Агар кристенсена с мочевиной инструкция по применению

АГАР КРИСТЕНСЕНА С МОЧЕВИНОЙ

Для определения уреаза продуцирующих организмов

 Состав

* Обезвоженный порошок, гигроскопичен, хранить в сухом месте, в плотно закрытой таре при температуре ниже 25 ° C, защищать от прямых солнечных лучей.

Инструкции по использованию

Растворить 24,00 г в 950 мл дистиллированной воды. Осторожно нагреть до кипения при перемешивании, чтобы растворить среду полностью. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121 ° С) в течение 15 минут. Охладить до температуры 50° С и асептично внести 50 мл 40% раствора Мочевины (TS 030). Тщательно перемешать и разлить в стерильные пробирки, установить в наклонном положении. Не перегревать или повторно греть среду, так как, мочевина легко распадается.

Внешний вид: Незначительно или слегка мутный, светло-желтого цвета.

рН (при 25 ° С): 6,8 ± 0,2

  Принцип действия:

Основа агара Кристенсена с мочевиной используетсяся Кристенсена для обнаружения уреазы продуцирующих бактерий и в частности, для кишечными грамотрицательными энтеробактерий, на основе гидролиза мочевины. Основа агара Кристенсена с мочевиной используется для быстрого обнаружения активности уреазы, а в сочетании с результатами других быстрых скрининг-тестов, это наиболее распространенный метод для обнаружения производства уреазы дрожжами. Протеи и несколько другие организмы дают положительный результат (фиолетовый цвет) реакции. Пептон обеспечивает существенными питательными веществами, такими как азот, витамины, минералы и аминокислоты для роста организмов. Глюкоза является углеводным источником. Хлорид натрия поддерживает осмотическое равновесие. Гидрофосфат калия обеспечивает буферностью. Мочевина является источником азота для тех организмов, производящих уреазы. Феноловый красный индикатор рН. Агар является затвердевающим агентом. Формулировка Кристенсена, позволяет обнаружить Proteus в течение 3-5 часов. Чтобы получить хорошие результаты, прививают сильно наклоненную поверхность среды и инкубируют в течение 3-5 часов при температуре 37º C. Положительным результатом является изменение цвета от желтого (рН 6,8) до темно-фиолетового или голубовато-красного цвета (рН 8,1) на наклонной поверхности. Наблюдения пробирок должно быть сделано через 2 — 4 часа.

Интерпретация результатов

Культуральные свойства, наблюдались после инокуляции (10³ КОЕ / мл) и инкубации при 35-37ᵒС в течении 18-24 часов.

Экспериментальные ограничения:

·         В этой среде происходит щелочная реакция, если инкубировать в течение более длительного периода и дает ложные положительные результат (развитие светло-вишневого цвета), а не является результатом активности уреазы.

·         Ложные положительная реакция происходит либо из-за использования пептон (особенно в скошенном агаре, P. aeruginosa) или повышением рН (вследствии выпуска избыточных аминокислотных остатков) путем гидролиза белка.

·         Всегда носите с собой контрольный тест (без добавления мочевины), чтобы избежать ложных реакций.

Не нагревайте среду после добавления мочевины

Эту среду с добавлением мочевины рекомендуют для определения продукции уреазы, в частности у протеев. Она рекомендована международным комитетом (ISO 6579: 1993).

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 24,0 г порошка в 950 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 0,7 атм (115°С) в течение 20 мин. Остудить до 50°С и асептично добавить 50 мл 40%-ного стерильного раствора мочевины (FD048). Тщательно перемешать, разлить в стерильные пробирки и остудить их в наклонном положении для получения скоса. Поскольку мочевина легко разрушается, не допускать перегревания и повторного нагрева среды.

Принцип и оценка результата:

Эта среда готовится в соответствии с прописью Кристенсена (1, 2). Для более быстрого выявления уреазы специалисты международного комитета (ISO) рекомендовали использовать один фосфат вместо двух. Первоначально среду для выявления уреазной активности предложили Rustigian и Stuart (4), но на ней отличались по росту протеи, которые быстро проявляют уреазную активность, и другие уреазоположительные (цитробактеры, энтеробактеры, клебсиеллы и не относимые к энтеробактериям микроорганизмы). Кристенсен отметил, что внесение в среду пептического перевара животной ткани, глюкозы и сниженного количества буфера способствует получению быстрого обильного роста микроорганизмов.

На поверхность косячков обильно засевают испытуемые культуры. При расщеплении мочевины образуется аммиак, который защелачивает среду, что сопровождается изменением цвета индикатора фенолового красного на розово-красный. Поскольку при длительном инкубировании может произойти защелачивание среды за счет образующихся из пептона аминов, для контроля рекомендуется засевать среду без мочевины.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий порошок светло-розового цвета.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среда имеет желтовато-оранжевую окраску, прозрачна, если в пробирках формируется скошенный гель.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор (2,4% вес/об) имеет рН 6,8 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 18-24 ч при 35°С.

Примечание:
«+» — положительная реакция, розово-красный цвет;
«–» — отрицательная реакция, цвет не изменен.

Ссылки:

1. Christensen, W.B., 1946, J. Bact., 52:461.
2. MacFaddin J., 1980, Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2nd ed., Williams and Wilkins, Baltimore.
3. International Organization for Standardization (ISO), 1993, Draft ISO/DIS 6579.
4. Rustigian and Stuart, 1941, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 47:108.

Условия и сроки хранения:

Порошок хранить при температуре ниже +25°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить при температуре +2…8°С.

Основа агара с мочевиной рекомендуется для приготовления среды Кристенсена для определения быстрой уреазной активности уреаз-положительных Proteae. Среда с мочевиной может использоваться для обнаружения гидролиза мочевины некоторыми другими энтеробактериями, но период инкубации намного дольше, 24-48 часов.

Приготовление

Развести 2,4 г в 95 мл дистиллированной воды. Довести до кипения для полного растворения. Стерилизовать автоклавированием при 115 °C в течение 20 минут. Охладите до 50 °C и асептически введите 5 мл стерильного 40% раствора мочевины SR0020. Хорошо перемешайте, разлейте 10 мл в стерильные ёмкости и дайте настояться в наклонном положении.

Методика

Обильно засевайте поверхность склона агара с мочевиной чистой культурой исследуемого организма. При инокулировании уреазо-положительными Proteae реакция обычно завершается через 3-5 часов при 35 °C: продуцирующие уреазу организмы гидролизуют мочевину с образованием аммиака, и среда меняет цвет с оранжевого на розовый. 40% раствор мочевины SR0020 поставляется в виде стерильного раствора в ампулах для удобного приготовления этой среды.

Условия хранения и сроки годности

Сухую среду хранить при температуре 10-30 °C и использовать до истечения срока годности, указанного на этикетке.

Приготовленную среду следует хранить при температуре 2-8 °C.

Внешний вид

Сухая среда: cыпучий порошок соломенного цвета.

Готовая среда: гель оранжевого цвета