерилизуют готовое сусло).

Следует иметь в виду, что для культивирования дрожжей ис-пользуют сусло с содержанием сахара 6-8%, а для молочнокислых бактерий -8-12%. Поэтому в сусле нужно определить содержание сахара.

Приготовление голодного агара

В автоклаве с открытым вентилем растворяют агар в водопроводной воде. Агара берут 2% по отношению к объему веды. После полного растворения агар осветляют и фильтруют в горячем воде. Среду стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

Руководство

К ПРАКТИЧЕСКИМ
ЗАНЯТИЯМ

ПО МЕДИЦИНСКОЙ
МИКРОБИОЛОГИИ

Томск, 2002

Министерство
Здравоохранения Российской Федерации

Сибирский
государственный медицинский университет

«Утверждаю»

Директор ГОУ ВУН
МЦ МЗ РФ

П.А.
Душенков ______________

«___» ______________ 200 г.

РУКОВОДСТВО

К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ОБЩЕМУ КУРСУ
МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Рекомендовано
Министерством здравоохранения

Российской Федерации
в качестве учебного пособия

для студентов
лечебно-профилактического,

медико-биологического
и фармацевтического факультетов

Издание второе,
переработанное и дополненное

Томск,
2002

Руководство
составлено профессорами Е.П. Красноженовым,
М.Р. Карповой, И.Н. Ильинских, доцентами
Ю.Н. Одинцовым, В.Г. Пехенько, Л.С.
Муштоватовой, ст. преподавателем Т.Л.
Мирютовой, ассистентом М.В. Шамис.

Руководство
к практическим занятиям по медицинской
микробиологии. Под ред. проф. Е.П.
Красноженова. Томск, 2002.

Руководство
представляет собой обзор современной
литературы по вопросам морфологии и
физиологии, генетике микроорганизмов,
в том числе и вирусов, инфекции и
иммунитета, иммунопрофилактики и
иммунотерапии инфекционных заболеваний
и является дополнением к теоретическому
курсу «Медицинская микробиология».
Приведены сведения, позволяющие овладеть
практическими навыками выполнения
различных лабораторных методов
исследования. Составлено в соответствии
с программой, утвержденной Департаментом
образовательных медицинских учреждений
и кадровой политики Минздрава России.

Руководство
предназначено для студентов врачебных,
фармацевтического и медико-биологического
факультетов.

Рецензенты:

Томск, Сибирский
государственный медицинский университет,
2002

ВВЕДЕНИЕ

Основные этапы развития микробиологии

Открытие
мира микроорганизмов связано с именем
Антония Левенгука (1632-1723). А. Левенгук
создал свой микроскоп, дающий увеличение
до 300 раз, что позволило ему обнаружить,
описать и зарисовать основные формы
бактерий и клеток. Этот период назван
– морфологическим,
так как исследования в области
микробиологии сводились к описанию
форм бактерий.

Второй период
развития микробиологии физиологический
связан с именами ученых Луи Пастера
(1822-1895) и Роберта Коха (1843-1910). Л. Пастер
установил, что молочнокислое и
маслянокислое брожение, процесс
разложения белковых продуктов есть
результат жизнедеятельности
микроорганизмов. Он доказал, что
микроорганизмы являются возбудителями
ряда заболеваний, и выделил бактерии
куриной холеры, остеомиелита, разработал
методы профилактики инфекционных
заболеваний путем вакцинации, которые
успешно используются до настоящего
времени. Л. Пастер разработал не только
принципы вакцинации, но и способ
приготовления вакцин. Предложенный им
способ приготовления вакцины против
бешенства позволили в 1886 году И.И.
Мечникову и Н.Ф. Гамалея организовать
в России лабораторию, в которой проводили
прививки против этого заболевания.

Открытие
возбудителей болезней сопровождалось
изучением их биологических свойств и
их этиологической
роли в
возникновении инфекционных заболеваний.
Огромный вклад в этом направлении сделан
немецким микробиологом Р. Кохом. Он
разработал и, в дальнейшем, сформулировал
триаду Генле-Коха:

1. предполагаемый
   микроорганизм — возбудитель данного
   заболевания не может быть выделен при
   других инфекционных заболеваниях;

2. микроорганизм
   должен быть выделен в чистой культуре;

3. чистая
   культура возбудителя должна вызывать
   у экспериментальных животных специфическую
   болезнь.

Немецкая
школа микробиологов во главе с Р. Кохом
внесла большой вклад в развитие
микробиологии, разработав способы
получения чистых культур микроорганизмов,
методы окраски бактерий анилиновыми
красителями.

Благодаря
методам, предложенным Р. Кохом, были
изучены обмен веществ, дыхание,
ферментативная активность, рост и
размножение, культивирование на
искусственных питательных средах,
экзотоксины бактерий.

За
короткий промежуток времени было открыто
большое количество возбудителей
инфекционных заболеваний человека
(гонореи – А. Нейссер, брюшного тифа –
К. Эберт, туберкулеза — Р. Кох, холеры –
Р. Кох, стафилококк – Л. Пастер, дифтерия
– Леффлер и др.).

Третий
период микробиологии ознаменовался
созданием нового направления в
микробиологии — иммунологией. Русский
ученый И.И. Мечников (1845-1916) и немецкий
ученый П. Эрлих (1854-1915) считаются
основоположниками иммунологии. И.И.
Мечников разработал фагоцитарную теорию
иммунитета и впервые ввел понятие
«Клеточный иммунитет». И.И. Мечников
рассматривал фагоцитоз, как основной
фактор защиты организма человека от
возбудителей инфекционных заболеваний.

П. Эрлих
предложил гуморальную теорию иммунитета
и положил начало учению об антителах.
К концу ХХ века
выяснилось, что эти две точки зрения
ученых дополняют друг друга. За эти
исследования И.И. Мечников и П. Эрлих
были удостоены Нобелевской премии 1908
г. в области иммунологии.

В 1892 г.
Д.И. Ивановский сообщил об открытии им
возбудителя мозаичной болезни табака
— фильтрующегося вируса. Этот год
считается датой рождения нового
направления в микробиологии – вирусологии,
которая в настоящее время стала
фундаментальной биологической наукой.
Затем были открыты вирусы полиомиелита
– 1909 г. К. Ландштейнер и Е. Поппер;
бешенства –1892 г. В. Бабеш и 1903 г. Негри;
кори – 1911 г. Дж. Гольдбергер и Дж. Андерсон;
паротита – 1934 г. К. Джонсон и Э. Гудпасчер;
вируса гриппа – 1933 г. В. Смит и К. Эндрюс;
вирус клещевого энцефалита – 1937 г. Л.
Зильбер, Е. Левкович, Т. Чумаков; вирус
ВИЧ — 1982 г. Р.Гало, 1983 г. Л. Монтанье; вирус
гепатита – 1970 г. Д. Дейн.

В конце
ХХ века было
установлено, что болезни человека могут
вызывать не только бактерии, но и
простейшие: амебы, лейшмании, плазмодии
малярии и т.д. Возникло учение –
протозоология.

Для
лечения и профилактики инфекционных
заболеваний наряду с созданием и
применением вакцин и сывороток развивается
новое направление – химиотерапия. Одним
из основоположников этих исследований
был П. Эрлих. Им было установлено
губительное действие ряда красителей
на трипаносомы, создан препарат
«Сальварсан», бактерицидно действующий
на спирохеты – возбудителя сифилиса.
Начиная с 30-х годов, были разработаны
препараты против малярии – хинин,
сульфаниламид, стрептоцид и т.д.

Английский
ученый А. Флеминг в 1928 г. положил начало
созданию антибиотиков. Он установил
экспериментально, что вокруг зеленой
плесени – гриба рода Penicillium – отсутствует
рост стафилококков. В 1940 г. Х. Флори и Э.
Чейн получили стабильный препарат
очищенного пенициллина для лечения
многих инфекционных заболеваний.

Молекулярно-генетическийэтап развития микробиологии начинается
с 40-50 годов ХХ века. Огромные успехи в
области молекулярной биологии, генетики,
биотехнологии, биохимии позволили
расшифровать геном бактерий и вирусов,
создать рекомбинантные штаммы
микроорганизмов и использовать их для
получения разнообразных биологически
активных веществ (антибиотиков, гормонов,
ферментов, витаминов), установить
химическую структуру иммуноглобулинов
и разработать способ получения
моноклональных антител, изучить принцип
функционирования иммунной системы,
разработать диагностические системы
к вирусам и бактериям, основанные на
иммунологических и генетических
принципах, создать генно-инженерные
вакцины. Научные достижения ученых мира
создали реальные предпосылки к развитию
биотехнологии и ликвидации ряда
инфекционных заболеваний. Благодаря
иммунопрофилактике ликвидирована
натуральная оспа, снижена заболеваемость
корью, коклюшем, дифтерией, туляремией,
сибирской язвой и т.д.

В
настоящее время широкие исследования
ведутся в области борьбы с такими
распространенными заболеваниями как
гепатиты, туберкулез, ВИЧ — инфекция.

Структура
микробиологической службы Российской
Федерации

В России
в 1999 году принят закон «О санитарном
эпидемиологическом благополучии
населения». В этом законе предусмотрены
меры по предупреждению, возникновения
и распространения инфекционных
заболеваний. С этой целью должны
своевременно проводится
санитарно-противоэпидемические
мероприятия, в том числе мероприятия
по осуществлению санитарной охраны
территории Российской федерации,
введения при необходимости карантинных
мер в отношении больных инфекционным
заболеванием, проведении профилактических
прививок.

Для
контроля за исполнением закона и
своевременном проведении предусмотренных
мероприятий создана государственная
санитарно — эпидемиологическая службаРоссийской федерации, которая представляет
собой единую федеральную централизованную
систему органов и учреждений. Руководство
государственной санитарно-эпидемиологической
службой РФ осуществляется, Главным
государственным санитарным врачом –
в ранге зам. министра Здравоохранения
РФ. В субъектах РФ организацию деятельности
санитарно — эпидемиологической службы
осуществляют Главные санитарные врачи
республик, областей, городов и районов.

Кроме
того, в состав санитарно-эпидемиологической
службы включены структурные подразделения
железнодорожного транспорта, обороны,
внутренних дел, служб безопасности,
налоговой и пограничной службы, которые
осуществляют санитарно-эпидемиологический
надзор соответственно на железнодорожном
транспорте, в вооруженных силах и др.
указанных выше подразделениях.

Все
структурные подразделения Госсанэпиднадзора
осуществляют в своих субъектах или
подразделениях контроль за выполнением
санитарного законодательства. Проводят
санитарно-профилактические мероприятия,
санитарный карантин, контроль в пунктах
пропуска через Государственную границу
РФ, контроль за санитарно-эпидемиологической
обстановкой, проведение санитарно-эпидемических
расследований, направленных на
установление причин возникновения и
распространения инфекционных заболеваний,
государственный учет инфекционных,
профессиональных, массовых заболеваний,
связанных с вредным воздействием
факторов среды обитания.

Таким
образом, в каждом субъекте РФ имеется
соответственный Госсанэпиднадзор
(ранее именовались СЭС), который
осуществляет на своей территории
контроль за санитарно-эпидемической
обстановкой, разрабатывает и выполняет
санитарно-противоэпидемические
мероприятия, вводит и отменяет карантин,
информирует население об инфекционных
заболеваниях и массовых отравлениях,
а также о проводимых мероприятиях. В
составе каждой структуры Госсанэпиднадзора
имеются лаборатории (бактериологическая,
вирусологическая, иммунологическая и
т.д.) выполняющие контроль за санитарно
— эпидемической обстановкой на
соответствующей территории. Все
нижестоящие структуры Госсанэпиднадзора
подчиняются и отчитываются только перед
федеральным центром РФ.

Для
проведения санитарно-эпидемических и
профилактических мероприятий в Российской
федерации в структуре Министерства
Здравоохранения имеются государственные
научно-производственные объединения
и НИИ, которые осуществляют научные
исследования по отраслевым проблемам,
разрабатывают новые препараты для
лечения, профилактики и диагностики
инфекционных заболеваний, а также
осуществляют производство и выпуск
бактерийных и вирусных препаратов.

В системе
здравоохранения имеются клинико-диагностические
лаборатории общего назначения и
специального типа (бактериологическая,
вирусологическая, иммунологическая),
входящие в состав больниц, поликлиник
и других лечебных учреждений. Кроме
этого, существуют центральные, проблемные,
отраслевые и учебные лаборатории ВУЗов
– кафедры микробиологии, вирусологии
и иммунологии, а также специализированные
лаборатории, выполняющие работу с особо
опасными инфекциями.

В
соответствии с делением микроорганизмов
на группы по степени биологической
опасности лаборатории подразделяются
на 3 категории:

1) базовые
(общего типа); 2) режимные; 3) лаборатории
особого режима.

Безопасность
работы в лабораториях всех категорий
обеспечивается выполнением распорядка
и правил работ, оснащением лаборатории
соответствующим оборудованием, а также
наличием лицензии на право работы с
инфекционным материалом.

Аникеев, Владимир Васильевич — Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] : [Учеб. пособие для биол. специальностей пед. ин-тов]